專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種橡膠樹(shù)蔗糖轉(zhuǎn)化酶及其編碼基因的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種橡膠樹(shù)蔗糖轉(zhuǎn)化酶及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：蔗糖轉(zhuǎn)化酶(β-D-呋喃果糖苷酶)催化蔗糖不可逆地降解為葡萄糖和果糖。在高等植物中，蔗糖轉(zhuǎn)化酶是一個(gè)中等大小的基因家族，包含十幾個(gè)到二十幾個(gè)基因。根據(jù)亞細(xì)胞定位不同，蔗糖轉(zhuǎn)化酶分為細(xì)胞壁、液泡和胞質(zhì)三類(lèi)。根據(jù)最適酶活PH值的不同，又可將蔗糖轉(zhuǎn)化酶分為酸性和中性/堿性兩類(lèi)，其中細(xì)胞壁和液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶屬于酸性轉(zhuǎn)化酶(Ac-Inv)，最適酶活ρΗ值為4.55.0，胞質(zhì)蔗糖轉(zhuǎn)化酶的最適酶活ρΗ值為7.08.0，屬于中性/堿性蔗糖轉(zhuǎn)化酶(Ν/Α-Ιην)。許多研究證實(shí)，植物蔗糖轉(zhuǎn)化酶廣泛參與韌皮部裝載和卸載、生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)、生物和非生物脅迫應(yīng)答，并且在光合產(chǎn)物同化碳分配中起核心調(diào)控作用，是決定作物經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量的關(guān)鍵酶。早期蔗糖轉(zhuǎn)化酶的研究集中在Ac-Inv上，而對(duì)Ν/Α-Ιην的研究較少。近幾年，有關(guān)Ν/Α-Ιην的研究不斷增多，許多研究證實(shí)這類(lèi)轉(zhuǎn)化酶在一些大量需求單糖或己糖的生物過(guò)程，如產(chǎn)能和生物合成中發(fā)揮重要作用。Wang等人(2000)指出，在缺水條件下Ν/Α-Ιην可能參與控制甘薯細(xì)胞中的碳水化合物分配和能量產(chǎn)生(WangHL，LeePD,ChenWL，HuangDJ,SuJC.2000.Osmoticstress-inducedchangesofsucrosemetabolisminculturedsweetpotatocells.JExpBot51:1991-1999)；Fernandes等人(2004)發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫條件下，白花羽扇豆的Ν/Α-Ιην酶活性和葡萄糖消耗同時(shí)增加了，推測(cè)這樣可保障ATP和NAD(P)H的持續(xù)供給，是避免或修復(fù)鹽漬傷害所必需的(FernandesFM,ArrabacaMC,CarbalhoLMM.2004.SucrosemetabolisminLupinusalbusL.undersaltstress.BiolPlant48:317_319)；在桃樹(shù)中，推測(cè)N/A-Inv的活性在控制果實(shí)中的糖含量，以及果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用(NonisAjRupertiB,FalchiR,CasattaE,EnferadiST,VizzottoG.2007.Differentialexpressionandregulationofaneutralinvertaseencodinggenefrompeach(Primuspersica)-evidenceforaroleinfruitdevelopment.PhysiologiaPlantarum129:436-446.)；Kim等人(2007)的研究顯示，在鹽脅迫條件下，蔗糖降解產(chǎn)物可能通過(guò)一個(gè)復(fù)雜的代謝網(wǎng)絡(luò)最終產(chǎn)生氨基酸和甘氨酸甜菜堿，而這些物質(zhì)是參與逆境脅迫(如缺水或冷脅迫)應(yīng)答的高效植物細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)劑(KimJK,BambaT，HaradaK，F(xiàn)ukusakiE，KobayashiA.2007.Time-coursemetabolicprofilinginArabidopsisthalianacellculturesaftersaltstresstreatment.J.Exp.Bot.58415-424)；Vargas等人(2007)的研究發(fā)現(xiàn)，由Ν/Α-Ιην催化的蔗糖降解可能是植物為滿足高能需求和合成化合物以應(yīng)對(duì)不良環(huán)境所產(chǎn)生的一種普遍性應(yīng)答機(jī)制的早期反應(yīng)(VargasWA,PontisHG,SalernoG.2007.Differentialexpressionofalkalineandneutralinvertasesinresponsetoenvironmentalstresses!characterizationofanalkalineisoformasastress-responseenzymeinwheatleaves.Planta2261535-1545)。天然橡膠(順式-1，4_聚異戊二烯，橡膠烴)是一種重要的工業(yè)原料和不可或缺的軍工原料，在世界經(jīng)濟(jì)發(fā)展中扮演重要角色。目前，巴西橡膠樹(shù)是天然橡膠的主要來(lái)源。橡膠生物合成是在一種特化的細(xì)胞(乳管)中進(jìn)行，并且是其主要的細(xì)胞代謝活動(dòng)，橡膠烴占其細(xì)胞質(zhì)(膠乳)干重的90%以上。TupyJ等人(TupyJ.1969.Stimulatoryeffectsof2,4-dichlorophenoxyaceticacidandof1-naphthylaceticacidonsucroselevel,invertaseactivityandsucroseutilizationinthelatexofHeveabrasiliensis.Planta(Berl.)88144-153；TupyJ.1973.TheregulationofinvertaseactivityinthelatexofHeveabrasiliensisMuell.Arg:theeffectsofgrowthregulatorsbarkwounding,andlatextapping.J.Exp.Bot.24516~524；TupyJ.&PrimotL1976.ControlofcarbohydratemetabolismbyethyleneinlatexvesselsofHeveabrasiliensisMuel.Arg.Inrelationtorubberproduction.BiologiaPlantarum18,373-384；TupyJ.1985.SomeaspectsofsucrosetransportandutilizationinlatexproducingbarkofHeveabrasiliensis(Miill.Arg.).BiologiaPlantarum27,51-64；TupyJ.1989.Sucrosesupplyandutilizationforlatexproduction.InPhysiologyofRubberTreeLatex(edsJ.dfAuzac，J·LJacob&H.Chrestin),pp.179-199.C.R.C.PressiBocaRaton,FL.)多年的生理生化研究證實(shí)蔗糖轉(zhuǎn)化酶是橡膠樹(shù)膠乳代謝的限速酶；該酶定位于細(xì)胞質(zhì)，最適酶活PH值為7.25^7.40，屬于中性/堿性蔗糖轉(zhuǎn)化酶；該酶活性受橡膠產(chǎn)量刺激劑，如乙烯利和2，4-D刺激上調(diào)，是決定膠乳(橡膠)產(chǎn)量的關(guān)鍵酶。但是，未見(jiàn)任何有關(guān)橡膠膠乳蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因克隆與研究的相關(guān)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種蔗糖轉(zhuǎn)化酶及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的蔗糖轉(zhuǎn)化酶，來(lái)源于大戟科橡膠屬的巴西橡膠樹(shù)(Heveabrasiliensis)，名稱(chēng)為HbNIN2，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有蔗糖轉(zhuǎn)化酶功能的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。序列表中的序列1由557個(gè)氨基酸殘基組成。所述一個(gè)或數(shù)幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不超過(guò)10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。為了使(a)中的HbNIN2便于純化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1標(biāo)簽的序列raipf^ijPoly-Arg5_6(通常為5RRRRR個(gè))<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>上述(b)中的HbNIN2可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(b)中的HbNIN2的編碼基因可通過(guò)將序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。所述蔗糖轉(zhuǎn)化酶(HbNIN2)的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述蔗糖轉(zhuǎn)化酶(HbNIN2)的編碼基因?yàn)槿缦?)或2)或3)的DNA分子1)序列表中序列2所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼所述蔗糖轉(zhuǎn)化酶的DNA分子；3)與序列表中SEQIDNa2的核苷酸序列具有80%以上的同源性的且編碼蛋白具有蔗糖轉(zhuǎn)化酶功能的核苷酸序列。序列表中的序列2由2146個(gè)核苷酸組成。所述嚴(yán)格條件可為在0.IXSSPE(或0.1XSSC)，0.1%SDS的溶液中，在65°C下雜交并洗膜。含有所述蔗糖轉(zhuǎn)化酶編碼基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的具有蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性，轉(zhuǎn)入植物或微生物中，可提高其對(duì)蔗糖利用效率，從而提高產(chǎn)量。圖1為HbNIN2的系統(tǒng)進(jìn)化分析.楊樹(shù)(Populustrichocarpa)蔗糖轉(zhuǎn)化酶PtVINl,PtVIN2,PtVIN3,PtCIN3,PtCIN4,PtNIN9,PtNINlO和PtNmi2的詳細(xì)信息見(jiàn)已發(fā)表文獻(xiàn)(BocockPN,MorseAM,DervinisCandDavisJM.2008.EvolutionanddiversityofinvertasegenesinPopulustrichocarpa.Planta227(3):565-76.)圖2為HbNIN2的原核表達(dá)分析.箭頭所示條帶為受IPTG誘導(dǎo)后所產(chǎn)生的特異表達(dá)的目標(biāo)蛋白圖3為HbNIN2基因的組織特異性表達(dá)分析圖4為割膠對(duì)HbNIN2基因表達(dá)的影響圖5為脫落酸處理對(duì)HbNIN2基因表達(dá)的影響圖6為水楊酸處理對(duì)HbNIN2基因表達(dá)的影響圖7為乙烯利處理對(duì)HbNIN2基因表達(dá)的影響具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所述的方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、蔗糖轉(zhuǎn)化酶及其編碼基因的獲得及其效果驗(yàn)證我們首次克隆了橡膠樹(shù)膠乳蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因的全長(zhǎng)cDNA，并進(jìn)行了序列分析和功能研究。1.蔗糖轉(zhuǎn)化酶及其編碼基因的獲得在我們建立的橡膠樹(shù)膠乳EST序列數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因的EST片段，進(jìn)一步利用cDNA末端的快速擴(kuò)增技術(shù)(RACE)，最終獲得包含完整讀碼框的cDNA序列。具體方法如下<1>保守片段獲得通過(guò)搜索我們建立的已經(jīng)注釋好的橡膠樹(shù)膠乳EST序列數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)一段SOObp上下的蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因的EST片段。根據(jù)Genetyx軟件分析，該EST片段已經(jīng)包括完整的3’末端序列，5’末端序列尚不完全。<2>5，端RACE根據(jù)蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因的EST片段設(shè)計(jì)5’RACE引物(第一輪5，CCTTGCCTGTTTACCGAT3，；第二輪5，CTCCTCCCAGCGAGATTC3，)，通用引物QT,QO和Ql的序列及RACE操作流程參照文獻(xiàn)(迪芬巴赫CW，德維克斯勒GS.PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南.黃培堂譯.北京科學(xué)出版社，1998:268277)。進(jìn)行5，RACE時(shí)，以Randomprimer反轉(zhuǎn)錄進(jìn)行cDNA第一鏈合成，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀去除多余dNTP和引物后，利用末端轉(zhuǎn)移酶TdT催化加polyA尾巴。第一輪擴(kuò)增以加尾的巴西橡膠樹(shù)熱研7-33-97(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所培育，中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所長(zhǎng)期有種苗出售)第一鏈cDNA為模板，使用引物QT、QO和第一輪引物(5’-CCTTGCCTGTTTACCGAT-3’)，終濃度分別為0.04μmol/L、0.41111101/1和0.41111101/1，在25111反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)槭紫龋?4°C變性5min，50°C退火2min，72°C延伸40min；然后，94°C變性Imin，54°C退火Imin，72°C延伸lmin，共30次循環(huán)；最后，72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物稀釋100倍后，取1μ1稀釋產(chǎn)物作為模板，使用終濃度均為0.4μmol/L的Ql和第二輪引物(5’-CTCCTCCCAGCGAGATTC-3’)進(jìn)行第二輪嵌套擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min；94°C變性lmin，56°C退火lmin，72°C延伸lmin，共30次循環(huán)；72°C延伸lOmin。獲得兩段段1400bp和800bp左右的核苷酸片段。根據(jù)測(cè)序結(jié)果分析，只有SOObp大小核苷酸片段是RACE擴(kuò)增結(jié)果。但拼接后的序列經(jīng)NCBI的BLAST工具進(jìn)行同源比對(duì)后發(fā)現(xiàn)5’端長(zhǎng)度不夠，即又重新在此SOObp序列間設(shè)計(jì)RACE引物(第一輪AGTCAATATAAGCCTCATCC；第二輪ACTTGGTATATGCACGCAGC)再次做PCR，擴(kuò)增程序同5，RACE。第二次RACE獲得一段850bp左右的核苷酸片段。<4>HbNIN2cDNA全長(zhǎng)克隆根據(jù)上述所得到的巴西橡膠樹(shù)HbNIN2基因的cDNA部分片段，5，端和3，端序列，利用SECentral軟件進(jìn)行序列拼接，得到HbNIN2基因全長(zhǎng)cDNA的拼接序列。根據(jù)拼接序列，分別在5’末端和3’末端各設(shè)計(jì)一條引物(2-1F(正義鏈引物)5，-ATTCATCGTCTCTTCGCCG-3，；2_2146R(反義鏈引物)5，-GTCCTTGGCGATGAAGATAA-3，)。以巴西橡膠樹(shù)熱研7-33-97的第一鏈cDNA為模板，使用Taqpluspolymerase進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物終濃度均為0.4μmol/L，擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性3min；94°C變性lmin，58°C退火lmin，72°C延伸2.5min，共30次循環(huán)；72°C延伸lOmin。將該P(yáng)CR獲得的片段克隆到pMD18_T載體進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)測(cè)序表明獲得獲得片段大小為2146bp的cDNA全長(zhǎng)序列。該獲得的片段即為本發(fā)明的蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因基因，該片段具有序列表中序列1的核苷酸序列，序列表中序列1全長(zhǎng)為2146個(gè)核苷酸(nt)，包含一個(gè)長(zhǎng)度為1674個(gè)核苷酸的開(kāi)放閱讀框(ORF，自序列2的5'端第179-1852位核苷酸序列)、178nt的5，-UTR(自序列2的5'端第1-178位核苷酸序列)和294nt的3，_UTR(自序列2的5'端第1853-2146位核苷酸序列)，推測(cè)編碼一個(gè)長(zhǎng)度為557個(gè)氨基酸(序列表中序列1)、分子量為63.6KDa的蛋白，即為蔗糖轉(zhuǎn)化酶HbOTN2，將該蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因命名為HbOTN2。將上述含有序列2的核苷酸的PMD18-T重組載體命名為pMD18-HbNIN2。我們分別從楊樹(shù)和擬南芥中挑選8個(gè)(BocockPN,MorseAM,DervinisCandDavisJM.2008.EvolutionanddiversityofinvertasegenesinPopulustrichocarpa.Planta227(3):565_76·)和6個(gè)不同類(lèi)別(酸性和中/堿性)的蔗糖轉(zhuǎn)化酶氨基酸序列，以及兩個(gè)藍(lán)細(xì)菌(Anabaenasp.)(VargasW,CuminoA,SalernoGL.2003.Cyanobacterialalkaline/neutralinvertases.Originofsucrosehydrolysisintheplantcytosol？Planta216:951-960)的蔗糖轉(zhuǎn)化酶氨基酸序列作為模板，來(lái)分析HbNIN2的系統(tǒng)進(jìn)化地位。利用ClustalX(version1.81)軟件對(duì)這17個(gè)蔗糖轉(zhuǎn)化酶蛋白序列進(jìn)行多重比對(duì)，并用TreeView[Win32](version1.6.6)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖1)。從圖上可清楚看出，這些蔗糖轉(zhuǎn)化酶可以分為兩個(gè)進(jìn)化枝，中性/堿性蔗糖轉(zhuǎn)化酶屬一個(gè)進(jìn)化枝，而酸性(細(xì)胞壁和液泡)蔗糖轉(zhuǎn)化酶形成另外一個(gè)進(jìn)化枝。HbNIN2與植物中性/堿性蔗糖轉(zhuǎn)化酶聚在一起，進(jìn)一步證實(shí)它是中性/堿性蔗糖轉(zhuǎn)化酶。利用不同在線軟件(Predotar，TargetP和PS0RT)分析了這個(gè)橡膠樹(shù)蔗糖轉(zhuǎn)化酶的亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示它可能定位在胞液，即膠乳的C-乳清中，這表明它是膠乳代謝主要蔗糖轉(zhuǎn)化酶的編碼基因。表2為HbNIN2亞細(xì)胞定位的預(yù)測(cè)。同時(shí)，比較分析了兩個(gè)細(xì)胞定位已知的植物蔗糖轉(zhuǎn)化酶擬南芥的CINVl(定位在胞液中)和水稻的OsNim(定位在線粒體中)。表2.HbNIN2亞細(xì)胞定位的預(yù)測(cè)蛋白__預(yù)測(cè)軟件_PredotarTargetP__PSORT_HbNIN2__無(wú)信號(hào)肽無(wú)信號(hào)肽胞液或葉綠體CINl(Atlg35580)無(wú)信號(hào)肽無(wú)信號(hào)肽胞液_OsNINl_線粒體線粒體線粒體_2.原核表達(dá)與重組蛋白的活性分析利用pET28a(張一折等.應(yīng)用pET系統(tǒng)表達(dá)rhIFN-α2b基因的研究.中國(guó)生物制品學(xué)雜志.2003年.第03期)構(gòu)建了HbNIN2基因的原核表達(dá)載體，具體方法如下<1>含巴西橡膠樹(shù)HbNIN2基因編碼區(qū)重組載體的獲得通過(guò)Genetyx軟件分析HbNIN2基因的編碼區(qū)限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，確定兩個(gè)HbNIN2基因編碼區(qū)修飾用的限制性內(nèi)切酶(NdeI和Sail)。設(shè)計(jì)HbNIN2基因編碼區(qū)引物(2-N5，-CCATATGATGGATGGGACTAAAGAGG-3，(正義鏈引物，下劃線標(biāo)注的是NdeI酶切位點(diǎn)))，2-S:5，-CGTCGACTTAGCAAGTCCAAGAAGAA-3，(反義鏈引物，下劃線標(biāo)注的是SalI酶切位點(diǎn))；該引物對(duì)擴(kuò)增的片段具有序列表中序列)，以pMD18-HbNIN2為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)?5°C預(yù)變性3min；94°C變性lmin，58°C退火lmin，72°C延伸2min，共30次循環(huán)；72°C延伸IOmin0擴(kuò)增得到1674bp的產(chǎn)物，測(cè)序表明該片段具有序列表中序列2的第179-1852位核苷酸序列。將該片段用與PMD18-T連接，獲得pMD-HbNIN2重組質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序確認(rèn)擴(kuò)增序列的正確性。在37°C水浴中，用NdeI和SalI雙切重組質(zhì)粒，電泳回收1680bp左右的目的條帶。將該目的片段插入到pET28a質(zhì)粒的NdeI和SalI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)之間，得到重組載體，將重組載體進(jìn)行酶切和測(cè)序鑒定，將鑒定表明正確的含有序列表中序列2的第179-1852位核苷酸序列的重組載體命名為pET28a-HbNIN2。<2>本發(fā)明的蔗糖轉(zhuǎn)化酶的表達(dá)和其功能驗(yàn)證將獲得的重組載體pET28a_HbNIN2導(dǎo)入E.coliBL21(DE3)中(陸海等.大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)重組蛋白的研究.北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào).2001年第23卷第6期)，得到重組表達(dá)菌，將鑒定正確的重組菌在含50μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D600=0.40.6，添加IPTG至終濃度為lmM，37°C下誘導(dǎo)培養(yǎng)4h或6h，以未加IPTG的培養(yǎng)基培養(yǎng)的同樣重組菌為對(duì)照，離心收集菌體，菌體蛋白進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳檢測(cè)。結(jié)果表明，在IPTG誘導(dǎo)下HbNIN2這個(gè)基因?qū)崿F(xiàn)了高效異源表達(dá)，并且表達(dá)蛋白的表觀分子量與理論分子量相近，大約64kDa(圖2)。蛋白表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)鎳柱純化后(具體方法參照Clontech公司的TALONresin產(chǎn)品說(shuō)明書(shū))，用14C-標(biāo)記蔗糖進(jìn)行蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性分析，具體方法參考文獻(xiàn)(VargasWA,PontisHG,SalernoG.2007.Differentialexpressionofalkalineandneutralinvertasesinresponsetoenvironmentalstressescharacterizationofanalkalineisoformasastress-responseenzymeinwheatleaves.Planta2261535-1545)進(jìn)行取5μ114C標(biāo)記的蔗糖(比活性0.2μCi/μ1)(比活力為5XIO6Cpm/μmol)，力口入終濃度為200mM的磷酸鉀緩沖液(pH7.5)，再加入2μg經(jīng)鎳柱純化的含組氨酸標(biāo)簽的蔗糖轉(zhuǎn)化酶重組蛋白，總體積為50μ1反應(yīng)體系。30°C水浴條件下反應(yīng)不同時(shí)間(Omin、10min,30min,60min)后，100°C2min終止反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)混合床離子交換柱脫鹽，不同的糖分經(jīng)層析法分離和鑒定，并用液閃儀測(cè)定14C標(biāo)記的不同糖分(蔗糖、葡萄糖和果糖)的閃爍值(cpm)。在pH7.5的反應(yīng)體系中中，處理IOmin后，就能明顯的檢測(cè)出蔗糖降解產(chǎn)物葡萄糖和果糖；并且，隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，14C-蔗糖的量不斷減少，而14C-葡萄糖和14C-果糖的量不斷增加，表明所表達(dá)的重組蛋白具有明顯的蔗糖降解活性，因此我們所克隆的這個(gè)HbNIN2基因編碼功能性蔗糖轉(zhuǎn)化酶。3.表達(dá)研究<l>HbNIN2基因的組織功能表達(dá)驗(yàn)證以巴西橡膠樹(shù)熱研7-33-97葉片、樹(shù)皮和膠乳RNA隨機(jī)反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用Hbmm基因特異引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，根據(jù)各自對(duì)應(yīng)的Qr值(Qr=ECt(18S-rRNA)-Ct(HbNINl)j常數(shù)川每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))的大小，同時(shí)乘以相同的倍數(shù)，即得到不同處理的相對(duì)表達(dá)豐度。結(jié)果顯示HbNIN2主要在膠乳中表達(dá)(圖3)，在葉片和樹(shù)皮中的表達(dá)豐度相比要低的多，表明它具有明顯的組織表達(dá)特異性，并且可能是膠乳再生蔗糖轉(zhuǎn)化酶的編碼基因。<2>割膠對(duì)HbNIN2基因的表達(dá)影響割膠可刺激膠乳生產(chǎn)，在未開(kāi)割橡膠樹(shù)中這種效果更明顯。未開(kāi)割樹(shù)莖干部樹(shù)皮中的乳管代謝活性低，隨著割膠次數(shù)的增加，乳管蔗糖吸收加速，代謝活性增強(qiáng)，最終膠乳產(chǎn)量也增加了。未開(kāi)割樹(shù)的這種特性使其成為一個(gè)鑒定和研究膠乳再生相關(guān)基因的理想材料。以未開(kāi)割巴西橡膠樹(shù)熱研7-33-97不同刀次的膠乳RNA隨機(jī)反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用HbNIN2基因特異引物(rINV2-F2:GAAGAGAGGCAAACAAACAAG(正義鏈引物，對(duì)應(yīng)序列表中序列2的第1845-1874位核苷酸)，rINV2_R2:CGAAAGCAAACATTTCTCACTTTAC(反義鏈引物，對(duì)應(yīng)序列表中序列2的第1921-1945位核苷酸))進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，結(jié)果分析同步驟<1>。結(jié)果如圖4所示，結(jié)果表明割膠影響HbNIN2基因的表達(dá)——誘導(dǎo)HbNIN2的表達(dá)。<3>激素對(duì)HbNIN2基因的表達(dá)影響有研究認(rèn)為，一些植物激素可調(diào)控蔗糖轉(zhuǎn)化酶的基因表達(dá)和酶促活性，并且這種調(diào)控可能在某些激素調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮核心作用(Tymowska-LalarmeΖ.andKreisΜ.1998.Theplantinvertases:physiology,biochemistryandmolecularbiology.Adv.Bot.Res.28:71_117)。在橡膠樹(shù)生產(chǎn)中，在割線或割面上施用乙烯利(乙烯緩釋劑)可刺激膠乳產(chǎn)量，已成為現(xiàn)代割膠制度不可或缺的組成部分。本研究選取六種植物激素(或生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，乙烯利、脫落酸、水楊酸、細(xì)胞分裂素、赤霉素和茉莉酸)，分別涂于橡膠樹(shù)割線以及割線上方Icm割面處刺激橡膠樹(shù)(0h、2h、12h，個(gè)別含24h)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示(結(jié)果分析同步驟<1>)在所測(cè)定的六種植物激素(或生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑)中，HbNIN2基因的表達(dá)顯著受脫落酸(ABA)和水楊酸(SA)誘導(dǎo)(圖5、6)；同時(shí)乙烯利(ET)對(duì)HbNIN2基因的表達(dá)也有誘導(dǎo)作用(圖7)，但不如ABA和SA顯著。此外，其它幾種激素如細(xì)胞分裂素(CTK)、赤霉素(GA)和茉莉酸(JA)對(duì)這個(gè)橡膠樹(shù)蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因無(wú)明顯影響。4.結(jié)論我們首次克隆了橡膠樹(shù)膠乳蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因的全長(zhǎng)cDNA，它是典型的中性/堿性蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因，并且可能就是膠乳蔗糖利用關(guān)鍵酶的編碼基因；基因表達(dá)分析也初步顯示它可能是決定乳管蔗糖利用效率的蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因。該基因可作為橡膠樹(shù)轉(zhuǎn)基因育種的重要靶標(biāo)基因，有望通過(guò)調(diào)控這個(gè)基因的表達(dá)來(lái)合理調(diào)節(jié)乳管的蔗糖利用和同化碳分配率，進(jìn)而協(xié)調(diào)橡膠樹(shù)的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和橡膠生產(chǎn)，從而最大潛力的挖掘橡膠樹(shù)生產(chǎn)潛力。此外，該基因可作為重要的基因資源，還可能在橡膠樹(shù)以外的其他植物或微生物的高產(chǎn)或抗逆基因工程中得到應(yīng)用。權(quán)利要求一種蛋白質(zhì)，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中的SEQID1的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中的SEQID1氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有蔗糖轉(zhuǎn)化酶相關(guān)功能的由SEQID№1衍生的蛋白質(zhì)。FSA00000051908900011.tif,FSA00000051908900012.tif2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其特征在于所述蛋白質(zhì)為蔗糖轉(zhuǎn)化酶。3.權(quán)利要求1或2所述的蛋白質(zhì)的編碼基因。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因的核苷酸序列是下述1)、2)或3)1)序列表中SEQIDΜ2的核苷酸序列；2)在嚴(yán)格條件下可與1)所述的DNA序列雜交的核苷酸序列。3)與序列表中SEQIDJV2:2的核苷酸序列具有80%以上的同源性的且編碼蛋白具有與蔗糖轉(zhuǎn)化酶功能的核苷酸序列。5.含有權(quán)利要求3或4所述的編碼基因的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或轉(zhuǎn)基因重組菌6.權(quán)利要求1或2所述的蛋白質(zhì)及其編碼基因在培育蔗糖利用率提高的重組微生物中的應(yīng)用。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述重組微生物為大腸桿菌。8.權(quán)利要求3或4所述的編碼基因在培育產(chǎn)量提高的轉(zhuǎn)基因橡膠樹(shù)種的應(yīng)用。9.權(quán)利要求1或2所述的蛋白質(zhì)及其編碼基因在降解蔗糖中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種蔗糖轉(zhuǎn)化酶及其編碼基因與應(yīng)用。該蛋白，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQID№.1的氨基酸殘基序列；2)將序列表中的SEQID№.1氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有蔗糖轉(zhuǎn)化酶功能的由SEQID№1衍生的蛋白質(zhì)。該蛋白具有蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性，對(duì)蔗糖具有降解活性，轉(zhuǎn)入植物或微生物中，可提高其對(duì)蔗糖利用效率，從而提高產(chǎn)量。文檔編號(hào)C12N15/56GK101812433SQ20101013888公開(kāi)日2010年8月25日申請(qǐng)日期2010年3月19日優(yōu)先權(quán)日2009年11月10日發(fā)明者劉術(shù)金,唐朝榮,戚繼艷,陽(yáng)江華申請(qǐng)人:中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所