專(zhuān)利名稱(chēng):耐熱化蔗糖磷酸化酶(sp)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及耐熱蔗糖磷酸化酶和編碼所述耐熱蔗糖磷酸化酶的基因。另外，本發(fā)明還涉及生產(chǎn)所述耐熱蔗糖磷酸化酶的方法。
背景技術(shù)：
蔗糖磷酸化酶(以下也稱(chēng)SP或SP酶)是例如可用于α-葡聚糖合成及葡萄糖-1-磷酸(G-I-P)合成的酶。
α -葡聚糖(尤其是不溶性直鏈淀粉)被認(rèn)為具有與膳食纖維相同的功能，可用于健康食品。另外，線性α-葡聚糖的直鏈淀粉具有這樣的特征，例如能在其分子內(nèi)包含碘、脂肪酸等，因而預(yù)期可用于諸如藥物、化妝品和衛(wèi)生產(chǎn)品的領(lǐng)域。直鏈淀粉也可用作生產(chǎn)具有與直鏈淀粉相似包合能力的環(huán)糊精及環(huán)鏈淀粉(cycloamylose)的原料。而且，含直鏈淀粉的膜的抗張強(qiáng)度與通用塑料相當(dāng)，有良好的前景用作生物可降解塑料的原材料。因此，預(yù)期直鏈淀粉可在各種應(yīng)用中使用。但是，很難獲得足夠純的直鏈淀粉，這種淀粉也非常昂貴，因而僅在試劑水平分銷(xiāo)，而很少用作工業(yè)原材料。因此，需要一種穩(wěn)定而便宜地生產(chǎn)直鏈淀粉的方法。
例如G-I-P可用作醫(yī)療抗菌劑、抗腫瘤劑(以鉬絡(luò)合物形式)、治療心臟病的藥物(以胺鹽形式)及α-葡聚糖合成的底物。
據(jù)報(bào)道，一些細(xì)菌(鏈球菌屬細(xì)菌、明串珠菌屬微生物、大腸桿菌、乳酸菌(lacticacid bacteria)等)中存在SP，這些細(xì)菌中所發(fā)現(xiàn)的SP的氨基酸序列和堿基序列是已知的。
α -葡聚糖或G-I-P生產(chǎn)中可使用各種SP，經(jīng)常使用來(lái)自明串珠菌屬細(xì)菌的SP。這是因?yàn)槿菀撰@得較大量的酶。
α-葡聚糖的工業(yè)生產(chǎn)中，需要基本上除去其他污染酶的活性，尤其是磷酸酶活性和淀粉酶活性。這是因?yàn)槿绻褂肧P和GP合成α-葡聚糖的過(guò)程中有磷酸酶，生成的反應(yīng)中間體G-I-P會(huì)降解，使α-葡聚糖收率降低。如果存在淀粉酶，所合成的α-葡聚糖會(huì)發(fā)生降解使其分子量變小。因此，必須去除這些污染酶。大量生產(chǎn)SP時(shí)，大腸桿菌和枯草桿菌是表達(dá)SP基因的理想宿主。但是，如圖2和圖3所示，大腸桿菌具有淀粉酶活性和磷酸酶活性，而枯草桿菌具有淀粉酶活性。如圖2和圖3所示，這些宿主具有的酶不能被55°C熱處理滅活，但幾乎能被60°C熱處理完全滅活。因此，希望得到即使在60°C熱處理后也不喪失活性的耐熱SP，或是耐熱性比淀粉酶或磷酸酶更強(qiáng)的SP。
作為參考，下列表1給出了熱處理前后不同細(xì)菌(大腸桿菌TG-1、大腸桿菌BL21及枯草桿菌ANA-I)細(xì)胞提取物中淀粉酶活性和磷酸酶活性的具體數(shù)值。
表 1
8
權(quán)利要求
1.耐熱化蔗糖磷酸化酶，其通過(guò)修飾天然蔗糖磷酸化酶獲得，其中所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在選自下組的至少一個(gè)位置上具有與天然蔗糖磷酸化酶的氨基酸殘基不同的氨基酸殘基與基序序列 1 :AVGGVHLLPFFPSTGDRGFAPIDYHEVDSAFGDWDDVKRLGEKYYLMFDFMINHIS 中第14位對(duì)應(yīng)的位置、第四位對(duì)應(yīng)的位置和第44位對(duì)應(yīng)的位置；與基序序列 2 :RPTQEDVDLIYKRKDRAPKQEIQFADGSVEHLWNTFGEEQID 中第 7 位對(duì)應(yīng)的位置、第19位對(duì)應(yīng)的位置、第23位對(duì)應(yīng)的位置和第34位對(duì)應(yīng)的位置；以及與基序序列 3 ILPEIHEHYTIQFKIADHDYYVYDFALPMVTLYSLYSG 中第 19 位對(duì)應(yīng)的位置；其中(1-1)所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在與基序序列1中第14位對(duì)應(yīng)的位置具有氨基酸殘基絲氨酸或異亮氨酸；或(1-2)所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在與基序序列1中第四位對(duì)應(yīng)的位置具有氨基酸殘基脯氨酸、丙氨酸或賴(lài)氨酸；或(1-3)所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在與基序序列1中第44位對(duì)應(yīng)的位置具有氨基酸殘基組氨酸或精氨酸；或(2-1)所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在與基序序列2中第7位對(duì)應(yīng)的位置具有氨基酸殘基亮氨酸或異亮氨酸；或(2-2)所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在與基序序列2中第19位對(duì)應(yīng)的位置具有氨基酸殘基甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、纈氨酸或酪氨酸；或(2-3)所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在與基序序列2中第23位對(duì)應(yīng)的位置具有氨基酸殘基精氨酸、組氨酸、異亮氨酸、賴(lài)氨酸或纈氨酸；或(2-4)所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在與基序序列2中第34位對(duì)應(yīng)的位置具有氨基酸殘基絲氨酸；或(3-1)所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在與基序序列3中第19位對(duì)應(yīng)的位置具有氨基酸殘基甘氨酸、半胱氨酸、組氨酸、賴(lài)氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸或絲氨酸；并且其中所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在pH7. 0、20mM Tris緩沖液中于55°C加熱20分鐘后，所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在37°C的酶活性為加熱之前所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在37°C酶活性的20%或更多；并且其中所述天然蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列由一種核酸分子編碼，該核酸分子在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與由編碼選自下組的氨基酸序列的堿基序列組成的核酸分子雜交SEQ ID NO :2, SEQIDNO :4,SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :10,SEQ ID NO :12,SEQ ID NO : 14、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO :18 禾口 SEQ ID NO :20。
2.權(quán)利要求
1所述的耐熱化蔗糖磷酸化酶，其中所述天然蔗糖磷酸化酶來(lái)源于變異鏈球菌、肺炎鏈球菌、表兄鏈球菌或緩癥鏈球菌。
3.權(quán)利要求
1所述的耐熱化蔗糖磷酸化酶，其中所述天然蔗糖磷酸化酶來(lái)源于變異鏈球菌或腸膜明串珠菌。
4.權(quán)利要求
1所述的耐熱化蔗糖磷酸化酶，其中在與基序序列1中第14位對(duì)應(yīng)的位置上，所述耐熱化蔗糖磷酸化酶具有氨基酸殘基絲氨酸或異亮氨酸。
5.權(quán)利要求
1所述的耐熱化蔗糖磷酸化酶，其中在與基序序列1中第四位對(duì)應(yīng)的位置上，所述耐熱化蔗糖磷酸化酶具有氨基酸殘基脯氨酸、丙氨酸或賴(lài)氨酸。
6.權(quán)利要求
1所述的耐熱化蔗糖磷酸化酶，其中在與基序序列1中第四位對(duì)應(yīng)的位置上，所述耐熱化蔗糖磷酸化酶具有氨基酸殘基脯氨酸。
7.權(quán)利要求
1所述的耐熱化蔗糖磷酸化酶，其中在與基序序列1中第44位對(duì)應(yīng)的位置上，所述耐熱化蔗糖磷酸化酶具有氨基酸殘基組氨酸或精氨酸。
8.權(quán)利要求
1所述的耐熱化蔗糖磷酸化酶，其中在與基序序列1中第44位對(duì)應(yīng)的位置上，所述耐熱化蔗糖磷酸化酶具有氨基酸殘基精氨酸。
9.權(quán)利要求
1所述的耐熱化蔗糖磷酸化酶，其中在與基序序列2中第7位對(duì)應(yīng)的位置上，所述耐熱化蔗糖磷酸化酶具有氨基酸殘基亮氨酸或異亮氨酸。
10.權(quán)利要求
1所述的耐熱化蔗糖磷酸化酶，其中在與基序序列2中第19位對(duì)應(yīng)的位置上，所述耐熱化蔗糖磷酸化酶具有氨基酸殘基甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、纈氨酸或酪氨酸。
11.權(quán)利要求
1所述的耐熱化蔗糖磷酸化酶，其中在與基序序列2中第19位對(duì)應(yīng)的位置上，所述耐熱化蔗糖磷酸化酶具有氨基酸殘基纈氨酸或酪氨酸。
12.權(quán)利要求
1所述的耐熱化蔗糖磷酸化酶，其中在與基序序列2中第23位對(duì)應(yīng)的位置上，所述耐熱化蔗糖磷酸化酶具有氨基酸殘基精氨酸、組氨酸、異亮氨酸、賴(lài)氨酸或纈氨酸。
13.權(quán)利要求
1所述的耐熱化蔗糖磷酸化酶，其中在與基序序列2中第23位對(duì)應(yīng)的位置上，所述耐熱化蔗糖磷酸化酶具有氨基酸殘基組氨酸。
14.權(quán)利要求
1所述的耐熱化蔗糖磷酸化酶，其中在與基序序列2中第34位對(duì)應(yīng)的位置上，所述耐熱化蔗糖磷酸化酶具有氨基酸殘基絲氨酸。
15.權(quán)利要求
1所述的耐熱化蔗糖磷酸化酶，其中在與基序序列3中第19位對(duì)應(yīng)的位置上，所述耐熱化蔗糖磷酸化酶具有氨基酸殘基甘氨酸、半胱氨酸、組氨酸、賴(lài)氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸或絲氨酸。
16.權(quán)利要求
1所述的耐熱化蔗糖磷酸化酶，其中在與基序序列3中第19位對(duì)應(yīng)的位置上，所述耐熱化蔗糖磷酸化酶具有氨基酸殘基甘氨酸。
17.權(quán)利要求
1所述的耐熱化蔗糖磷酸化酶，其中所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在pH7.0、20mM Tris緩沖液中于57°C加熱20分鐘后，所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在37°C的酶活性為加熱之前所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在37°C酶活性的10%或更多。
18.權(quán)利要求
1所述的耐熱化蔗糖磷酸化酶，其中所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在pH7.0、20mM Tris緩沖液中于57°C加熱20分鐘后，所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在37°C的酶活性為加熱之前所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在37 °C酶活性的20%或更多。
19.權(quán)利要求
1所述的耐熱化蔗糖磷酸化酶，其中所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在含20%蔗糖的pH7. 0、20mM Tris緩沖液中于65°C加熱20分鐘后，所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在37°C的酶活性為加熱之前所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在37°C酶活性的10%或更多。
20.權(quán)利要求
1所述的耐熱化蔗糖磷酸化酶，其中所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在含20%蔗糖的pH7. 0、20mM Tris緩沖液中于65°C加熱20分鐘后，所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在37°C的酶活性為加熱之前所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在37°C酶活性的20%或更多。
21.權(quán)利要求
1所述的耐熱化蔗糖磷酸化酶，其中所述耐熱化蔗糖磷酸化酶至少在與基序序列1中第14位對(duì)應(yīng)的位置上具有與天然蔗糖磷酸化酶不同的氨基酸殘基。
22.權(quán)利要求
1所述的耐熱化蔗糖磷酸化酶，其中所述耐熱化蔗糖磷酸化酶至少在與基序序列3中第19位對(duì)應(yīng)的位置上具有與天然蔗糖磷酸化酶不同的氨基酸殘基。
23.生產(chǎn)耐熱化蔗糖磷酸化酶的方法，該方法包括修飾含有編碼第一蔗糖磷酸化酶的堿基序列的第一核酸分子，從而獲得含修飾堿基序列的第二核酸分子；制備含第二核酸分子的表達(dá)載體；將該表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞中以表達(dá)耐熱化蔗糖磷酸化酶；和回收所表達(dá)的耐熱化蔗糖磷酸化酶，其中所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在選自下組的至少一個(gè)位置具有與第一蔗糖磷酸化酶氨基酸殘基不同的氨基酸殘基與基序序列 1 :AVGGVHLLPFFPSTGDRGFAPIDYHEVDSAFGDWDDVKRLGEKYYLMFDFMINHIS 中第14位對(duì)應(yīng)的位置、第四位對(duì)應(yīng)的位置和第44位對(duì)應(yīng)的位置；與基序序列 2 :RPTQEDVDLIYKRKDRAPKQEIQFADGSVEHLWNTFGEEQID 中第 7 位對(duì)應(yīng)的位置、第19位對(duì)應(yīng)的位置、第23位對(duì)應(yīng)的位置和第34位對(duì)應(yīng)的位置；以及與基序序列 3 ILPEIHEHYTIQFKIADHDYYVYDFALPMVTLYSLYSG 中第 19 位對(duì)應(yīng)的位置；其中(1-1)所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在與基序序列1中第14位對(duì)應(yīng)的位置具有氨基酸殘基絲氨酸或異亮氨酸；或(1-2)所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在與基序序列1中第四位對(duì)應(yīng)的位置具有氨基酸殘基脯氨酸、丙氨酸或賴(lài)氨酸；或(1-3)所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在與基序序列1中第44位對(duì)應(yīng)的位置具有氨基酸殘基組氨酸或精氨酸；或(2-1)所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在與基序序列2中第7位對(duì)應(yīng)的位置具有氨基酸殘基亮氨酸或異亮氨酸；或(2-2)所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在與基序序列2中第19位對(duì)應(yīng)的位置具有氨基酸殘基甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、纈氨酸或酪氨酸；或(2-3)所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在與基序序列2中第23位對(duì)應(yīng)的位置具有氨基酸殘基精氨酸、組氨酸、異亮氨酸、賴(lài)氨酸或纈氨酸；或(2-4)所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在與基序序列2中第34位對(duì)應(yīng)的位置具有氨基酸殘基絲氨酸；或(3-1)所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在與基序序列3中第19位對(duì)應(yīng)的位置具有氨基酸殘基甘氨酸、半胱氨酸、組氨酸、賴(lài)氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸或絲氨酸；并且其中所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在pH7. 0、20mM Tris緩沖液中于55°C加熱20分鐘后，所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在37°C的酶活性為加熱之前所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在37°C酶活性的20%或更多；并且其中所述第一蔗糖磷酸化酶是天然蔗糖磷酸化酶；并且其中所述天然蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列由一種核酸分子編碼，該核酸分子在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與由編碼選自下組的氨基酸序列的堿基序列組成的核酸分子雜交SEQ ID NO :2, SEQIDNO :4,SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :12,SEQ ID NO :14,SEQ IDNO :16, SEQ ID NO :18 禾口 SEQ ID NO :20。
24.權(quán)利要求
23所述的方法，其中所述第一蔗糖磷酸化酶來(lái)源于變異鏈球菌、肺炎鏈球菌、表兄鏈球菌或緩癥鏈球菌。
25.權(quán)利要求
23所述的方法，其中所述第一蔗糖磷酸化酶來(lái)源于變異鏈球菌或腸膜明串珠菌。
26.權(quán)利要求
23所述的方法，其中所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在pH7.0、20mMTris緩沖液中于57°C加熱20分鐘后，所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在37°C的酶活性為加熱之前所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在37°C酶活性的10%或更多。
27.權(quán)利要求
23所述的方法，其中所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在pH7.0、20mMTris緩沖液中于57°C加熱20分鐘后，所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在37°C的酶活性為加熱之前所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在37 °C酶活性的20%或更多。
28.權(quán)利要求
23所述的方法，其中所述耐熱化蔗糖磷酸化酶至少在與基序序列1中第14位對(duì)應(yīng)的位置上具有與第一蔗糖磷酸化酶不同的氨基酸殘基。
29.權(quán)利要求
23所述的方法，其中所述耐熱化蔗糖磷酸化酶至少在與基序序列3中第19位對(duì)應(yīng)的位置上具有與第一蔗糖磷酸化酶不同的氨基酸殘基。
30.核酸分子，包含編碼權(quán)利要求
1所述耐熱化蔗糖磷酸化酶的堿基序列。
31.包含權(quán)利要求
30所述核酸分子的載體。
32.包含權(quán)利要求
30所述核酸分子的細(xì)胞。
33.合成葡萄糖-1-磷酸的方法，該方法包括使含權(quán)利要求
1所述的耐熱化蔗糖磷酸化酶、蔗糖和無(wú)機(jī)磷酸的反應(yīng)液反應(yīng)而生成葡萄糖-ι-磷酸。
34.權(quán)利要求
33所述的方法，其中所述反應(yīng)在50°C 70°C的溫度下進(jìn)行。
35.合成葡萄糖聚合物的方法，該方法使含下列物質(zhì)的反應(yīng)液反應(yīng)生成葡萄糖聚合物權(quán)利要求
1所述的耐熱化蔗糖磷酸化酶；以α -葡萄糖-1-磷酸為底物的第二種磷酸化酶；蔗糖；引發(fā)劑；以及無(wú)機(jī)磷酸或葡萄糖-ι-磷酸。
36.權(quán)利要求
35所述的方法，其中所述葡萄糖聚合物是α-葡聚糖。
37.權(quán)利要求
35所述的方法，其中所述第二種磷酸化酶是α-葡聚糖磷酸化酶。
38.權(quán)利要求
35所述的方法，其中所述第二種磷酸化酶選自纖維二糖磷酸化酶、纖維糊精磷酸化酶、昆布二糖磷酸化酶、昆布糊精磷酸化酶、β -1，3-葡聚糖磷酸化酶和海藻糖磷酸化酶。
39.權(quán)利要求
35所述的方法，其中所述反應(yīng)在50°C 70°C的溫度下進(jìn)行。
40.通過(guò)修飾天然蔗糖磷酸化酶得到的耐熱化蔗糖磷酸化酶，其中所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在選自下組的至少一個(gè)位置具有與天然蔗糖磷酸化酶不同的氨基酸殘基與SEQ ID NO :2氨基酸序列中第47位蘇氨酸(T47)對(duì)應(yīng)的位置、第62位絲氨酸(S62)對(duì)應(yīng)的位置、第77位酪氨酸(Y77)對(duì)應(yīng)的位置、第1 位纈氨酸(V128)對(duì)應(yīng)的位置、第140位賴(lài)氨酸(K140)對(duì)應(yīng)的位置、第144位谷氨酰胺^!144)對(duì)應(yīng)的位置、第155位天冬酰胺(N155)對(duì)應(yīng)的位置和第249位天冬氨酸(DM9)對(duì)應(yīng)的位置；其中(1-1)所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在與SEQ ID NO :2氨基酸序列中第47位蘇氨酸對(duì)應(yīng)的位置具有氨基酸殘基絲氨酸或異亮氨酸；或(1-2)所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在與SEQ ID NO :2氨基酸序列中第62位絲氨酸對(duì)應(yīng)的位置具有氨基酸殘基脯氨酸、丙氨酸或賴(lài)氨酸；或(1-3)所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在與SEQ ID NO :2氨基酸序列中第77位酪氨酸對(duì)應(yīng)的位置具有氨基酸殘基組氨酸或精氨酸；或(2-1)所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在與SEQ ID NO :2氨基酸序列中第1 位纈氨酸對(duì)應(yīng)的位置具有氨基酸殘基亮氨酸或異亮氨酸；或(2-2)所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在與SEQ ID NO :2氨基酸序列中第140位賴(lài)氨酸對(duì)應(yīng)的位置具有氨基酸殘基甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、纈氨酸或酪氨酸；或(2-3)所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在與SEQ ID NO :2氨基酸序列中第144位谷氨酰胺對(duì)應(yīng)的位置具有氨基酸殘基精氨酸、組氨酸、異亮氨酸、賴(lài)氨酸或纈氨酸；或(2-4)所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在與SEQ ID NO 2氨基酸序列中第155位天冬酰胺對(duì)應(yīng)的位置具有氨基酸殘基絲氨酸；或(3-1)所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在與SEQ ID NO :2氨基酸序列中第249位天冬氨酸對(duì)應(yīng)的位置具有氨基酸殘基甘氨酸、半胱氨酸、組氨酸、賴(lài)氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸或絲氨酸；并且其中所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在pH7. 0、20mM Tris緩沖液中于55°C加熱20分鐘后，所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在37°C的酶活性為加熱之前所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在37°C酶活性的20%或更多；其中所述天然蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列由一種核酸分子編碼，該核酸分子在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與由編碼選自下組的氨基酸序列的堿基序列組成的核酸分子雜交SEQ ID NO :2, SEQIDNO :4,SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :10,SEQ ID NO :12,SEQ ID NO : 14、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO :18 禾口 SEQ ID NO :20。
41.生產(chǎn)耐熱化蔗糖磷酸化酶的方法，該方法包括下列步驟修飾含有編碼第一蔗糖磷酸化酶的堿基序列的第一核酸分子，從而獲得含修飾堿基序列的第二核酸分子；制備含第二核酸分子的表達(dá)載體；將該表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞中以表達(dá)耐熱化蔗糖磷酸化酶；和回收所表達(dá)的耐熱化蔗糖磷酸化酶，其中所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在選自下組的至少一個(gè)位置具有與第一蔗糖磷酸化酶氨基酸殘基不同的氨基酸殘基與SEQ ID NO :2氨基酸序列中第47位蘇氨酸(T47)對(duì)應(yīng)的位置、第62位絲氨酸(S62)對(duì)應(yīng)的位置、第77位酪氨酸(Y77)對(duì)應(yīng)的位置、第1 位纈氨酸(V128)對(duì)應(yīng)的位置、第140位賴(lài)氨酸(K140)對(duì)應(yīng)的位置、第144位谷氨酰胺^!144)對(duì)應(yīng)的位置、第155位天冬酰胺(N155)對(duì)應(yīng)的位置和第249位天冬氨酸(DM9)對(duì)應(yīng)的位置；其中(1-1)所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在與SEQ ID NO :2氨基酸序列中第47位蘇氨酸對(duì)應(yīng)的位置具有氨基酸殘基絲氨酸或異亮氨酸；或(1-2)所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在與SEQ ID NO :2氨基酸序列中第62位絲氨酸對(duì)應(yīng)的位置具有氨基酸殘基脯氨酸、丙氨酸或賴(lài)氨酸；或(1-3)所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在與SEQ ID NO :2氨基酸序列中第77位酪氨酸對(duì)應(yīng)的位置具有氨基酸殘基組氨酸或精氨酸；或(2-1)所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在與SEQ ID NO :2氨基酸序列中第1 位纈氨酸對(duì)應(yīng)的位置具有氨基酸殘基亮氨酸或異亮氨酸；或(2-2)所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在與SEQ ID NO :2氨基酸序列中第140位賴(lài)氨酸對(duì)應(yīng)的位置具有氨基酸殘基甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、纈氨酸或酪氨酸；或(2-3)所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在與SEQ ID NO :2氨基酸序列中第144位谷氨酰胺對(duì)應(yīng)的位置具有氨基酸殘基精氨酸、組氨酸、異亮氨酸、賴(lài)氨酸或纈氨酸；或(2-4)所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在與SEQ ID NO :2氨基酸序列中第155位天冬酰胺對(duì)應(yīng)的位置具有氨基酸殘基絲氨酸；或(3-1)所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在與SEQ ID NO :2氨基酸序列中第249位天冬氨酸對(duì)應(yīng)的位置具有氨基酸殘基甘氨酸、半胱氨酸、組氨酸、賴(lài)氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸或絲氨酸；并且其中所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在pH7. 0、20mM Tris緩沖液中于55°C加熱20分鐘后，所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在37°C的酶活性為加熱之前所述耐熱化蔗糖磷酸化酶在37°C酶活性的20%或更多；其中所述第一蔗糖磷酸化酶是天然蔗糖磷酸化酶；并且其中所述天然蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列由一種核酸分子編碼，該核酸分子在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與由編碼選自下組的氨基酸序列的堿基序列組成的核酸分子雜交SEQ ID NO :2, SEQIDNO :4,SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :10,SEQ ID NO :12,SEQ ID NO : 14、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO :18 禾口 SEQ ID NO :20。
42.合成葡萄糖-1-磷酸的方法，該方法包括使含權(quán)利要求
40所述耐熱化蔗糖磷酸化酶、蔗糖和無(wú)機(jī)磷酸的反應(yīng)液反應(yīng)以生成葡萄糖-ι-磷酸。
43.合成葡萄糖聚合物的方法，包括使含下列物質(zhì)的反應(yīng)液反應(yīng)以生成葡萄糖聚合物權(quán)利要求
40所述耐熱化蔗糖磷酸化酶；以α -葡萄糖-1-磷酸為底物的第二種磷酸化酶；蔗糖；引發(fā)劑；以及無(wú)機(jī)磷酸或葡萄糖-ι-磷酸。
專(zhuān)利摘要
提供通過(guò)修飾天然SP獲得的耐熱蔗糖磷酸化酶和制備所述耐熱化SP的方法。與天然蔗糖磷酸化酶相比，所述耐熱SP在下列位置中至少一個(gè)位置的氨基酸殘基不同分別對(duì)應(yīng)于基序序列1的第14位、第29位和第44位的位置、對(duì)應(yīng)基序序列2的第7位、第19位、第23位和第34位的位置以及對(duì)應(yīng)基序序列3的第19位的位置；并且在20mM Tris緩沖液(pH7.0)中于55℃加熱20分鐘以后，所述耐熱SP在37℃的酶活性是未加熱耐熱SP在37℃的酶活性的20％或更多。
文檔編號(hào)C12P19/04GKCN1845990 B發(fā)布類(lèi)型授權(quán) 專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朇N 200480025320
公開(kāi)日2012年3月21日 申請(qǐng)日期2004年8月31日
發(fā)明者柳瀨美千代, 栗木隆, 藤井和俊, 飯干雅惠, 高田洋樹(shù), 鷹羽武史 申請(qǐng)人:江崎格力高株式會(huì)社導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專(zhuān)利引用 (1), 非專(zhuān)利引用 (1),