專利名稱：人源抗sars冠狀病毒基因工程抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及預(yù)防和治療用人源基因工程抗體的制備及應(yīng)用，尤其是特異性針對(duì)SARS冠狀病毒的具有中和SARS病毒感染功能我國(guó)SARS恢復(fù)期病人來源的中和性抗SARS病毒基因工程抗體。
嚴(yán)重急性呼吸道綜合征(Severe acute respiratory syndrome，SARS)或稱非典型肺炎已嚴(yán)重威脅人民健康和生命安全。從2002年11月起在我國(guó)廣東省流行一種“非典型性肺炎”.在2003年2月底，在香港發(fā)生肺炎流行，多數(shù)是與病人密切接觸者和醫(yī)務(wù)工作者，對(duì)抗菌治療無效.未鑒定出已知的細(xì)菌和病毒病原.因而，此病暫稱為嚴(yán)重急性呼吸道綜合征(severe acute respiratory syndrome，SARS).隨后本病很快就傳播全國(guó)許多城市，并擴(kuò)散到北美，歐洲，和其它亞洲國(guó)家。目前首都北京已受到嚴(yán)重影響。經(jīng)過中國(guó)、美國(guó)、加那大、德國(guó)等13個(gè)國(guó)家科學(xué)家的共同努力，WHO于4月16號(hào)宣布SRAS主要由變異的冠狀病毒引起，并命名為“SARS冠狀病毒”(SARS-CoV)，是全球SARS流行的主要病原。SARS病毒基因組為無節(jié)段的單鏈(+)鏈RNA，30Kb，是最長(zhǎng)的RNA病毒.5’端有甲基化的帽子結(jié)構(gòu)，3’端有聚(A)尾，直接有mRNA的功能，具有感染性?；蚪M主要編碼病毒多聚酶，糖蛋白M和S蛋白，核蛋白N蛋白以及一些非結(jié)構(gòu)蛋白(6.7)。目前對(duì)SARS病毒感染尚無特異性預(yù)防治療藥物或疫苗，快速研制一種可用于緊急預(yù)防SARS病毒感染的工程抗體預(yù)防制劑迫在眉睫，極為重要。
通過抗體分子基因水平的重組可獲得多種多樣的特異性鼠源及人源抗體，使對(duì)單克隆抗體的研究有了突破性進(jìn)展并越來越顯示出其重要意義及實(shí)際運(yùn)用前景80年代末90年代初興起的噬菌體抗體基因庫(kù)技術(shù)興起和整個(gè)基因工程抗體技術(shù)研究領(lǐng)域的發(fā)展，使當(dāng)今世界人源或基因工程抗體的開發(fā)研究取得很大進(jìn)展并已由基礎(chǔ)研究階段步入實(shí)質(zhì)性應(yīng)用研究和開發(fā)階段。含有特異性抗體的人源或動(dòng)物血清免疫球蛋白用以預(yù)防和治療傳染病已歷史悠久。而人源基因工程抗體的發(fā)展，給這一領(lǐng)域的生物制品發(fā)展帶來了新的希望和遠(yuǎn)大前景。單克隆抗體的體外抗病毒中和活性和體內(nèi)保護(hù)肌體抵抗病毒攻擊已獲得許多實(shí)驗(yàn)證明，如鼠抗 甲肝病毒、漢坦病毒、麻疹病毒、RSV病毒、CMV病毒等中和性單克隆抗體可以在體內(nèi)100％保護(hù)動(dòng)物免受病毒攻擊.在SARS治療中，已有用病人恢復(fù)期血清治療獲得良好效果的報(bào)道，我們相信特異性中和抗體對(duì)SARS病毒應(yīng)當(dāng)具有良好的預(yù)防和治療效應(yīng)。
人源抗病毒基因工程抗體，尤其是人源全抗體的研究成功，給各種病毒性傳染病的特異性預(yù)防和治療帶來了新的希望，在抗病毒感染生物藥領(lǐng)域逐漸形成了一類新的抗病毒藥，即所謂的抗體藥(Antibody Drug)。
本發(fā)明的目的是通過基因工程手段和噬菌體表面表達(dá)技術(shù)結(jié)合運(yùn)用，直接從人抗體基因庫(kù)中篩選出抗SARS病毒的基因工程單克隆抗體，獲得其抗體基因，為將來可能的臨床抗病毒預(yù)防和治療提供可行性的特異性抗體藥物。
本發(fā)明陳述的人源抗SARS冠狀病毒基因工程抗體包括1、人源抗SARS病毒基因工程抗體包括26株Fab抗體基因、基因產(chǎn)物及其應(yīng)用，分別命名為SARSFab1，SARSFab61，SARSFab44，SARSFab59，SARSFab32，SARSFab42，SARSFab35，SARSFab6，SARSFab7，SARSFab51，SARSFab54，SARSFab14，SARSFab52，SARSFab15，SARSFab33，SARSFab58，SARSFab5，SARSFab46，SARSFab62，SARSFab63，SARSFab64，SARSFab53，SARSFab13，SARSFab37，SARSFab50，SARSFab20。其主要特征在于這些重組抗體是由存在于抗體輕鏈和重鏈基因可變區(qū)中的高變區(qū)(CDRs)特異性基因序列決定的并在原核細(xì)胞中獲得有效表達(dá)的特異性結(jié)合SARS病毒的功能性抗體。
2、人源抗SARS病毒中和性基因工程抗體，其主要基因特征在于特異性的輕鏈和重鏈可變區(qū)基因來源于對(duì)人源抗SARS病毒抗體基因庫(kù)的特異性富積篩選，該抗體庫(kù)的建立來源我國(guó)多個(gè)SARS恢復(fù)期病人血淋巴細(xì)胞基因。其輕鏈和重鏈可變區(qū)相應(yīng)的三個(gè)CDR區(qū)序列組合極其CDR區(qū)之間框架區(qū)序列組成了每個(gè)抗體可變區(qū)序列特征，分別隸屬于抗體重鏈家族VH1，VH3和VH6，抗體輕鏈家族VK1，VK2和VK3?？贵w蛋白功能由存在于抗體基因輕鏈和重鏈可變區(qū)的決定族互補(bǔ)區(qū)域CDR1、CDR2和CDR3中特異性核苷酸序列極其互補(bǔ)所決定，6個(gè)相應(yīng)的CDR區(qū)氨基酸序列構(gòu)成了抗體的特異性抗原結(jié)合區(qū)域，決定本專利申請(qǐng)中每個(gè)抗體的抗原結(jié)合特征和抗SARS病毒功能特征。決定每株抗體特異性和抗體功能的抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)氨基酸詳細(xì)序列如實(shí)例9中圖4所示。
3、人源抗SARS病毒基因工程抗體SARSFab1，SARSFab6，SARSFab15，SARSFab32，SARSFab58和SARSFab59，其主要功能特征在于特異性識(shí)別SARS病毒顆?？乖?，與SARS病毒具有明顯的免疫熒光反應(yīng)(IFA)和酶聯(lián)免疫(ELISA)反應(yīng)，具有抗SARS病毒感染的中和活性功能。決定每株中和抗體功能的抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)氨基酸詳細(xì)序列如摘要附圖所示。
4、根據(jù)上述權(quán)利要求2，人源抗SARS病毒基因工程抗體基因的用途，其特征在于權(quán)利要求2中所述的每個(gè)抗體可變區(qū)輕重鏈6個(gè)CDR區(qū)氨基酸序列的組合為本抗體專有的抗體序列特征，任何新的工程抗體可變區(qū)基因或相關(guān)產(chǎn)物基因不應(yīng)含有與上述任何一種抗體完全相同的序列特征。
5、根據(jù)上述權(quán)利要求2或權(quán)利要求3，人源抗SARS病毒基因工程抗體基因的用途，其特征在于根據(jù)抗SARS病毒中和抗體SARSFab1，SARSFab6，SARSFab15，SARSFab32，SARSFab58，和SARSFab59可變區(qū)中特異性核苷酸或氨基酸序列，可在體外人工合成與此相同的抗體輕重鏈基因的核苷酸序列或編碼相同氨基酸的核苷酸序列，從而獲得相同的抗體基因或用于相關(guān)基因的改造，而獲得抗SARS病毒中和抗體或相關(guān)蛋白或多肽產(chǎn)物。
6、根據(jù)上述權(quán)利要求和權(quán)利要求5，人源抗SARS病毒基因工程抗體基因的用途，其特征在于基于上述工程抗體基因及其直接或間接的基因產(chǎn)物，可制成噴霧型抗體制劑和注射型抗體制劑用于SARS的預(yù)防和治療。
7、根據(jù)上述權(quán)利要求2或權(quán)利要求3，人源抗SARS病毒基因工程抗體的用途，其特征在于利用上述獲得的人源抗SARS病毒中和性基因工程抗體可變區(qū)基因，F(xiàn)ab抗體基因以及上述每個(gè)抗體基因特征下的全抗體基因，可以在原核細(xì)胞、酵母細(xì)胞、真核細(xì)胞及任何重組系統(tǒng)中表達(dá)和生產(chǎn)此抗體或以此為基礎(chǔ)的改建后的含有此抗體基因任何其他基因，獲得具有中和SARS病毒感染的抗體產(chǎn)物，可在臨床上用于預(yù)防和治療由SARS病毒引起的非典型性肺炎。
以下的優(yōu)先實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說明，但不意味著限制本發(fā)明的內(nèi)容在這些實(shí)施例中，為說明本發(fā)明，采用噬菌體表達(dá)載體為pComb3(Barbas C.III etal，Proc.Natl.Acas.Sci USA 1991，8910164-10168)。所用主要菌株為商品化產(chǎn)品XLI-Blu(美國(guó)Strategene公司)。所用噬菌體為VCSM13(美國(guó)Invitrogene公司)。
實(shí)施例1-5為人源抗戊肝病毒基因工程抗體的篩選制備方法；實(shí)施例6和7為人源抗SARS冠狀病毒基因工程抗體特異性蛋白結(jié)合特征。實(shí)例8和9為人源抗SARS冠狀病毒基因工程抗體的基因特征；實(shí)例10為人源抗SARS冠狀病毒基因工程抗體的中和功能特征。
實(shí)例1，人源抗SARS冠狀病毒基因工程抗體Fab段基因的PCR擴(kuò)增用淋巴細(xì)胞分離液從6個(gè)SARS恢復(fù)病人外周抗凝血中分離淋巴細(xì)胞，用Tril-Zon(美國(guó)Gibco，BRL)提取總細(xì)胞RNA，用Olig-dT引物將提取的RNA通過逆轉(zhuǎn)錄酶(美國(guó)Gibco，BRL)逆轉(zhuǎn)錄成eDNA，用一組IgGFabGamma鏈、Kampa鏈及Lamda鏈引物，對(duì)人源輕鏈和重鏈Fab基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR條件為94℃ 1分鐘，54℃ 1分鐘、72℃ 2分鐘，35個(gè)循環(huán)，上述PCR產(chǎn)物分別經(jīng)瓊脂糖凝膠回收，經(jīng)過DNA純化試劑盒QIAquickTMkit(德國(guó)QIAGEN公司)純化后，獲得650-700bp左右的Kamba、Lamda和Fd鏈PCR產(chǎn)物。
實(shí)例2，人源抗SARS冠狀病毒基因工程抗體噬菌體抗體基因庫(kù)的建立將不同引物合成的Kamba和Lamda鏈PCR產(chǎn)物混合，將不同引物合成的Fd鏈混合，分別用SacI/XbaI和XhoI/SpeI克隆入噬菌體載體pComb3，將克隆入輕，重鏈基因的pComb3載體DNA連接產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀后，用10ul蒸溜水懸起，電轉(zhuǎn)導(dǎo)入事先制備好的200ul電轉(zhuǎn)菌XLI-Blu，(電轉(zhuǎn)條件為Bio-Red電轉(zhuǎn)儀，0.2cm電轉(zhuǎn)杯，2.5K伏)，電轉(zhuǎn)后加10mlSOC培養(yǎng)液，37℃1小時(shí)，加入10ml帶有氨芐青霉素和四環(huán)素的SB培養(yǎng)液(3)，37℃1小時(shí)，加入80-100ml前述SB，37℃2小時(shí)后加入輔助噬菌體M13GCM 1 X10 12，1小時(shí)后加入卡那霉素(70ug/ml)，37℃搖床培養(yǎng)過夜。用4％PEG8000和3％NaCl沉淀噬菌體上清，經(jīng)9000rpm，20分鐘，4℃離心后，用2ml 0.02M PBS PH 7.4重懸沉淀，建立噬菌體抗體庫(kù)，分裝保存于-20℃冰柜中。
實(shí)例3，用于抗體庫(kù)富集篩選的SARS冠狀病毒抗原的制備篩選抗原為超速離心純化的天然SARS病毒純化顆粒，為SARS病毒感染Vero細(xì)胞后收獲的上清，經(jīng)β-丙內(nèi)脂滅活后，PEG沉淀，蔗糖墊層超速離心純化而成。使用時(shí)用pH 8.6碳酸鹽緩沖液稀釋包被96孔酶標(biāo)扳。
實(shí)例4，噬菌體抗體庫(kù)的特異性富集篩選用0.1M NaHCO3(pH8.6)的溶液包被純化的SARS冠狀病毒抗原(1∶10稀釋)，每孔80μl，4℃過夜；次日用1×PBST洗去未吸附的抗原，用4％的脫脂奶37℃封閉1小時(shí)，棄封閉液；每孔加入80μl噬菌體抗體庫(kù)，37℃孵育2小時(shí)，棄去孔中未結(jié)合的噬菌體，用1×TBST(50mM Tris-HCl，150mMNaCl，0.5％Tween 20，pH7.5)洗液沖洗各孔，沖洗時(shí)，用帶有吸頭的移液器反復(fù)吹打，共洗10-20遍，以充分洗去未吸附的噬菌體；最后用ddH20洗兩遍，吸凈孔中的液體；每孔加入50μl Gly-HCl(pH2.2)的洗脫液，室溫孵育10分鐘。加入適量的2M Tris，以中和洗脫下來的噬菌體；將洗脫的噬菌體立即加入2ml新鮮制備的XLI-Blu菌液中(OD600＝1)，室溫孵育15-20分鐘；然后轉(zhuǎn)入250ml三角瓶中，加入SB10ml(氨芐青霉素20μg/ml，四環(huán)素10μg/ml)，立即取10μl涂氨芐青霉素平皿，以滴定噬菌體；三角瓶與37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，加入100mlSB(氨芐青霉素100μg/ml)，37℃1小時(shí)后，加入輔助噬菌體VCSM13 1ml，37℃振蕩培養(yǎng)2小時(shí)，加入卡那霉素(終濃度70μg/ml)，37℃培養(yǎng)過夜。如此反復(fù)篩選4次。
實(shí)例5，人源抗SARS冠狀病毒基因工程Fab抗體可溶性表達(dá)產(chǎn)物的制備將帶有陽(yáng)性抗體輕重鏈基因插入的陽(yáng)性克隆擴(kuò)增后按常規(guī)方法提取質(zhì)粒DNA，用SpeI和NheI切除載體中的gIII，變FdgIII融合蛋白為獨(dú)立表達(dá)的蛋白，連接后轉(zhuǎn)化XL1-Blu菌，從過夜生長(zhǎng)的氨芐碟子中挑取單個(gè)菌落，接種SB或TB細(xì)菌培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)菌長(zhǎng)至OD600＝0.2-0.3，加入1mM IPTG，在30℃誘導(dǎo)表達(dá)10-12小時(shí)。收獲細(xì)菌，離心后加入原培養(yǎng)液1/10體積的PBS(0.02M pH7.4)重懸，反復(fù)凍融三次，4℃12,000rpm離心30分鐘，上清即為表達(dá)的Fab抗體。備用于進(jìn)一步的檢測(cè)和鑒定。陰性對(duì)照為載體pComb3轉(zhuǎn)化菌按同樣方法制備的細(xì)菌裂解液。
實(shí)例6.人源抗SARS冠狀病毒基因工程Fab抗體的檢測(cè)隨機(jī)挑選192個(gè)經(jīng)3次富集篩選后滴定的單菌落，在96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)過夜，次日以1∶50的比例轉(zhuǎn)接另一96孔培養(yǎng)板，37℃培養(yǎng)至OD600＝0.2～0.3時(shí)，加入IPTG(終濃度為1mM)，30℃誘導(dǎo)表達(dá)12-16h。4℃4000r/min離心菌體15min，上清用于Fab表達(dá)和抗原結(jié)合的檢測(cè)。用超速離心純化的天然SARS病毒純化抗原和抗人Fab抗體(美國(guó)sigma公司，1∶1000稀釋使用)包被96孔板，加入待測(cè)樣品上清，用酶標(biāo)抗人Fab二抗(sigma公司，1∶1000稀釋使用)檢測(cè)。結(jié)果顯示共獲得139株人源Fab表達(dá)陽(yáng)性克隆。如

圖1所示，是用抗人Fab抗體包被對(duì)經(jīng)3輪(圖1A)和4輪(圖1B)收獲的共192個(gè)克隆表達(dá)上清中人源Fab抗體的ELISA檢測(cè)。139株人源Fab表達(dá)陽(yáng)性克隆中，有55個(gè)克隆對(duì)SARS病毒特異性結(jié)合，如圖2所示，是用天然SARS病毒純化抗原包被(圖2A)和重組SARS核蛋白抗原包被(圖2B)對(duì)收獲的55個(gè)Fab抗體陽(yáng)性克隆表達(dá)上清中抗SARS病毒特異性抗體的ELISA檢測(cè)，其中9株Fab克隆被確定為抗SARS病毒核蛋白抗體。
實(shí)例7.間接免疫熒光(IFA)試驗(yàn)檢測(cè)用SARS冠狀病毒感染Vero細(xì)胞，37℃培養(yǎng)3天后，滴加至玻璃底片上，丙酮固定15min，加入Fab表達(dá)上清，37℃溫育30min，Tween/PBS沖洗，晾干，加入FITC標(biāo)記的抗人Fab抗體，37℃溫育30min，沖洗，晾干，伊文氏藍(lán)染色后熒光顯微鏡觀察結(jié)果(陰性對(duì)照為陰性血清對(duì)照)。結(jié)果與上述ELISA結(jié)果完全相符，55個(gè)克隆均為免疫熒光反應(yīng)陽(yáng)性。如圖3所示，是為選用的2株單抗(SFab20和SFab 15)與SARS病毒結(jié)合后在共聚焦顯微鏡不同倍數(shù)(20倍和100倍)下顯示的免疫熒光反應(yīng)。說明獲得的人源抗SARS冠狀病毒基因工程抗體對(duì)SAR冠狀病毒結(jié)合具有很高的特異性。
實(shí)例8.人源抗SARS冠狀病毒基因工程抗體的可變區(qū)基因的核苷酸序列分析用Qiagen Miniprep Kit(美國(guó)Qiagen)制備質(zhì)粒DNA進(jìn)行核酸序列分析。測(cè)序?yàn)樽詣?dòng)測(cè)序。至少3個(gè)克隆被用于確定同一相同的序列。用DNASTAR序列分析軟件進(jìn)行分析處理，比較Internet V-Base基因庫(kù)中的IgG序列，上述55株人源抗SARS冠狀病毒基因工程抗體中，有些抗體具有相同的重鏈基因和不同的輕鏈基因，有些抗體則具有相同的輕鏈基因和不同的重鏈基因，共發(fā)現(xiàn)26株帶有不同的抗體輕重鏈可變區(qū)序列極其組合的抗體，其輕重鏈可變區(qū)核苷酸序列整理如下1.輕鏈可變區(qū)核苷酸序列SARSFab1GAGCTCACTCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCACCAGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGTATAATAACTGGCCTCAAACGTTCGGCCAAGGGSARSFab14GAGCTCACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAATCAGAGTGTTAGCAGCAACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCACCAGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGTATAATAACTGGCCTCAGACGTTCGGCCAAGGGSARSFab7GAGCTCACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCACCAGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGTATAATAACTGGCCTCAGACGTTCGGCCAAGGG
SARSFab32GAGCTCACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCACCAGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGTATAATAACTGGCCTCAAACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAASARSFab35GAGCTCACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAACTTAGCCTGGTACCAGCAAAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCACCAGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGTATAATAACTGGCCTCAAACGTTCGGCCAAGGGSARSFab59GAGCTCACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTGTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCACCAGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAAATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGTATAATAACTGGCCTCAAACGTTCGGCCAAGGGSARSFab54GAGCTCACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCACCAGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAAATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGTATAATAACTGGCCTCAAACGTTCGGCCAAGGGSARSFab42GAGCTCACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAACAGCAACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCACCAGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGTATAATAACTGGCCTCAAACGTTCGGCCAAGGGSARSFab61GAGCTCACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCACCAGGGCCACTGGTCTCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGTATAATAACTGGCCTCCGTCTTTCGGCGGAGGGSARSFab6GAGCTCACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCACCAGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGTATAATAACTGGCCTCCGTCTTTCGGCGGAGGGSARSFab51GAGCTCACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCACCAGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGTATAATAACTGGCCTCCGTCTTTCGGCGGAGGG
SARSFab15GAGCTCACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCGACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCACCAGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGTATAATAACTGGCCTCCGGTTTTCGGCGGAGGGSARSFab58GAGCTCACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCGACTTACCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCACCAGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGTATAATAACTGGCCTCCGGTTTTCGGCGGAGGGSARSFab52GAGCTCACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAACTTAGCCTGGTACCAGCAAAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCACCAGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAAATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGTATAATAACTGGCCTAGCACTTTCGGCCCTGGGSARSFab33GAGCTCACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAGGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGCATTGATACCAACTTAGCCTGGTACCAGAAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCACCAGGGCCACTGGTGTCCCAGCCAGATTCAGTGGCGGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTTCTGTCAGCAATATAAACAATGGCCTCTCACTTTCGGGCCTGGGSARSFab37GAGCTCACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCTAAGACTTTTGGCCAGSARSFab50GAGCTCACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCGGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCCACTTTCGGCGGAGGGSARSFab5GAGCTCACCCAGTCTCCATCCTTCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCATCATCACTTGCCGGGCCAGTCAGGGCATTAGCAGTTATTTAGCCTGGTATCAGCAAAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCACTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGCTTAATAGTTACCCGATCACTTTCGGCCCTGGGSARSFab13GAGCTCACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGCAGTGCTTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCCTCCAGTTTGGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTTTAATAGTTACCCTCTCACTTTCGGCGGAGGG
SARSFab53GAGCTCACCCAGTCTCCATCCTTCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCGTCACTTGCCGGGCCAGTCAGGGCATTAACAGTTATTTAGCCTGGTATCAGCAAAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCACTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGCTTAATAGTTACCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGSARSFab62GAGCTCACCCAGTCTCCATCCTTCGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCCAGTCAGGGCATTAGCAGTTATTTGGCCTGGTATCAGCAAAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCCATGCTGCATCCACTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAAATTTTGCAACTTATTACTGTCAACACCTTAATAGTTACCCACTCACTTTCGGCCCTGGGSARSFab64GAGCTCACCCAGTCTCCATCCTTCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCCAGTCAGGGCATTAGCAGTTATTTAGCCTGGTATCAGCAAAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTCTGCATCCACTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAAATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGCTTAATAGTTACCCTATCACCTTCGGCCAAGGGSARSFab46GAGCTCACTCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACACAGTCACCATCACTTGCCGGGCCAGTCAGGGCATTAGCAGTTACTTAGCCTGGTATCAGCAAAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTCTGCTGCATCCACTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTTGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGCTTAAGAGTTACCCGGTCACTTTCGGCGGAGGGSARSFab63GAGCTCACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGCAGGGGACAGAGCCACCATCTCTTGCCGGGCCAGTCAGGGCGTTAGCAGTTATTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAGGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCACTTTGCCAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGCTTAATAGCTGTCCTCTAACTTTCGGCGGAGGGSARSFab20GAGCTCACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCCTCCATAGTAATGGATACAACTATTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAACAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGCTTATTACTGCATGCAAGCTCTACAAACTCCCACCACCTTCGGCCAAGGG2.重鏈可變區(qū)核苷酸序列SARSFab1CTCGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCACATGATGGAAGTAATAAATTCTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACATCCCGGGTATAGTAGTGGCTGGCCCCCGGGCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCSARSFab61CTCGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCACATGATGGAAGTAATAAATTCTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACATCCCGGGTATAGTAGTGGCTGGCCCCCGGGCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACC
SARSFab59CTCGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTAATAAATTCTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACATCCCGGGTATAGTAGTGGCTGGCCCCCGGGCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCSARSFab32CTCGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTAATAAATTCTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACATCCCGGGTATAGTAGTGGCTGGCCCCCGGGCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCSARSFab42CTCGAGCAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTAATAAATTCTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACATCCCGGGTATAGTAGTGGCTGGCCCCCGGGCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCSARSFab35CTCGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCACTTATATCATATGATGGAAGTAATAAATTCTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACATCCCGGGTATAGTAGTGGCTGGCCCCCGGGCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCSARSFab6CTCGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGGAGCAATAAATTCTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATCCGCGGTATAGCAGTGGCTGGCCTCCCCACTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCSARSFab7CTCGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGGAGCAATAAATTCTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATCCGCAGTATAGCAGTGGCTGGCCTCCCCACTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCSARSFab51CTCGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGGAGCAATAAATTCTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATCCGCGGTATAGCAGTGGCTGGCCTCCCCACTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACC
SARSFab54CTCGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATCTCATATGATGGAAGTAATGAATTCTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGGCCCACAAGAGTATAGCAGTGGCTGGCCCCCGTACTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCSARSFab14CTCGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATCTCATATGATGGAAGTAATGAATTCTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGGCCCACAAGAGTATAGCAGTGGCTGGCCCCCGTACTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCSARSFab52CTCGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATCTCATATGATGGAAGTAATGAATTCTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGGCCCACAAGAGTATAGCAGTGGCTGGCCCCCGTACTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCSARSFab15CTCGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTACTAAATTCTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACATGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACCGGGGTATAGCAGCAGCTGGTGGGTATACTACATGGACGTCTGGGGCAAAGGGACCACGGTCACCSARSFab33CTCGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTACTAAATTCTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACATGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGTTGTGTATTACTGTGCGAGACCGGGGTATAGCAGCAGCTGGTGGGTATACTACATGGACGTCTGGGGCAAAGGGACCACGGTCACCSARSFab58CTCGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTACTAAATTCTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACATGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACCGGGGTATAGCAGCAGCTGGTGGGTATACTACATGGACGTCTGGGGCAAAGGGACCACGGTCACCSARSFab5CTCGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATGGTATGAAGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATTTATCCCTTGGAGGGATAGTACCAGGGGTCTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACC
SARSFab46CTCGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATGGTATGAAGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATTTATCCCTTGGAGGGATAGTACCAGGGGTCTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCSARSFab62CTCGAGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAATAATAGATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAAGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGATCTATACGGGTATTGTAGTAGTACCAGCTGCCGGG GGAACTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCSARSFab63CTCGAGCAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCATCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTCATAAATACTACGCAGACTCCGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATAGACAGCCTGAGAGCTGACGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGACACCCTAGGATATTGTAGTAGTACCAGCTGCCACTTCATGGACGTCTGGAGCAAAGGGACCACGGTCACCSARSFab64CTCGAGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTCATAAATACTACGCAGACTCCGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAGGAACACGCTGTATCTGCAAATAGACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGACACCCTAGGATATTGTAGTATTACCATCTGCCACTTCATGGACGTCTGGGGCAAAGGGACCACGGTCACCSARSFab53CTCGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTCATAAATACTACGCAGACTCCGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATAGACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGACACCCTAGGATATTGTAGTAGTACCAGCTGCCACTTCATGGACGTCTGGGGCAAAGGGACCACGGTCACCSARSFab13CTCGAGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGGCTGGGAGGTCCCTGAGAGTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAACTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCTTATGAAGGAAGCATTAAATATTATGCAGACTTCCTGCAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAATACGCTGTATCTGGAAATGAACAGCCTGAGATCTGACGACACGGCTATATATTACTGTGCGAGACCAAACGTATTATTCTGGCTCGGGGAGGGCAAGGGGGTGATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCSARSFab37CTCGAGTCGGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTGCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATAATGATTATGCAGTATCTGTGAAAAGTCGAATAACCATCAACCCAGACACATTCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAGAGGAGGTAAAACGTATTACGATTTTTGGAGTGGTTATTGATGGACCTAGATACCACTACTACATGGACGTCTGGGGCAAAGGGACCACGGTCACC
SARSFab50CTCGAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTGCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATAATGATTATGCAGTATCTGTGAAAAATCGAATAACCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAGAGGAGGTAAAACGTATTACGATTTTTGGAGTGGCTATTGATGGACCTAGATACCACTACTACATGGACGTCTGGGGCAAAGGGACCACGGTCACCSARSFab20CTCGAGCAGTCTGGGGCTGGGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGGTACAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGGGGTTGGAGCAGCTCGGCCGGGGGGTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACC實(shí)例9，人源抗SARS冠狀病毒基因工程抗體的可變區(qū)基因的氨基酸序列分析將所獲的25株人源抗SARS冠狀病毒基因工程抗體核苷酸序列用DNASTAR序列分析軟件進(jìn)行分析處理，獲得由此推導(dǎo)的氨基酸序列分析。比較Internet V-Base基因庫(kù)中的IgG家族序列，其重鏈可變區(qū)主要分類在IgG VH3，VH6和VH1家族。其輕便鏈可變區(qū)主要分類在IgG VH3，VH6和VH1家族。其基因特征由VH和VL結(jié)構(gòu)域中的6個(gè)CDR區(qū)的特異性氨基酸構(gòu)成。圖4為25株人源抗SARS冠狀病毒基因工程抗體的可變區(qū)基因的氨基酸序列極其相互比較。圖中以所列抗體所屬的每個(gè)抗體家族中第一行抗體序列為比較的標(biāo)準(zhǔn)序列，“-”符號(hào)表示與第一行抗體序列相同的氨基酸。陰影部分為抗體輕重鏈可變區(qū)CDR1，CDR2和CDR3區(qū)。
實(shí)例10，人源抗SARS冠狀病毒基因工程抗體的中和功能測(cè)定將實(shí)例9中所述與SARS病毒結(jié)合的25株人源抗SARS冠狀病毒基因工程Fab抗體細(xì)菌裂解上清過濾除菌后，與100TCID50的SARS冠狀病毒100ul以1∶1混合，4℃反應(yīng)過夜，以200ul感染24孔板內(nèi)單層Vero細(xì)胞，陽(yáng)性對(duì)照為SARS病人恢復(fù)期血清，陰性對(duì)照為無關(guān)的人源Fab抗體細(xì)菌裂解上清。在37℃培養(yǎng)4天后，觀察細(xì)胞病變情況。結(jié)果顯示加入Fab抗體SARSFab1，SARSFab6，SARSFab15，SARSFab32，SARSFab58，SARSFab59和SARS病人恢復(fù)期血清的細(xì)胞孔未出現(xiàn)在細(xì)胞病變?nèi)嗽碏ab抗體細(xì)胞孔中，可見細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的病變，在此稀釋度后有病變出現(xiàn)，說明這Fab抗體SARSFab1，SARSFab6，SARSFab15，SARSFab32，SARSFab58，SARSFab59和SARS病人恢復(fù)期血清具有明顯的中和活性，可完全中和含100TCID50的病毒。如說明書附圖5所示，為6株中和性人源抗SARS冠狀病毒基因工程抗體的可變區(qū)基因的氨基酸序列極其相互比較。說明書附圖6是抗SARS冠狀病毒的中和試驗(yàn)結(jié)果。圖6左上為加入非中和抗體SARSFab20的結(jié)果，細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變。圖6右上為加入非中和抗體SARSFab64的結(jié)果，細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變。圖6左下和圖6右下為加入中和抗體SARSFab15和SARSFab58的結(jié)果，細(xì)胞為正常狀態(tài)，未出現(xiàn)病變。
權(quán)利要求
1.人源抗SARS病毒基因工程抗體包括26株Fab抗體基因、基因產(chǎn)物及其應(yīng)用，分別命名為SARSFab1，SARSFab61，SARSFab44，SARSFab59，SARSFab32，SARSFab42，SARSFab35，SARSFab6，SARSFab7，SARSFab51，SARSFab54，SARSFab14，SARSFab52，SARSFab15，SARSFab33，SARSFab58，SARSFab5，SARSFab46，SARSFab62，SARSFab63，SARSFab64，SARSFab53，SARSFab13，SARSFab37，SARSFab50，SARSFab20。其主要特征在于這些重組抗體是由存在于抗體輕鏈和重鏈基因可變區(qū)中的高變區(qū)(CDRs)特異性基因序列決定的并在原核細(xì)胞中獲得有效表達(dá)的特異性結(jié)合SARS病毒的功能性抗體。
2.人源抗SARS病毒中和性基因工程抗體，其主要基因特征在于特異性的輕鏈和重鏈可變區(qū)基因來源于對(duì)人源抗SARS病毒抗體基因庫(kù)的特異性富積篩選，該抗體庫(kù)的建立來源我國(guó)多個(gè)SARS恢復(fù)期病人血淋巴細(xì)胞基因。其輕鏈和重鏈可變區(qū)相應(yīng)的三個(gè)CDR區(qū)序列組合極其CDR區(qū)之間框架區(qū)序列組成了每個(gè)抗體可變區(qū)序列特征，分別隸屬于抗體重鏈家族VH1，VH3和VH6，抗體輕鏈家族VK1，VK2和VK3?？贵w蛋白功能由存在于抗體基因輕鏈和重鏈可變區(qū)的決定族互補(bǔ)區(qū)域CDR1、CDR2和CDR3中特異性核苷酸序列極其互補(bǔ)所決定，6個(gè)相應(yīng)的CDR區(qū)氨基酸序列構(gòu)成了抗體的特異性抗原結(jié)合區(qū)域，決定本專利申請(qǐng)中每個(gè)抗體的抗原結(jié)合特征和抗SARS病毒功能特征。決定每株抗體特異性和抗體功能的抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)氨基酸詳細(xì)序列如實(shí)例9中圖4所示。
3.人源抗SARS病毒基因工程抗體SARSFab1，SARSFab6，SARSFab15，SARSFab32，SARSFab58和SARSFab59，其主要功能特征在于特異性識(shí)別SARS病毒顆粒抗原，與SARS病毒具有明顯的免疫熒光反應(yīng)(IFA)和酶聯(lián)免疫(ELISA)反應(yīng)，具有抗SARS病毒感染的中和活性功能。決定每株中和抗體功能的抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)氨基酸詳細(xì)序列如摘要附圖所示。
4.根據(jù)上述權(quán)利要求2，人源抗SARS病毒基因工程抗體基因的用途，其特征在于權(quán)利要求2中所述的每個(gè)抗體可變區(qū)輕重鏈6個(gè)CDR區(qū)氨基酸序列的組合為本抗體專有的抗體序列特征，任何新的工程抗體可變區(qū)基因或相關(guān)產(chǎn)物基因不應(yīng)含有與上述任何一種抗體完全相同的序列特征。
5.根據(jù)上述權(quán)利要求2或權(quán)利要求3，人源抗SARS病毒基因工程抗體基因的用途，其特征在于抗SARS病毒中和抗體SARSFab1，SARSFab6，SARSFab15，SARSFab32，SARSFab58，和SARSFab59可變區(qū)中特異性核苷酸或氨基酸序列，可在體外人工合成與此相同的抗體輕重鏈基因的核苷酸序列或編碼相同氨基酸的核苷酸序列，從而獲得相同的抗體基因或用于相關(guān)基因的改造，而獲得抗SARS病毒中和抗體或相關(guān)蛋白或多肽產(chǎn)物。
6.根據(jù)上述權(quán)利要求和權(quán)利要求5，人源抗SARS病毒基因工程抗體基因的用途，其特征在于基于上述工程抗體基因及其直接或間接的基因產(chǎn)物，可制成噴霧型抗體制劑和注射型抗體制劑用于SARS的預(yù)防和治療。
7.根據(jù)上述權(quán)利要求2或權(quán)利要求3，人源抗SARS病毒基因工程抗體的用途，其特征在于利用上述獲得的人源抗SARS病毒中和性基因工程抗體可變區(qū)基因，F(xiàn)ab抗體基因以及上述每個(gè)抗體基因特征下的全抗體基因，可以在原核細(xì)胞、酵母細(xì)胞、真核細(xì)胞及任何重組系統(tǒng)中表達(dá)和生產(chǎn)此抗體或以此為基礎(chǔ)的改建后的含有此抗體基因任何其他基因，獲得具有中和SARS病毒感染的抗體產(chǎn)物，可在臨床上用于預(yù)防和治療由SARS病毒引起的非典型性肺炎。
全文摘要
人源抗SARS冠狀病毒基因工程抗體，是指來源于中國(guó)SARS恢復(fù)期病人抗體基因文庫(kù)的特異性結(jié)合SARS冠狀病毒的人源基因工程抗體，包括抗體基因、基因產(chǎn)物及其應(yīng)用。其主要特征在于此重組抗體是由存在于抗體輕鏈和重鏈基因可變區(qū)中的高變區(qū)(CDRs)特異性基因序列決定的并在原核和真核細(xì)胞中獲得有效表達(dá)的特異性結(jié)合SARS病毒結(jié)構(gòu)蛋白的中和性和非中和性的各種功能抗體。其今后的可能用途在于利用此抗體CDR區(qū)或部分或全基因，可在原核、酵母、昆蟲和真核細(xì)胞及任何表達(dá)系統(tǒng)中改造和生產(chǎn)不同形式的基因工程抗體，可在臨床上以噴霧，注射等預(yù)防或治療SARS冠狀病毒相關(guān)疾病。
文檔編號(hào)C12N15/52GK1513874SQ0314999
公開日2004年7月21日 申請(qǐng)日期2003年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月4日
發(fā)明者梁米芳, 李德新, 杜潤(rùn)蕾, 李川, 劉琴芝, 張全福 申請(qǐng)人:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所, 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制