本發(fā)明涉及構(gòu)建轉(zhuǎn)蔗糖合酶基因水稻的方法，屬于轉(zhuǎn)蔗糖合酶水稻的分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用蔗糖合酶(OsSUS3)提高水稻稻瘟病抗性的方法。

背景技術(shù)：

蔗糖合酶(sucrose synthase，EC 2.4.1.13，SUS)是一種糖基轉(zhuǎn)移酶，催化可逆的反應(yīng)：一般認(rèn)為，它在植物體內(nèi)主要起到蔗糖分解的作用[1,2](Tsai et al.,1970；Su and Preiss,1978)。單子葉模式物種水稻的蔗糖合酶基因家族有6個(gè)同源基因，分別命名為OsSUS1-6。當(dāng)植物遭受到脅迫時(shí)，蔗糖(植物體內(nèi)的主要碳源)就會(huì)發(fā)生積累，這種現(xiàn)象是植物適應(yīng)外界環(huán)境的一種反饋調(diào)節(jié)。已有的研究表明蔗糖合酶可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)可溶性糖和滲透壓的方式參與抗逆過(guò)程。低氧、低溫、干旱、高鹽、傷害等都會(huì)誘導(dǎo)蔗糖合酶的表達(dá)上調(diào)[3,4](Klotz and Haagenson 2008；Barrero-Sicilia et al 2011)。以氧脅迫為例，玉米SUS雙基因突變體(sus1/sh1)缺氧處理時(shí)其根尖致死，恢復(fù)供氧時(shí)不能恢復(fù)正常分裂，而野生型根尖恢復(fù)供氧后可繼續(xù)生長(zhǎng)[5](Ricard et al 1998)。同樣，馬鈴薯的SUS突變體經(jīng)過(guò)低氧脅迫又恢復(fù)供氧后，突變體植株恢復(fù)生長(zhǎng)的能力減弱[6](Biemelt et al 1999)。缺氧逆境會(huì)誘導(dǎo)玉米根系中胼胝質(zhì)的產(chǎn)生[7](Subbaiah and Sachs 2001)和小麥根系中和纖維素多糖的增加[8](Albrecht and Mustroph 2003)。Atsus1/Atsus4雙突擬南芥在通風(fēng)良好的條件下可正常生長(zhǎng)，而在缺氧脅迫條件下生長(zhǎng)受抑制[9](Bieniawska et al 2007)。反義抑制黃瓜CsSUS3降低了其抗氧脅迫能力[10](Wang et al 2014)。

此外，蔗糖合酶為胼胝質(zhì)合成提供了底物UDPG，胼胝質(zhì)在病菌侵染的組織部位積累起到機(jī)械屏障作用，將病原體限制在某一個(gè)區(qū)域中來(lái)阻止其向植物組織內(nèi)進(jìn)一步擴(kuò)散；而沉積在篩板孔和胞間連絲上的胼胝質(zhì)可以調(diào)節(jié)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)乃俾?，減少細(xì)胞間信號(hào)和病菌等傳播[11,12](Vatén et al 2011；and 2013)。但迄今為止，尚無(wú)蔗糖合酶對(duì)提高植物稻瘟病抗性的報(bào)道。參考文獻(xiàn)：

1.Tsai CY,Salamini F,Nelson OE.Enzymes of carbohydrate metabolism in the developing endosperm of maize.Plant Physiol,1970,46:299-306.

2.Su JC,Preiss J.Purification and properties of sucrose synthase from maize kernels.Plant Physiol,1978,61:389-393.

3.Klotz KL,Haagenson DM.Wounding,anoxia and cold induce sugarbeet sucrose synthase transcriptional changes that are unrelated to protein expression and activity.J Plant Physiol,2008,165:423-434.

4.Barrero-Sicilia C,Hernando-Amado S,Gonzalez-Melendi P,Carbonero P.Structure,expression profile and subcellular localisation of four different sucrose synthase genes from barley.Planta,2011,234:391-403.

5.Ricard B,VanToai T,Chourey P,Saglio P.Evidence for the critical role of sucrose synthase for anoxic tolerance of maize roots using a double mutant.Plant Physiol,1998,116:1323-1331.

6.Biemelt S,Hajirezaei MR,Melzer M,Albrecht G,Sonnewald U.Sucrose synthase activity does not restrict glycolysis in roots of transgenic potato plants under hypoxic conditions.Planta,1999,210:41-49.

7.Subbaiah CC,Sachs MM.Altered patterns of sucrose synthase phosphorylation and localization precede callose induction and root tip death in anoxic maize seedlings.Plant Physiol,2001,125:585-594.

8.Albrecht G,Mustroph A.Localization of sucrose synthase in wheat roots:increased in situ activity of sucrose synthase correlates with cell wall thickening by cellulose deposition under hypoxia.Planta,2003,217:252-260.

9.Bieniawska Z,Barratt DH,Garlick AP,Thole V,Kruger NJ,Martin C,Zrenner R,Smith AM.Analysis of the sucrose synthase gene family in Arabidopsis.Plant J,2007,49:810-828.

10.Wang HY,Sui XL,Guo JJ,Wang ZY,Cheng JT,Ma S,Li X,Zhang ZX.Antisense suppression of cucumber(Cucumis sativus L.)sucrose synthase 3(CsSUS3)reduces hypoxic stress tolerance.Plant Cell Environ,2014,37:795-810.

11.Vatén A,Dettmer J,Wu S,Stierhof YD,Miyashima S,Yadav SR et al.,Callose biosynthesis regulates symplastic trafficking during root development.Developmental cell,2011,21:1144-1155.

12.B,I.Callose:the plant cell wall polysaccharide with multiple biological functions.Acta physiologiae plantarum,2013,35:635-644.

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)和不足，提供一種利用蔗糖合酶提高水稻稻瘟病抗性的方法，即利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)水稻進(jìn)行遺傳改良，提高稻瘟病抗性，為水稻抗稻瘟病育種做理論以及技術(shù)上的探索。

本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：

一、利用蔗糖合酶提高水稻稻瘟病抗性的方法(簡(jiǎn)稱方法)

本方法包括下列步驟：

①?gòu)乃局锌寺sSUS3基因cDNA

水稻蔗糖合酶3(OsSUS3)基因編碼區(qū)序列如SEQ ID NO：1，cDNA長(zhǎng)度為2643bp；

②構(gòu)建OsSUS3基因在次生細(xì)胞壁合成時(shí)表達(dá)的載體，并轉(zhuǎn)化水稻中花11，獲得轉(zhuǎn)基因植株：轉(zhuǎn)OsSUS3基因水稻種子Sus3(Oryza sativa Sus3)，于2017年1月3日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(地址：中國(guó)武漢武漢大學(xué)郵編：430072)，保藏編號(hào)為CCTCC NO：P201702；

③將獲得的轉(zhuǎn)OsSUS3基因的水稻材料苗期進(jìn)行稻瘟病抗性的測(cè)定。

本發(fā)明具有下列優(yōu)點(diǎn)和積極效果：

1、OsSUS3只在莖稈葉片等次生細(xì)胞壁大量合成的器官中增強(qiáng)表達(dá)，在胚乳中表達(dá)不增加；

2、增加OsSUS3基因在水稻中的表達(dá)量，使轉(zhuǎn)基因水稻稻瘟病(苗期)病斑長(zhǎng)度減少了17％，病斑數(shù)目減少了37％。

附圖說(shuō)明

圖1是轉(zhuǎn)OsSUS3基因水稻的稻瘟病抗性比較圖片。

左2株是對(duì)照；右2株是轉(zhuǎn)OsSUS3水稻。

圖2是稻瘟病病斑數(shù)目測(cè)定數(shù)據(jù)比較圖。

圖3是稻瘟病病斑長(zhǎng)度測(cè)定數(shù)據(jù)比較圖。

圖4是載體構(gòu)建示意圖。

轉(zhuǎn)Ossus3基因水稻種子Sus3(Oryza sativa Sus3)，于2017年1月3日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(地址：中國(guó)武漢武漢大學(xué)郵編：430072)，保藏編號(hào)為CCTCC NO：P201702。

具體實(shí)施方式：

一、實(shí)施例1：AtCESA8啟動(dòng)子和OsSUS3基因cDNA的克隆

從擬南芥中克隆AtCESA8啟動(dòng)子全長(zhǎng)，長(zhǎng)度為949bp。從水稻中克隆OsSUS3基因cDNA，長(zhǎng)度為2643bp，其中CDS為2451bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)回收，酶切，連接載體。

——以擬南芥的基因組DNA為模板，合成引物擴(kuò)增AtCESA8啟動(dòng)子。

F1：CCCAAGCTTCAGAGGAAACTCAGATGTGATGA；

R1：ACGCGTCGACCTTCGAATTCCCCTGTTTGGAGA；

——合成引物擴(kuò)增OsSUS3cDNA

F2：ACGCGTCGACTTTCCTCCTCTTCTCCTTT；

R2：ACTGGCCCTGAAATCAAC

二、實(shí)施例2：表達(dá)載體的構(gòu)建

1、擬南芥AtCESA8啟動(dòng)子超表達(dá)水稻的OsSUS3載體(pC1300T-AtCESA8-OsSUS3)的構(gòu)建(見圖3)：

——將啟動(dòng)子和OsSUS3cDNA序列分別連接T載體后，酶切，轉(zhuǎn)入表達(dá)載體pC1300T。

三、實(shí)施例3：植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

1、農(nóng)桿菌活化

將保存的農(nóng)桿菌(EHA105)在固體LB培養(yǎng)基上畫線(加抗生素：Kan，如果不加抗生素就有可能造成這些菌株的Ti質(zhì)粒丟失，導(dǎo)致農(nóng)桿菌缺乏侵染性)，抗生素濃度為：50μg/mL，28℃培養(yǎng)1-2天，然后轉(zhuǎn)移到新的加有抗生素的固體LB培養(yǎng)基上再培養(yǎng)2天；

2、農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備

將100μL接種于1mLLB液體培養(yǎng)基中，150rpm 28℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；

吸取1mL菌液接種到100mL液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600＝0.5；

將菌液置冰上30min，使培養(yǎng)物冷卻到0℃；

4℃，5000rpm離心30s，棄去上清液；

沉淀用60mL 0.1M CaCl₂懸浮，冰浴30min；

5000rpm離心30s，棄去上清液；

每管用100μL含15％甘油的20mMCaCl₂懸浮，用于轉(zhuǎn)化；

制備好的感受態(tài)細(xì)胞可馬上使用，也可按每管200μL分裝于無(wú)菌離心管中，于4℃保存48小時(shí)內(nèi)使用，長(zhǎng)期貯存時(shí)必須在液氮中速凍后轉(zhuǎn)-80℃保存，使用時(shí)從-80℃取出，置冰上融化后使用；

3、DNA直接轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

200μL農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中加入質(zhì)粒DNA 0.1～1μg(5-10uL)，之后冰浴30min；

放入液氮中7-8min，然后立即放入37℃水浴鍋中水浴5min；

取出離心管，冰上放置2min，加入0.8mLLB，28℃，150rpm振蕩培養(yǎng)3～4hr；

取出菌液于Kan抗生素的LB平板上涂板，在培養(yǎng)箱中28℃條件下倒置培養(yǎng)，2天左右菌落可見；

4、重組農(nóng)桿菌鑒定

挑取單菌落，接種于含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；

小量提取質(zhì)粒DNA，加GTE同時(shí)加5μL溶菌酶(50μg/mL-1，貯藏濃度為50mg/mL或10mg/mL)；

質(zhì)粒酶切或PCR鑒定。

四、實(shí)施例4：水稻成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)、分化、生根及移栽方法

1、愈傷誘導(dǎo)

將成熟的水稻種子去殼，先用無(wú)菌水沖洗3遍，然后用70％的乙醇處理1分鐘，不時(shí)搖動(dòng)；

無(wú)菌水沖洗3遍，每次30秒，不時(shí)搖動(dòng)；

0.1％升汞溶液消毒12分鐘(或2.5％NaClO消毒30min)，不時(shí)搖動(dòng)；

無(wú)菌水沖洗5遍以上，每次30秒，不時(shí)搖動(dòng)；

將種子放在滅菌濾紙上吸干水分，然后放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；

28℃，暗培養(yǎng)4周；

2、愈傷繼代

挑選亮黃色、緊實(shí)且相對(duì)干燥的胚性愈傷(即散落到培養(yǎng)基上的愈傷，不要選從種子上發(fā)出來(lái)的愈傷)，放于繼代培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度28℃；

3、預(yù)培養(yǎng)

挑選緊實(shí)且相對(duì)干燥的胚性愈傷，放于預(yù)培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)4-14天，溫度28℃；

4、愈傷與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)

1)農(nóng)桿菌培養(yǎng)

在帶有對(duì)應(yīng)抗性選擇的LB培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)農(nóng)桿菌兩天，溫度28℃；

將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移至裝有懸浮培養(yǎng)基的帶塞試管或離心管里，重懸農(nóng)桿菌，調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌的懸浮液至OD₆₀₀為0.8-1.0；

2)農(nóng)桿菌侵染

將預(yù)培養(yǎng)的愈傷轉(zhuǎn)移至滅菌好的三角瓶?jī)?nèi)；

將愈傷在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；

轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吹干(30min-1h)；

然后放置在已鋪有一層濾紙的共培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天，溫度19-20℃。

5)選擇培養(yǎng)

將共培養(yǎng)的愈傷轉(zhuǎn)移至滅菌好的三角瓶?jī)?nèi)；

滅菌水洗滌愈傷至看不見農(nóng)桿菌；

浸泡在含400ppm羧芐青霉素的滅菌水中30分鐘；

轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干(1h以上)；

轉(zhuǎn)移愈傷至選擇培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng)2次，每次2周。(第一次羧芐青霉素篩選濃度為400ppm，第二次為250ppm)；

6)分化培養(yǎng)

將抗性愈傷轉(zhuǎn)移至預(yù)分化培養(yǎng)基上黑暗處培養(yǎng)5-7天(可省略)；

轉(zhuǎn)移預(yù)分化培養(yǎng)的愈傷至分化培養(yǎng)基上，光照下培養(yǎng)，溫度26℃；

7)生根培養(yǎng)

剪掉分化時(shí)產(chǎn)生的根(留1-2mm)；

然后將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中光照下培養(yǎng)2周，溫度26℃；

8)移栽

待苗高10-12cm，根系發(fā)生較好，打開瓶蓋，洗掉根上的殘留培養(yǎng)基(注意不要傷根)，移栽花盆中。在最初的幾天，蒙上保鮮膜，保持水分濕潤(rùn)。

五、實(shí)施例5：轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗的鑒定

1、基因插入鑒定

檢測(cè)引物：潮霉素通用引物和基因特異性引物；

2、表達(dá)鑒定

基因特異引物。

六、實(shí)施例6：水稻稻瘟病抗性的測(cè)定

稻瘟菌(菌株R01-1)分生孢子用燕麥培養(yǎng)基放在溫度28℃，12h光照/12h黑暗的光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)10天，然后收集分生孢子，無(wú)菌水重新懸浮孢子，用血小板計(jì)數(shù)器將孢子濃度調(diào)到10⁵個(gè)/mL，對(duì)照用不含孢子的滅菌的蒸餾水，接種前加入0.02％的吐溫溶液進(jìn)行噴霧接種。

取生長(zhǎng)約3周處于三葉一心期水稻幼苗進(jìn)行葉片噴霧接種試驗(yàn)。噴霧接種結(jié)束后，用黑色塑料袋將每盆水稻單獨(dú)密封放入光照培養(yǎng)箱，濕度80％，28℃，暗培養(yǎng)。24h后12h光照/12h黑暗光照培養(yǎng)，用透明保鮮膜將材料封好以便保濕，接種5天后取水稻葉片進(jìn)行拍照，統(tǒng)計(jì)病斑數(shù)目和長(zhǎng)度。

序列表

<110>華中農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>利用蔗糖合酶提高水稻稻瘟病抗性的方法

<140>

<141>

<160>5

<210>1

<211>2643

<212>OsSUS3基因的cDNA(包含CDS2451bp)

<400>

TTTCCTCCTCTTCTCCTTTAGTGCAAGGCTTGAGGATCCATCTAGAAGATAGCAATGGGGGAAACTACT

GGAGAACGTGCCCTGACCCGTCTCCACAGCATGAGGGAGCGCATCGGCGATTCCCTCTCCGCGCACACC

AATGAGCTTGTGGCTGTCTTCTCAAGGCTTGTGAACCAAGGAAAGGGAATGCTACAGCCCCACCAGATC

ATTGCTGAGTACAACGCCGCAATCCCTGAGGGCGAGCGTGAGAAGCTGAAGGACTCTGCCTTAGAGGAT

GTCCTGAGGGGAGCACAGGAGGCGATTGTCATCCCTCCATGGATTGCCCTTGCCATTCGCCCAAGGCCT

GGTGTCTGGGAGTATCTGAGGATCAATGTAAGCCAGCTTGGTGTTGAGGAGCTGAGTGTCCCTGAATAC

TTGCAGTTCAAGGAGCAGCTTGTGGATGGAAGCACCCAGAACAACTTTGTGCTTGAGCTGGACTTTGAG

CCATTCAATGCCTCCTTCCCTCGCCCATCGTTGTCGAAGTCTATTGGCAATGGGGTGCAGTTCTTGAAC

AGGCACCTGTCGTCAAAGCTGTTCCATGACAAAGAGAGCATGTACCCCCTGCTCAACTTTCTTCGTGCG

CACAACTACAAAGGGATGACCATGATGTTGAACGACAGGATTCGCAGTCTCGATGCTCTCCAAGGTGCA

TTGAGGAAGGCAGAAAAACATCTTGCAGGCATTACAGCTGACACCCCATATTCAGAGTTCCATCACAGG

TTCCAAGAGCTTGGTTTGGAGAAGGGTTGGGGTGACTGCGCTCAGCGAGTGCGTGAGACTATTCACCTT

CTCTTGGACCTTCTTGAGGCCCCTGAGCCGTCCGCCTTGGAGAAGTTCCTTGGAACAATCCCAATGGTG

TTCAATGTTGTTATCCTCTCCCCGCATGGTTACTTTGCACAGGCTAATGTCTTGGGGTACCCTGATACC

GGTGGGCAGGTTGTCTACATTTTGGATCAAGTCCGTGCTATGGAGAATGAGATGCTGCTGAGGATCAAG

CAACAAGGTCTAAACATCACACCAAGGATTCTCATTGTGACCAGGTTGCTACCTGATGCGCATGGCACC

ACATGTGGCCAGCGCCTTGAGAAGGTCCTAGGCACTGAGCACACTCATATCCTGCGTGTGCCATTCCGA

ACAGAAAATGGGACTGTTCGCAAATGGATCTCGCGTTTTGAAGTCTGGCCTTACCTGGAAACTTACACC

GATGATGTGGCACACGAGATTTCTGGAGAGCTGCAGGCCACCCCTGACCTGATCATTGGGAACTACAGT

GATGGCAACCTTGTTGCATGTTTGCTGGCACACAAGTTGGGTGTCACTCATTGTACAATCGCCCATGCA

CTTGAGAAAACCAAGTACCCCAACTCCGACCTTTACTGGAAGAAGTTTGAGGATCACTATCACTTCTCC

TGCCAGTTCACAGCTGACCTGATTGCAATGAACCATGCTGACTTCATCATCACAAGTACCTTCCAGGAG

ATTGCTGGAAACAAGGAAACTGTGGGGCAGTATGAGTCTCACATGGCATTCACAATGCCTGGCCTTTAT

CGTGTTGTCCATGGTATCGATGTCTTTGACCCCAAGTTCAACATCGTCTCTCCTGGTGCTGACATGTCC

ATCTACTTCCCATTCACCGAATCACAGAAGAGGCTCACCTCTCTCCATTTAGAGATAGAGGAGCTACTC

TTCAGTGATGTTGAAAACACTGAGCACAAGTTTGTTCTGAAGGACAAGAAGAAGCCAATCATCTTCTCG

ATGGCTAGGCTAGACCATGTCAAGAATTTGACTGGTCTGGTTGAGTTGTATGGTCGGAACCCTCGCCTG

CAAGAGCTAGTAAACCTTGTGGTTGTCTGTGGTGACCATGGCAAGGAATCCAAGGACAAAGAAGAGCAG

GCTGAGTTCAAGAAGATGTTTAATCTGATCGAGCAGTACAATTTGAATGGCCACATCCGCTGGATCTCC

GCTCAGATGAACCGTGTCCGCAATGGTGAGCTCTACCGCTACATCTGCGACATGAGGGGAGCCTTTGTG

CAGCCCGCTCTCTATGAGGCCTTTGGGCTAACTGTGATTGAGGCCATGACCTGTGGTCTTCCAACATTT

GCAACTGCCTATGGTGGTCCAGCCGAGATCATCGTGCACGGCGTGTCTGGCTACCACATTGATCCTTAC

CAGAACGACAAGGCCTCGGCGCTGCTCGTGGAGTTCTTTGAGAAGTGTCAGGAAGACCCAAACCACTGG

ATCAAGATCTCGCAGGGTGGACTTCAGCGCATCGAGGAGAAGTACACATGGAAGCTCTACTCTGAGAGG

CTGATGACTCTCTCCGGTGTCTACGGTTTCTGGAAGTATGTCACCAACCTCGACAGGCGTGAGACACGC

CGCTACCTGGAGATGCTGTACGCCCTCAAGTACCGCAAGATGGCTACCACCGTTCCATTGGCCATTGAG

GGAGAGGCCTCCACCAAATGATCTGGCCTTACCCGGTGAAAAGAATGGGCAATGGGTGCTCCATTGTTG

CAGTGCTGATCCAGGGGTGAAGAAAAACAGAAATCGAGGAACGAATGCATCCATTTAGTTTCTAAGGGT

TTAGTTGATTTCAGGGCCAGT；

<210>2

<211>AtCESA8啟動(dòng)子的正向引物

<212>32

<400>CCCAAGCTTCAGAGGAAACTCAGATGTGATGA；

<210>3

<211>AtCESA8啟動(dòng)子的反向引物

<212>33

<400>ACGCGTCGACCTTCGAATTCCCCTGTTTGGAGA；

<210>4

<211>OsSUS3cDNA的正向引物

<212>29

<400>ACGCGTCGACTTTCCTCCTCTTCTCCTTT；

<210>5

<211>OsSUS3cDNA的反向引物

<212>18

<400>ACTGGCCCTGAAATCAAC。

序列表

<110>華中農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>利用蔗糖合酶提高水稻稻瘟病抗性的方法

<140>

<141>

<160>5

<210>1

<211>2643

<212>OsSUS3基因的cDNA（包含CDS2451bp）

<400>

TTTCCTCCTCTTCTCCTTTAGTGCAAGGCTTGAGGATCCATCTAGAAGATAGCAATGGGGGAAACTACTGGAGAACGTGCCCTGACCCGTCTCCACAGCATGAGGGAGCGCATCGGCGATTCCCTCTCCGCGCACACCAATGAGCTTGTGGCTGTCTTCTCAAGGCTTGTGAACCAAGGAAAGGGAATGCTACAGCCCCACCAGATCATTGCTGAGTACAACGCCGCAATCCCTGAGGGCGAGCGTGAGAAGCTGAAGGACTCTGCCTTAGAGGATGTCCTGAGGGGAGCACAGGAGGCGATTGTCATCCCTCCATGGATTGCCCTTGCCATTCGCCCAAGGCCTGGTGTCTGGGAGTATCTGAGGATCAATGTAAGCCAGCTTGGTGTTGAGGAGCTGAGTGTCCCTGAATACTTGCAGTTCAAGGAGCAGCTTGTGGATGGAAGCACCCAGAACAACTTTGTGCTTGAGCTGGACTTTGAGCCATTCAATGCCTCCTTCCCTCGCCCATCGTTGTCGAAGTCTATTGGCAATGGGGTGCAGTTCTTGAACAGGCACCTGTCGTCAAAGCTGTTCCATGACAAAGAGAGCATGTACCCCCTGCTCAACTTTCTTCGTGCGCACAACTACAAAGGGATGACCATGATGTTGAACGACAGGATTCGCAGTCTCGATGCTCTCCAAGGTGCATTGAGGAAGGCAGAAAAACATCTTGCAGGCATTACAGCTGACACCCCATATTCAGAGTTCCATCACAGGTTCCAAGAGCTTGGTTTGGAGAAGGGTTGGGGTGACTGCGCTCAGCGAGTGCGTGAGACTATTCACCTTCTCTTGGACCTTCTTGAGGCCCCTGAGCCGTCCGCCTTGGAGAAGTTCCTTGGAACAATCCCAATGGTGTTCAATGTTGTTATCCTCTCCCCGCATGGTTACTTTGCACAGGCTAATGTCTTGGGGTACCCTGATACCGGTGGGCAGGTTGTCTACATTTTGGATCAAGTCCGTGCTATGGAGAATGAGATGCTGCTGAGGATCAAGCAACAAGGTCTAAACATCACACCAAGGATTCTCATTGTGACCAGGTTGCTACCTGATGCGCATGGCACCACATGTGGCCAGCGCCTTGAGAAGGTCCTAGGCACTGAGCACACTCATATCCTGCGTGTGCCATTCCGAACAGAAAATGGGACTGTTCGCAAATGGATCTCGCGTTTTGAAGTCTGGCCTTACCTGGAAACTTACACCGATGATGTGGCACACGAGATTTCTGGAGAGCTGCAGGCCACCCCTGACCTGATCATTGGGAACTACAGTGATGGCAACCTTGTTGCATGTTTGCTGGCACACAAGTTGGGTGTCACTCATTGTACAATCGCCCATGCACTTGAGAAAACCAAGTACCCCAACTCCGACCTTTACTGGAAGAAGTTTGAGGATCACTATCACTTCTCCTGCCAGTTCACAGCTGACCTGATTGCAATGAACCATGCTGACTTCATCATCACAAGTACCTTCCAGGAGATTGCTGGAAACAAGGAAACTGTGGGGCAGTATGAGTCTCACATGGCATTCACAATGCCTGGCCTTTATCGTGTTGTCCATGGTATCGATGTCTTTGACCCCAAGTTCAACATCGTCTCTCCTGGTGCTGACATGTCCATCTACTTCCCATTCACCGAATCACAGAAGAGGCTCACCTCTCTCCATTTAGAGATAGAGGAGCTACTCTTCAGTGATGTTGAAAACACTGAGCACAAGTTTGTTCTGAAGGACAAGAAGAAGCCAATCATCTTCTCGATGGCTAGGCTAGACCATGTCAAGAATTTGACTGGTCTGGTTGAGTTGTATGGTCGGAACCCTCGCCTGCAAGAGCTAGTAAACCTTGTGGTTGTCTGTGGTGACCATGGCAAGGAATCCAAGGACAAAGAAGAGCAGGCTGAGTTCAAGAAGATGTTTAATCTGATCGAGCAGTACAATTTGAATGGCCACATCCGCTGGATCTCCGCTCAGATGAACCGTGTCCGCAATGGTGAGCTCTACCGCTACATCTGCGACATGAGGGGAGCCTTTGTGCAGCCCGCTCTCTATGAGGCCTTTGGGCTAACTGTGATTGAGGCCATGACCTGTGGTCTTCCAACATTTGCAACTGCCTATGGTGGTCCAGCCGAGATCATCGTGCACGGCGTGTCTGGCTACCACATTGATCCTTACCAGAACGACAAGGCCTCGGCGCTGCTCGTGGAGTTCTTTGAGAAGTGTCAGGAAGACCCAAACCACTGGATCAAGATCTCGCAGGGTGGACTTCAGCGCATCGAGGAGAAGTACACATGGAAGCTCTACTCTGAGAGGCTGATGACTCTCTCCGGTGTCTACGGTTTCTGGAAGTATGTCACCAACCTCGACAGGCGTGAGACACGCCGCTACCTGGAGATGCTGTACGCCCTCAAGTACCGCAAGATGGCTACCACCGTTCCATTGGCCATTGAGGGAGAGGCCTCCACCAAATGATCTGGCCTTACCCGGTGAAAAGAATGGGCAATGGGTGCTCCATTGTTGCAGTGCTGATCCAGGGGTGAAGAAAAACAGAAATCGAGGAACGAATGCATCCATTTAGTTTCTAAGGGTTTAGTTGATTTCAGGGCCAGT；

<210>2

<211>AtCESA8啟動(dòng)子的正向引物

<212>32

<400> CCCAAGCTTCAGAGGAAACTCAGATGTGATGA；

<210>3

<211>AtCESA8啟動(dòng)子的反向引物

<212>33

<400>ACGCGTCGACCTTCGAATTCCCCTGTTTGGAGA；

<210>4

<211>OsSUS3cDNA的正向引物

<212>29

<400>ACGCGTCGACTTTCCTCCTCTTCTCCTTT；

<210>5

<211>OsSUS3cDNA的反向引物

<212>18

<400>ACTGGCCCTGAAATCAAC。