專利名稱：:用于測定高半胱氨酸的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一般涉及高半胱氨酸檢測領(lǐng)域。特別是，本發(fā)明提供一種測定樣品中高半胱氨酸(Hcy)的存在或濃度的方法，其中在通過Hcy轉(zhuǎn)化酶催化的Hcy轉(zhuǎn)化反應(yīng)中將高半胱氨酸與Hcy共底物反應(yīng)以形成Hcy轉(zhuǎn)化產(chǎn)物和Hcy共底物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，和評估Hcy共底物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物以確定樣品中Hcy的存在和/或濃度。本發(fā)明還提供了基于相同原理測定高半胱氨酸的試劑盒。發(fā)明背景體液如血漿或血清中的高半胱氨酸的總濃度是疾病的重要標(biāo)志。例如，高半胱氨酸定量可以是心血管病重要的風(fēng)險指標(biāo)，可以是鈷胺素和葉酸缺乏的靈敏標(biāo)志，并且可以用于診斷稱為高胱氨酸尿癥的代謝的先天缺陷。高半胱氨酸定量也已經(jīng)報道有效用于評估孕婦中的出生缺陷和老年人的認(rèn)知損傷。參見Frantzen，等，EnzymeConversionImmunoassayforDeterminingTotalHomocysteineinPlasmaorSerum,ClinicalChemistry44:2,311-316(1998)。高半胱氨酸(Hcy)是在S-腺苷甲硫氨酸-依賴性甲基轉(zhuǎn)移反應(yīng)過程中由甲硫氨酸形成的含硫醇的氨基酸。胞內(nèi)Hcy被再甲基化為甲硫氨酸，或者在一系列反應(yīng)中不可逆地代謝形成半胱氨酸。胞內(nèi)Hcy被輸出到胞外流體如血液和尿中，并且大多以氧化的形式循環(huán)，主要與血菜蛋白質(zhì)結(jié)合(Refsum，等，Annu.Rev.Medicine,49:31-62(1998))。血菜和尿中的Hcy的數(shù)量反映了Hcy生產(chǎn)和利用之間的平衡。該平衡可被各種臨床狀態(tài)所擾亂，所述臨床狀態(tài)其特征在于參與Hcy轉(zhuǎn)硫作用和再甲基化的酶(例如，胱硫醚β-合酶和N5’1(1_亞甲基四氫葉酸還原酶)的遺傳病或參與Hcy代謝的維生素類(例如維生素，B12和葉酸)的飲食缺乏(Baual，等，ClevelandClinicJournalofMedicine,64:543-549(1997))另外，血漿Hcy水平還可能被一些用于治療癌癥或關(guān)節(jié)炎的藥物如抗葉酸藥物(例如甲氨蝶呤)所擾亂(Foody，等，ClinicianReviews,8:203-210(1998))—些高半胱氨酸血癥病例是由編碼參與Hcy代謝的酶的基因的純合缺陷所導(dǎo)致。在這些病例中，參與Hcy再甲基化或轉(zhuǎn)硫作用的酶的缺陷導(dǎo)致血液和尿中Hcy高達(dá)50倍的升高。這種病癥的典型形式，先天性高半胱氨酸血癥(Hcyemia)，是由編碼胱硫醚β-合酶(CBS)的基因的純合缺陷所導(dǎo)致。這些個體在早年患有血栓栓塞并發(fā)癥，其導(dǎo)致中風(fēng)，心肌梗死，腎血管性高血壓，間歇性跛行，腸系膜局部缺血，和肺栓塞。這些患者還可能顯示智力遲鈍和其它類似于晶狀體異位和骨骼畸形的異常(PerryΤ.，HomocysteineSelectedaspectsinNyhamW.L.ed.Heritabledisordersofaminoacidmetabolism.NewYork,JohnWiley&Sons，pp.419-451(1974))。還已知孕婦中升高的Hcy水平與具有神經(jīng)管閉合的兒童出生缺陷有關(guān)(Scott，等，〃Theetiologyofneuraltubedefects"inGraham，I.，Refsum,H.，Rosenberg，I.H.，andUrelandP.M.ed.“Homocysteinemetabolismfrombasicsciencetoclinicalmedicine“KluwerAcademicPublishers，Boston，pp.133-136(1995))。因此，Hcy測定的診斷應(yīng)用已經(jīng)在這些臨床病癥中很好地證明。已經(jīng)顯示即使是輕微或適度升高的Hcy水平也增加了冠狀動脈、腦動脈和外周動脈的動脈粥樣硬化和心血管病的風(fēng)險(Boushey，等，JAMA，2H:1049-1057(1995))。在患有腦血管病、外周血管病和心血管病的患者中，高半胱氨酸血癥的發(fā)病率據(jù)顯示分別為42%，28%，和30%(Moghadasian，等，Arch.Intern.Med.,157:2299-2307(1997))。27項臨床研究的meta-分析計算表明，Hcy水平每增加5μΜ,男人和女人的冠狀動脈病的風(fēng)險分別增加60%和80%，其相當(dāng)于血漿膽固醇增加ZOmg/dr1(0.Smmol/dr1)，提示Hcy作為風(fēng)險因子在一般人群中與膽固醇一樣強大。這些臨床研究的結(jié)果得出結(jié)論，即高半胱氨酸過高血癥是心血管疾病的一個新出現(xiàn)的獨立的風(fēng)險因子，并且可以解釋所有不具有任何確立的心血管風(fēng)險因子(例如高血壓，高膽固醇血癥，吸煙，糖尿病，顯著肥胖和身體不活動)的心血管患者中的一半。輕度高半胱氨酸血癥主要是由酶缺陷的雜合性造成的。亞甲基四氫葉酸還原酶的基因的一種常見多態(tài)性似乎影響高半胱氨酸水平對葉酸缺乏的敏感性(Boers，等，J.Inher.Metab.Dis.,20=301-306(1997))此外，血漿高半胱氨酸水平還在以下患者中顯著升高心臟和腎臟移植患者(Ueland，等，J.Lab.Clin.Med.,114:473-501(1989)),阿爾茨海默氏病患者(Jacobsen，等，Clin.Chem.，M:2238-2239(1998))，以及非胰島素依賴型糖尿病患者(Ducloux，等，N印hrol.Dial.Transplantl，叢J890-2893(1998))。將升高的高半胱氨酸與心血管病聯(lián)系在一起的證據(jù)的積累已經(jīng)促使開始雙盲、隨機和安慰劑對照的多中心臨床試驗以證明降低血漿Hcy在預(yù)防或阻止血管病的進(jìn)展中的功效(Diaz-Arrastia,等，Arch.Neurol.,551407-1408(1998))。血漿高半胱氨酸水平的測定應(yīng)當(dāng)是一項常規(guī)的臨床實踐。作為心血管病的風(fēng)險因子，已經(jīng)在臨床設(shè)置中推薦測定總血漿Hcy水平(還原型，氧化型和結(jié)合蛋白的)(Homberger，等，AmericanJ.ofPublicHealth，巡61-67(1998))。自從1982年，已經(jīng)描述了幾種測定總血漿Hcy的方法(Mansoor，等，Anal.BioChem.，200:218-229(1992)；Steir,等，Arch.Intern.Med.，迴1301-1306(1998)；Ueland,等，Clin.Chem.，巡1764-1779()1993)；禾ΠUeland,等，“Plasmahomocysteineandcardiovasculardisease"inFrancis,R.B.Jr.eds.AtheroscleroticCardiovascularDisease,Hemostasis,andEndothe1ialFunction.NewYork,MarcelDokker,pp.183-236(1992)；還參見Ueland,等，"Plasmahomocysteineandcardiovasculardisease"inFrancis,R.B.Jr.eds.AtheroscleroticCardiovascularDisease,Hemostasis,andEndothelialFunction.NewYork,MarcelDokker,pp.183-236(1992))。血漿或血清中總Hcy的測定由于70%的血漿Hcy是蛋白結(jié)合的和20-30%作為游離的對稱或大多不對稱的混合二硫化物而存在的事實而變得復(fù)雜。游離的還原型Hcy僅痕量存在(Stehouwer，等，KidneyInternational,55308-314(1999))大多數(shù)方法需要復(fù)雜的色譜技術(shù)如HPLC，毛細(xì)管氣相色譜法，或質(zhì)譜分析(GC/MS)以直接或間接(例如通過SAH水解酶將Hcy酶促轉(zhuǎn)化為SAH(S-腺苷高半胱氨酸)，接著HPLC或TLC分離)測量Hey。也已經(jīng)使用在TLC分離前通過SAH水解酶將Hcy放射酶促轉(zhuǎn)化為放射性標(biāo)記SAH。在這些測定中，色譜分離是這些方法中共同的關(guān)鍵步驟，而色譜分離通常是耗時并且實行起來繁重。更具體地，這些方法要求高度專業(yè)化和復(fù)雜的儀器和訓(xùn)練有素的分析專家。這些儀器的使用通常沒在常規(guī)臨床實驗室實踐中廣泛接受。還已知針對Hcy的免疫測定，其使用針對SAH的單克隆抗體(Araki，等，J.Chromatog.,42243-52(1987))0這些測定是基于Hcy向SAH的轉(zhuǎn)化，然后通過單克隆抗體檢測SAH。已經(jīng)開發(fā)了針對清蛋白結(jié)合的Hcy的單克隆抗體以用于測定清蛋白結(jié)合的Hcy(Stabler,等，J.Clin.Invest.,81:466-474(1988))，清蛋白結(jié)合的Hcy是總血漿Hcy的主要級分。還可以獲得其它免疫學(xué)工具(參見例如U.S.專利號.5，631，127，5，827，645，5，958，717，6，063，581和5，885，767)。盡管免疫測定避免了耗時的色譜分離步驟并且適合自動化，但是單克隆抗體的生產(chǎn)是昂貴的和有點無法預(yù)測的，并且通常需要第二或甚至第三抗體來檢測。最近，已經(jīng)報道了高半胱氨酸測定的酶促方法(Matsuyama，等，ClinicalChemistry,￡7:2155-2156(2001)；Tan等，ClinicalChemistry,49:1029-1030(2003)；U.S.專利號5，885，767，5，998，191，6，046，017，6，174，696，6，436，658和6，664，073B1)，所有這些描述的高半胱氨酸測定基于通過高半胱氨酸轉(zhuǎn)化酶生成的高半胱氨酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的評估。在美國專利號6，686，172和美國專利申請公開號2002/0119507中描述了用于檢測樣品中的高半胱氨酸的其它方法。需要一種有效而準(zhǔn)確的測定方法，其能夠在不需要高度熟練的技術(shù)人員或復(fù)雜分析化學(xué)儀器的情況下實行。本發(fā)明解決了本領(lǐng)域中的上述和其它相關(guān)問題。發(fā)明概述一方面，本發(fā)明涉及一種關(guān)于樣品中高半胱氨酸的測定方法。按照該測定方法，在Hcy轉(zhuǎn)化反應(yīng)中將含有或懷疑含有高半胱氨酸(Hcy)的樣品與Hcy共底物和Hcy轉(zhuǎn)化酶接觸以形成Hcy轉(zhuǎn)化產(chǎn)物和Hcy共底物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物；和評估Hcy共底物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物以確定所述樣品中Hcy的存在、不存在和/或數(shù)量。在本發(fā)明的一些實施方案中，在沒有色譜分離的情況下評估Hcy共底物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。在一些實施方案中，Hcy共底物是S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，Hcy轉(zhuǎn)化酶是S-腺苷甲硫氨酸(SAM)-依賴性高半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶，所述Hcy轉(zhuǎn)化產(chǎn)物是甲硫氨酸(Met)并且所述Hcy共底物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物是S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAH)，評估SAH以確定所述樣品中Hcy的存在、不存在和/或數(shù)量。可以以任何適當(dāng)形式使用SAM。例如，將SAM直接加入樣品。在另一實施例中，通過另外的反應(yīng)生產(chǎn)SAM，例如通過SAM合酶由ATP和Met生產(chǎn)SAM。SAH可以轉(zhuǎn)化為Hcy和腺苷(Ado)，評估Ado以確定所述樣品中Hcy的存在、不存在和/或數(shù)量。在一些實施方案中，SAH與SAH水解酶接觸以由SAM生成Hcy和腺苷(Ado)，所述Hcy通過SAM-依賴性高半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶循環(huán)至所述Hcy轉(zhuǎn)化反應(yīng)中以形成基于Hcy共底物的酶循環(huán)反應(yīng)體系，評估所述Ado以確定樣品中Hcy的存在、不存在和/或數(shù)量?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何適當(dāng)方法如免疫學(xué)方法或酶促方法來評估Ado。可以直接或間接評估Ado。例如，可以通過腺苷轉(zhuǎn)化酶評估腺苷轉(zhuǎn)化的共底物或反應(yīng)產(chǎn)物來間接評估Ado。在一些實施方案中，腺苷轉(zhuǎn)化酶是腺苷激酶，反應(yīng)產(chǎn)物是腺苷5'-—磷酸。在其它實施方案中，腺苷轉(zhuǎn)化酶是腺苷脫氨酶并且反應(yīng)產(chǎn)物是銨和肌苷。在一方面，本發(fā)明涉及一種測定樣品中的高半胱氨酸(Hcy)的方法，該方法包含a)在Hcy轉(zhuǎn)化反應(yīng)中將含有或懷疑含有Hcy的樣品與Hcy共底物和Hcy轉(zhuǎn)化酶接觸以形成Hcy轉(zhuǎn)化產(chǎn)物和Hcy共底物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，其中所述Hcy共底物是S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，所述Hcy轉(zhuǎn)化酶是S-腺苷甲硫氨酸(SAM)-依賴性高半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶，所述Hcy轉(zhuǎn)化產(chǎn)物是甲硫氨酸(Met)并且所述Hcy共底物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物是S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAH)，和b)評估所述SAH以確定樣品中Hcy的存在、不存在和/或數(shù)量，其中在沒有色譜分離的情況下評估所述SAH?？梢砸匀魏芜m當(dāng)形式使用SAM。例如，將SAM直接加入樣品。在另一實施例中，通過另外的反應(yīng)生產(chǎn)SAM，例如通過SAM合酶由ATP和Met生產(chǎn)SAM?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何適當(dāng)方法如免疫學(xué)方法或酶促方法來評估SAH。例如，可以通過評估SAH和突變型SAH結(jié)合酶之間的結(jié)合來評估SAH，所述突變型SAH結(jié)合酶如對Hcy、SAH或腺苷具有結(jié)合親和力但具有減弱的催化活性的突變型SAH水解酶。在一個實施例中，SAH的評估不包括生成H2A的酶促反應(yīng)和H2A的檢測。在另一個實施例中，可以通過使用與SAH特異性結(jié)合的抗體來評估SAH?？贵w可以是單克隆的或多克隆的?？贵w還可以與載體基質(zhì)結(jié)合?？梢允褂萌魏芜m當(dāng)?shù)拿庖邷y定形式，例如夾層和競爭性測定形式。本發(fā)明的方法可以用于測定任何樣品中的高半胱氨酸，所述樣品包括但不限于體液或生物組織。所述體液可以選自由下列各項組成的組尿，血液，血漿，血清，唾液，精液，糞便，痰液，腦脊髓液，淚液，粘液，和羊膜液。在一些實施方案中，所述體液是血液。在一些實施方案中，所述血液樣品被進(jìn)一步分成血漿或血清級分。在一些實施方案中，在所述樣品與Hcy共底物和Hcy轉(zhuǎn)化酶接觸之前或同時，將樣品中氧化的或偶聯(lián)的Hcy轉(zhuǎn)化為還原型Hcy。在一些實施方案中，將樣品進(jìn)行適當(dāng)量的二硫蘇糖醇、三(2-羧乙基)_膦鹽酸鹽(TCEP)或其它還原劑的處理，以在樣品中生成游離的高半胱氨酸。本發(fā)明的方法可以另外包含以下步驟去除在將樣品與Hcy共底物和Hcy轉(zhuǎn)化酶接觸之前或同時用于將氧化的或偶聯(lián)的Hcy轉(zhuǎn)化為還原型Hcy的還原劑。例如，通過加入N-乙基馬來酰亞胺或其它硫(thio)-反應(yīng)化合物可以去除還原劑。本發(fā)明還有另一方面涉及用于確定樣品中高半胱氨酸的存在或濃度的試劑盒，該試劑盒包含a)Hcy轉(zhuǎn)化酶；b)Hcy共底物；和c)用于評估Hcy共底物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的試劑。在一些實施方案中，所述Hcy共底物是S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，所述Hcy轉(zhuǎn)化酶是S-腺苷甲硫氨酸(SAM)-依賴性高半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶，所述Hcy共底物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物是S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAH)，并且用于評估Hcy共底物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的試劑是用于評估SAH的試劑。在一些實施方案中，試劑盒另外包含一種試劑，例如SAH水解酶，以由SAM生成Hcy和腺苷(Ado)，所述Hcy通過SAM-依賴性高半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶循環(huán)至所述Hcy轉(zhuǎn)化反應(yīng)中以形成基于Hcy共底物的酶循環(huán)反應(yīng)體系。[0033]本發(fā)明還提供一種測定樣品中Hcy的試劑盒，該試劑盒包含a)S_腺苷甲硫氨酸(SAM)-依賴性高半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶；b)S-腺苷甲硫氨酸(SAM)或ATP，Met和SAM合酶；c)SAH水解酶；和d)用于評估腺苷(Ado)的試劑。用于評估Ado的試劑可以是不同于SAH水解酶的腺苷轉(zhuǎn)化酶，如腺苷激酶和腺苷脫氨酶。本發(fā)明還提供了一種測定樣品中Hcy的試劑盒，該試劑盒包含a)S-腺苷甲硫氨酸(SAM)-依賴性高半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶；b)S_腺苷甲硫氨酸(SAM)或ATP，Met和SAM合酶；和c)用于評估SAH的試劑，其中所述試劑盒不包含用于生成H2A的酶或試劑和用于檢測H2A的試劑。在一些實施方案中，本發(fā)明的試劑盒另外包含還原劑如二硫蘇糖醇(DTT)或TCEP。本發(fā)明的試劑盒可以是任何適當(dāng)?shù)陌b并且還可以包括實施本文所述方法的使用說明。試劑盒可以任選地包括另外的組分如緩沖劑。本文所述的測定可以用于任何適當(dāng)?shù)哪康?，例如預(yù)后，診斷，藥物篩選或治療監(jiān)視目的。測定可以容易地自動化。另外，測定可以適用于護理系統(tǒng)點(pointofcaresystem)和家庭檢測試劑盒。例如，可以調(diào)整護理系統(tǒng)的血液檢測點以使用本文提供的方法測量高半胱氨酸水平。家庭檢測試劑盒還可以適用于與本文提供的方法使用。附圖簡述圖1舉例說明了例舉性的高半胱氨酸的測定方法。Hcy:L_高半胱氨酸；SAM:S_腺苷甲硫氨酸；HMTase=SAM-依賴性高半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶；和SAHase=S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶。圖2描繪了在實施例1中所述的實驗中獲得的血清高半胱氨酸劑量反應(yīng)曲線。圖3描繪了例舉性的Diazyme高半胱氨酸酶促測定與在CcAasMira分析儀上進(jìn)行的Catch高半胱氨酸測定之間的比較。圖4描繪了例舉性的Diazyme高半胱氨酸酶促測定與在BeckmanSynchronCX-7分析儀上進(jìn)行的Catch高半胱氨酸測定之間的比較。發(fā)明詳述為了公開內(nèi)容清楚且并非為了限制，將本發(fā)明的詳細(xì)描述分成以下幾個分部。A.定義除非另外定義，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。本文所引的所有專利、申請、公開的申請和其它出版物通過參考完整地結(jié)合于此。如果本部分闡明的定義與通過參考結(jié)合于此的所述專利、申請、公開的申請和其它出版物中闡明的定義相反或否則不一致，本部分闡明的定義優(yōu)先于通過參考結(jié)合于此的定義。如本文所用，“一種(a)，，或“一種(an)，，是指“至少一個”或“一個或多個”。如本文所用，“高半胱氨酸(Hcy)”是指具有下列分子式的化合物HSCH2CH2CH(NH2)COOH0在生物學(xué)上，Hcy是通過將甲硫氨酸脫甲基化生成的并且是由甲硫氨酸生物合成半胱氨酸中的中間體。術(shù)語“Hey”包含游離的Hcy(還原型)和偶聯(lián)的Hcy(氧化型)。Hcy可以與蛋白質(zhì)、肽、其本身或其它硫醇類通過二硫鍵偶聯(lián)。如本文所用，“高半胱氨酸(Hcy)轉(zhuǎn)化反應(yīng)"是指其中化合物與Hcy分子反應(yīng)的反應(yīng)，期間化學(xué)基團(例如甲基)從化合物轉(zhuǎn)移到Hcy分子上而形成反應(yīng)產(chǎn)物。與Hcy分子反應(yīng)且提供化學(xué)基團的化合物被稱為“高半胱氨酸(Hcy)共底物”。催化反應(yīng)的酶被稱為“高半胱氨酸(Hcy)轉(zhuǎn)化酶”。含有整個或部分原始Hcy分子的反應(yīng)產(chǎn)物被稱為“高半胱氨酸(Hcy)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物”。不含有來自于原始Hcy分子的任何元件的反應(yīng)產(chǎn)物被稱為“Hey共底物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物”。如本文所用，“SAM-依賴性高半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶”是指催化由高半胱氨酸和S-腺苷甲硫氨酸(SAM)形成甲硫氨酸和S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAH)的酶。意欲包含具有保守的氨基酸替代的SAM-依賴性高半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶，所述保守的氨基酸替代不實質(zhì)上改變其活性。如本文所用，“SAH水解酶”是指遍在的真核生物酶，其也在一些原核生物中發(fā)現(xiàn)，催化SAH向腺苷(Ado)和Hcy的水解。SAH水解酶還催化由Ado和Hcy形成SAH。SAH水解酶的輔酶是NAD+/NADH。SAH水解酶可以具有幾種催化活性。在水解方向上，第一步包括通過酶結(jié)合的NAD+(E-NAD+)將SAH的3‘-羥基基團氧化(3‘-氧化活性)，接著通過L-Hcy的β-消除以提供3'-酮基-4'，5'如本文所用，術(shù)語“評估”意欲包括在獲得樣品中存在的分析物(例如高半胱氨酸或Ado)的量或濃度的絕對值和另外在獲得指示樣品中分析物水平的指標(biāo)、比率、百分比、直觀的或其它值的意義上的定量和定性測定。評估可以是直接或間接的并且實際檢測的化學(xué)物質(zhì)當(dāng)然不需要是分析物本身，而可以例如是其衍生物或一些另外的物質(zhì)。如本文所用，“腺苷脫氨酶”是指催化腺苷脫氨基形成肌苷的酶。意欲包括具有保守氨基酸替代的腺苷脫氨酶，所述保守的氨基酸替代不實質(zhì)上改變其活性。如本文所用，“腺苷激酶”是指催化由腺苷和ATP形成腺苷5’-一磷酸和ADP的酶。意欲包括具有保守氨基酸替代的腺苷激酶，所述保守的氨基酸替代不實質(zhì)上改變其活性。如本文所用，“血清”是指在去除血纖蛋白凝塊和血細(xì)胞以后獲得的血液的流體部分，其區(qū)別于循環(huán)血中的血漿。如本文所用，“血漿”是指血液的流體、非細(xì)胞部分，其區(qū)別于在凝固后獲得的血清。如本文所用，“通過重組方法生產(chǎn)”是指使用重組核酸方法的生產(chǎn)方法，該方法依賴于公知的分子生物學(xué)方法以表達(dá)由克隆的核酸編碼的蛋白質(zhì)。如本文所用，“流體”是指可以流動的任何組合物。流體因此包含半固體、膏狀物、溶液、水性混合物、凝膠、洗液、乳膏形式的組合物和其它這些組合物。如本文所用，“樣品”是指可以含有分析物的任何事物，期望針對該分析物進(jìn)行分析測定。樣品可以是生物樣品，如生物流體或生物組織。生物流體的實例包括尿，血液，血漿，血清，唾液，精液，糞便，痰液，腦脊髓液，淚液，粘液，羊膜液等。生物組織是細(xì)胞的聚集體，通常是特定種類的細(xì)胞和它們的胞間物質(zhì)一起，形成人、動物、植物、細(xì)菌、真菌或病毒結(jié)構(gòu)的一種結(jié)構(gòu)物質(zhì)，包括結(jié)締組織，上皮組織，肌肉組織和神經(jīng)組織。生物組織的實例還包括器官，腫瘤，淋巴結(jié)，動脈和單個細(xì)胞。9[0061]如本文所用，“疾病或病癥”是指生物體中由例如感染或遺傳缺陷所導(dǎo)致的病理狀況，其特征在于可識別的癥狀。如本文所用，“抗體”不僅包括完整的多克隆或單克隆抗體，還包括其片段(如Fab,Fab',F(ab')2，F(xiàn)v)，單鏈(ScFv),diabody，由抗體片段形成的多特異性抗體，其突變體，包含抗體部分的融合蛋白，和包含所需特異性的抗原識別位點的免疫球蛋白分子的其它任何改進(jìn)構(gòu)型?？贵w包括任何種類的抗體，如IgG，IgA，或IgM(或其亞類)，抗體不需要是任何具體類別。B.測定高半胱氨酸的方法本發(fā)明提供測定樣品中的高半胱氨酸(Hcy)的方法，該方法包含a)在Hcy轉(zhuǎn)化反應(yīng)中將含有或懷疑含有Hcy的樣品與Hcy共底物和Hcy轉(zhuǎn)化酶接觸以形成Hcy轉(zhuǎn)化產(chǎn)物和Hcy共底物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物；和b)評估所述Hcy共底物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物以確定所述樣品中所述Hcy的存在、不存在和/或數(shù)量。在一些實施方案中，在沒有色譜分離的情況下評估Hcy共底物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。在一些實施方案中，Hcy轉(zhuǎn)化酶是S-腺苷甲硫氨酸(SAM)-依賴性高半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶。當(dāng)將SAM-依賴性高半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶用作Hcy轉(zhuǎn)化酶時，Hcy共底物是S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，Hcy轉(zhuǎn)化產(chǎn)物是甲硫氨酸(Met)，Hcy共底物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物是S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAH)，且評估SAH以確定所述樣品中Hcy的存在、不存在和/或數(shù)量?？梢允褂脤⒓谆鶊F從SAM轉(zhuǎn)移至Hcy的任何S-腺苷甲硫氨酸(SAM)-依賴性高半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶。例如，可以使用Shapiro和StanleyK(MethodsEnzymo1.17Pt.B,SulfurAminoacids,pp.400—405(1971))禾口ShapiroSK(Biochim.Biophys.Acta.29405-9(1958))所述的S-腺苷甲硫氨酸L_高半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶。還可以使用由具有下列GenBank登記號AM97394的核酸編碼的高半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶(EC2.1.1.10)和具有下列GenBank登記號的氨基酸序列AAG10301，CAA16035,NP_856132,NP_302039,CAD97346,T51939，T51941和CAC30似8。優(yōu)選地，可以使用來源于大腸桿菌的SAM-依賴性高半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶(Thanbichler等，J.Bacteriol.,181(2):662-5(1999))或來源于酵母菌的SAM-依賴性高半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶(Siapiro等，J.Biol.Chem.，239(5)1551-6(1964)和Thomas等，JBiol.Chem.,275(52):40718-24(2000))可以以任何適當(dāng)形式使用SAM。例如，將SAM直接加入樣品。在另一實施例中，通過另外的反應(yīng)生產(chǎn)SAM，例如通過SAM合酶由ATP和Met生產(chǎn)SAM。可以使用本領(lǐng)域已知的任何方法評估SAH。例如，可以使用與SAH特異性結(jié)合的抗體來評估SAH?？贵w可以是單克隆的或多克隆的。與SAH特異結(jié)合的抗體的實例在美國專利號5，631，127和6，063，581中描述。使用本領(lǐng)域已知的方法也可以生產(chǎn)對SAH特異性的抗體，所述方法例如在美國專利5，631，127和6，063，581中描述的方法。使用SAH特異性的抗體，可以將任何免疫學(xué)測定用于檢測SAH，例如在溶液中或在固體載體上的競爭性或夾層測定，沉淀/聚集測定。在一些實施方案中，通過將與SAM-依賴性高半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)的樣品在SAM的存在下，與SAH特異性抗體和與不同于SAH的抗體的可檢測的半抗原接觸來評估SAH，其中測定SAH的存在或數(shù)量是通過確定或者與所述抗體結(jié)合或者未與所述抗體結(jié)合的所述可檢測的半抗原的存在或數(shù)量來間接進(jìn)行的。在一些實施方案中，所述抗體與載體基質(zhì)結(jié)合。[0072]還可以使用突變型SAH水解酶評估SAH，該突變型SAH水解酶具有對SAH的結(jié)合親和力但是具有減弱的催化活性。這些突變型SAH水解酶和使用突變型SAH水解酶的測定方法在美國專利號6，376，210和W003/060478中描述。SAH還可以如下評估通過SAH水解酶將SAH轉(zhuǎn)化為腺苷和Hcy，并且評估生成的腺苷。在一些實施方案中，SAH與SAH水解酶接觸以由SAM生成Hcy和腺苷(Ado)，所述Hcy通過SAM-依賴性高半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶循環(huán)至所述Hcy轉(zhuǎn)化反應(yīng)中以形成基于Hcy共底物的酶循環(huán)反應(yīng)體系，評估所述Ado以確定樣品中Hcy的存在、不存在和/或數(shù)量。在一些實施方案中，本發(fā)明提供一種用于測定樣品中的高半胱氨酸的方法，該方法包含a)如果存在于樣品中，使用甲基供體(例如S-腺苷甲硫氨酸(SAM))和SAM-依賴性高半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶將高半胱氨酸甲基化，以形成甲硫氨酸和S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAH)；b)從所述形成的SAH中釋放腺苷(Ado)并使用酶S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶生成高半胱氨酸；和c)評估所述釋放的Ado以確定所述樣品中高半胱氨酸的存在和/或數(shù)量。該方法可以另外包括測量Ado隨時間的釋放量。優(yōu)選地，循環(huán)步驟a)和b)以釋放所述Ado，其釋放速率可以與樣品中的高半胱氨酸的濃度相關(guān)聯(lián)。還優(yōu)選地，Ado的釋放速率與標(biāo)準(zhǔn)的高半胱氨酸的濃度值相關(guān)聯(lián)?？梢允褂萌魏芜m當(dāng)?shù)募谆w和甲基轉(zhuǎn)移酶。例如，甲基供體可以是SAM并且甲基酶可以是SAM-依賴性高半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶。優(yōu)選地，所述甲基供體SAM是以至少約5μM的濃度提供。Ado形成的速率可以使用任何適當(dāng)?shù)姆椒y量。例如，Ado形成的速率可以用酶法測量。優(yōu)選地，Ado形成的速率是使用以下酶測量的Ado脫氨酶，谷氨酸脫氫酶，嘌呤核苷磷酸化酶，黃嘌呤氧化酶，過氧化物酶，腺苷激酶，或這些酶的任何兩項或多項的組合。這些測定方法在本文中進(jìn)一步描述。可以以任何適當(dāng)形式使用SAM。例如，將SAM直接加入樣品。在另一實施例中，通過另外的反應(yīng)生產(chǎn)SAM，例如通過SAM合酶由ATP和Met生產(chǎn)SAM?？梢允褂萌魏蜸AH水解酶。例如，可以使用含有GenBank登記號為M61831-61832的核苷酸序列的核酸分子以獲得編碼SAH水解酶的核酸(參見Coulter-Karis和Hershfield,Ann.Hum.Genet.,53(2)169-175(1989))。還優(yōu)選地，含有核苷酸序列或編碼在美國專利號5，854，023中描述的氨基酸的核酸分子可以用于獲得SAH水解酶?？梢允褂酶鞣N還原劑(例如DTT，TCEP，半胱氨酸，巰基乙醇，二硫赤蘚糖醇，硼氫化鈉等)，然而DTT是特別適當(dāng)?shù)?，例如濃度為約5mM。DTT本身應(yīng)當(dāng)貯存在低pH下，因此測定試劑盒可以便利地包括低PH(例如約3)、但是具有低緩沖能力的DTT溶液和分開的SAH-水解酶溶液，其在基本上中性pH下可以部分或完全無活性并且優(yōu)選是緩沖過的。當(dāng)這些溶液合并時，酶在中性PH下被再活化。如果需要該合并可以在試驗樣品的存在下進(jìn)行，或者試驗樣品在其后不久加入。以上提及的其它還原劑可以類似地用于SAH-水解酶的穩(wěn)定化/活化。TCEP可以貯存在中性pH下，這允許酶與還原劑包括在相同試劑中。Ado可以通過本領(lǐng)域已知的任何適當(dāng)方法評估，所述方法如免疫學(xué)方法或酶促方法?？梢允褂猛ǔＲ蕾囉诠舛扔?例如比色、分光光度計或熒光)檢測的方法和免疫學(xué)方法，因為這些可以特別容易地適用于臨床實驗室使用。還可以使用基于酶促反應(yīng)或與單-或多-克隆抗體的反應(yīng)的方法，因為這些方法簡單和快速并且實行起來相對便宜。例如，通過監(jiān)視與酶的反應(yīng)可以評估Ado，該酶將其直接或間接轉(zhuǎn)化為可以用光度計(例如分光光度計法)檢測的產(chǎn)物。適當(dāng)?shù)拿府?dāng)然應(yīng)當(dāng)不與高半胱氨酸轉(zhuǎn)化酶的其它底物(特別是高半胱氨酸)反應(yīng)，該適當(dāng)?shù)拿赴ㄏ佘彰摪泵?其將腺苷轉(zhuǎn)化為肌苷)和腺苷激酶(其將腺苷和ATP轉(zhuǎn)化為ADP和磷酸化腺苷)。這些酶可以另外與用于將形成的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為另外的可檢測的產(chǎn)物的其它酶組合。因此，用于本發(fā)明測定的例舉性的Ado檢測方案包括腺苷一FPIA檢測+熒光標(biāo)記的腺苷(1)腺苷一肌苷+NH3(2)α-酮戊二酸+NH3+NAD(P)H—L-谷氨酸+NAD(P)+(2a)肌苷一次黃嘌呤(沘1)次黃嘌呤+—黃嘌呤+(2b2)黃嘌呤+—尿酸+(2b3)2H202+4-AA(氨基安替比林)+T00S(N-乙基-N_(2_羥基_3_磺基丙基)_間-甲苯胺)—醌染料+4H20(2b4)腺苷+ATP—腺苷_5'-P+ADP(3)磷酸烯醇丙酮酸+ADP+H+—丙酮酸+ATP(3a)丙酮酸+NADH—乳酸+NAD+(3b)在方案(1)中，進(jìn)行免疫測定，可以檢測熒光標(biāo)記的腺苷。在方案O)中，通過腺苷脫氨酶催化反應(yīng)，腺苷脫氨酶反應(yīng)生成的氨可以容易地使用已知方法例如比色技術(shù)檢測。因此，例如在樣品中生成的氨可以反應(yīng)形成有色產(chǎn)物，其形成可以通過分光光度計法檢測。在方案Qa)中，通過L-谷氨酸脫氫酶催化反應(yīng)，可以在340nm下用分光光度計法檢測NAD(P)+。在方案Qbl)中，通過嘌呤核苷磷酸化酶催化。在方案(2)和中，通過黃嘌呤氧化酶催化反應(yīng)。在方案中，通過過氧化物酶催化反應(yīng)。肌苷和尿酸具有不同的UV吸收性質(zhì)，因此可以用分光光度計法通過動態(tài)測量監(jiān)視。然而，尿酸或肌苷的UV檢測的使用具有某些限制，因為該方法的靈敏性是相當(dāng)差的并且其需要UV-光源和UV-透明的樣品容器。因此可以更便利地依賴于550nm處的醌染料的比色檢測。備選地，在方案Qb)中；黃嘌呤氧化酶反應(yīng)使得其本身使用熒光團或生色團例如氧化還原指示劑檢測，該檢測通過評估還原/氧化電勢或通過測量化消耗，或者更具體地測量H2A形成，例如通過使用電子傳感器進(jìn)行。許多氧化-還原指示劑可以用于該目的，在文獻(xiàn)中描述了各種各樣的方法用于測定溶液中的H2A和02。實際上，在臨床測定中經(jīng)常檢測Η202。例如過氧化氫也可以使用peroxioxalate和吖啶鐺酯的非酶促化學(xué)發(fā)光反應(yīng)來評估，后者在中性PH下在水溶液中。在方案(3)中，通過腺苷激酶催化反應(yīng)。在方案(3a)中，通過丙酮酸激酶催化反應(yīng)。在方案(3b)中，通過乳酸脫氫酶催化反應(yīng)。在方案(3b)中中生成的NAD(P)+可以通過分光光度計法在340nm下檢測。任何腺苷脫氨酶可以用于方案O)。例如，可以使用來源于牛脾的腺苷脫氨酶(Sigma-Aldrich目錄號A5168，6648和504，來源于小牛腸粘膜的腺苷脫氨酶(Sigma-Aldrich目錄號01898，A9876和A1030)或來源于人紅細(xì)胞的人腺苷脫氨酶(Sigma-Aldrich目錄號BCR647)。在另一實施例中，可以使用由核酸編碼的腺苷脫氨酶，該核酸的GenBank登記號是U76422(人類，還參見Lai，等，Mol.Cell.Biol.,17(5)2413-24(1997))ο可以將任何嘌呤核苷磷酸化酶用于方案Qb)。例如，可以使用由具有下列GenBank登記號的核酸編碼的嘌呤核苷磷酸化酶U88529(大腸桿菌)；似4438(大腸桿菌，還參見Cornell和Riscoe，Biochim.Biophys.Acta,1396(1):8-14(1998))；U83703(H.pylori)；和M30469(大腸桿菌)。可以將任何黃嘌呤氧化酶用于方案Ob)。例如，可以使用由具有下列GenBank登記號的核酸編碼的黃嘌呤氧化酶AF080548(苜蓿根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti))；和U39487(人類，還參見Saksela和Raivio，Biochem.J.,315(1):235-9(1996))可以將任何腺苷激酶用于方案(3)。例如，可以使用由具有下列GenBank登記號的核酸編碼的腺苷激酶NM_006721(Homosapiens)；NM_001532(Homosapiens)；NM_001123(Homosapiens)；NM_021129(Homosapiens)；禾口BC003568(Homosapiens)。還可以使用在美國專利號5,861,294,McNally等，Biochem.Biophys.Res.Commun.231645-650(1997)，和Singh等，Eur.J.Biochem.241:564-571(1996)中公開的腺苷激酶。可以將任何谷氨酸脫氫酶用于方案Qa)。例如，可以使用在Perez-deIaMora等，Anal.Biochem.,180(2):248-52(1989)和Gore，Int.J.Biochem.,13(8):879-86(1981)中公開的谷氨酸(glutamate)脫氫酶(或谷氨酸(glutamicacid)脫氫酶)?？梢詫⑷魏伪峒っ赣糜诜桨?3a)。例如，可以使用來源于豬的丙酮酸激酶(Sigma-Aldrich目錄號K4388)，來源于嗜熱脂肪芽孢桿菌(Baci1lusstearothermophilus)(Sigma-Aldrich目錄號P1903)，來源于雞肌肉的丙酮酸激酶(Sigma-Aldrich目錄號P5788)和來源于兔肌肉的丙酮酸激酶(Sigma-Aldrich目錄號83330)。可以將任何乳酸脫氫酶用于方案(3b)。例如，可以使用來源于人的乳酸脫氫酶(Sigma-Aldrich目錄號BCR404)，來源于德氏乳桿菌乳亞種(Lactobacillusleichmanii)的乳酸脫氫酶(Sigma-Aldrich目錄號61306)，來源于乳酸桿菌屬(Lactobacillussp)的乳酸脫氫酶(Sigma-Aldrich目錄號59023)和來源于兔肌肉的乳酸脫氫酶(Sigma-Aldrich目錄號61311)。本文所述的方法可以用于評估任何樣品，例如體液或生物組織。例舉性的體液包括尿，血液，血漿，血清，唾液，精液，糞便，痰液，腦脊髓液，淚液，粘液，和羊膜液。優(yōu)選地，測定的體液是血液。血樣可以直接測定或者在測定前處理。例如，血樣可以進(jìn)一步分成血漿或血清級分。在所述樣品與Hcy共底物和Hcy轉(zhuǎn)化酶接觸之前或同時，將樣品中氧化的或偶聯(lián)的Hcy轉(zhuǎn)化為還原型Hcy。在血漿或尿中，顯著部分的存在的高半胱氨酸可能通過二硫鍵與循環(huán)蛋白如清蛋白結(jié)合，高半胱氨酸還可以以其它二硫化物衍生物的形式存在(通常為高半胱氨酸一半胱氨酸偶聯(lián)物)。為了獲得對樣品中存在的總高半胱氨酸的評估，因此可以理想的用還原劑處理樣品以裂解二硫鍵和釋放游離的高半胱氨酸?？梢允褂萌魏芜m當(dāng)?shù)倪€原劑。二硫化物容易和特別地被硫醇類還原(例如三-正丁基膦(TBP)，二硫蘇糖醇(DTT)，二硫赤蘚糖醇(DTE)，2-巰基-乙醇，半胱氨酸-巰基乙酸鹽(酯)，巰基乙酸，三(2-羧乙基)膦，游離金屬，谷胱甘肽和類似的化合物)?？梢允褂?3氫硼化物(例如氫硼化鈉)或汞齊(例如鈉汞齊)，或者可以使用更專用的試劑如膦或硫代磷酸酯實現(xiàn)直接化學(xué)還原。二硫化物還原在MethodsofEnzymology143=243-256(1987)中由Jocelyn綜述，其中列舉了各種各樣的適當(dāng)?shù)倪€原劑。還原劑還可以是三(2_羧乙基)-膦鹽酸鹽(TCEP)。優(yōu)選地，以高達(dá)約30mM的濃度提供二硫蘇糖醇或TCEP。本發(fā)明的方法可以另外包含去除在將樣品與Hcy共底物和Hcy轉(zhuǎn)化酶接觸之前或同時用于將氧化的或偶聯(lián)的Hcy轉(zhuǎn)化為還原型Hcy的還原劑的步驟。例如，通過加入N-乙基馬來酰亞胺或其它硫-反應(yīng)化合物可以去除還原劑。C.測定高半胱氨酸的試劑盒在另一方面，本發(fā)明涉及用于測定樣品中Hcy的試劑盒，該試劑盒包含a)HCy轉(zhuǎn)化酶；b)Hcy共底物；和c)用于評估Hcy共底物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的試劑。在一些實施方案中，所述Hcy共底物是S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，所述Hcy轉(zhuǎn)化酶是S-腺苷甲硫氨酸(SAM)-依賴性高半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶，所述Hcy共底物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物是S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAH)。在一些實施方案中，用于評估Hcy共底物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物SAH的試劑是與SAH特異性結(jié)合的抗體。在另一方面，本發(fā)明涉及一種測定樣品中的Hcy的試劑盒，該試劑盒包含a)S-腺苷甲硫氨酸(SAM)-依賴性高半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶；b)S-腺苷甲硫氨酸(SAM)或ATP，Met和SAM合酶；c)SAH水解酶；和d)用于評估腺苷(Ado)的試劑。在還有另一方面，本發(fā)明涉及一種測定樣品中的Hcy的試劑盒，該試劑盒包含a)S-腺苷甲硫氨酸(SAM)-依賴性高半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶；b)S-腺苷甲硫氨酸(SAM)或ATP，Met和SAM合酶；和c)用于評估SAH的試劑，其中所述試劑盒不包含用于生成H2A的酶或試劑和用于檢測H2A的試劑。在一些實施方案中，用于評估Ado的試劑包含不同于SAH水解酶的腺苷轉(zhuǎn)化酶。在一些實施方案中，腺苷轉(zhuǎn)化酶是腺苷激酶。在其它實施方案中，腺苷轉(zhuǎn)化酶是腺苷脫氨酶。本文所述的試劑盒可以另外包含還原劑，例如二硫蘇糖醇或三(2-羧乙基)-膦鹽酸鹽(TCEP)。本發(fā)明的試劑盒可以是任何適當(dāng)包裝。例如，本文所討論的涉及診斷系統(tǒng)的包裝是通常用于診斷系統(tǒng)的那些。這些包裝包括玻璃和塑料，如聚乙烯，聚丙烯和聚碳酸酯，瓶子和小瓶，塑料和塑料-箔層壓的包膜等。這些包裝還可以包括適用于自動分析儀使用的容器。包裝典型地包括用于進(jìn)行本文所述測定的使用說明。D.實施例包括下列實施例僅僅是用于舉例說明的目的而不是意欲限制本發(fā)明的范圍。實施例1.GLDH-NADH偶聯(lián)以檢測通過使用純化的SAM的酶促循環(huán)生成的NH4+在本研究中，使用下列偶聯(lián)的酶促循環(huán)反應(yīng)SAM+t^y—SAH+甲硫氨酸(1)SAH—‘苷+Hcy~~~(2)腺苷一肌苷+NH4+(3)NH4++α-酮戊二酸+NAD(P)H—谷氨酸+NAD(P)(4)在方案(1)中，通過SAM-依賴性高半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶催化反應(yīng)。在方案(2)中，通過SAH水解酶催化反應(yīng)。在方案(3)中，通過腺苷脫氨酶催化反應(yīng)。在方案中，通過L-谷氨酸脫氫酶催化反應(yīng)。通過分光光度計法在340nm下檢測NAD(P)+。用于本研究的試劑的更詳細(xì)的描述在下表1和2中列出。表1.試劑1的組成權(quán)利要求1.Hcy共底物、Hcy轉(zhuǎn)化酶和SAH水解酶在制備測定樣品中的高半胱氨酸(Hcy)的試劑盒中的應(yīng)用，其中a)所述Hcy共底物和Hcy轉(zhuǎn)化酶是用于在Hcy轉(zhuǎn)化反應(yīng)中與含有或懷疑含有Hcy的樣品接觸以形成Hcy轉(zhuǎn)化產(chǎn)物和Hcy共底物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，其中所述Hcy共底物是S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，所述Hcy轉(zhuǎn)化酶是S-腺苷甲硫氨酸(SAM)-依賴性高半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶，所述Hcy轉(zhuǎn)化產(chǎn)物是甲硫氨酸(Met)并且所述Hcy共底物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物是S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAH)；b)所述SAH水解酶是用于與以上(a)中產(chǎn)生的所述SAH接觸以產(chǎn)生Hcy和腺苷(Ado)，所述Hcy是用于通過SAM-依賴性高半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶循環(huán)至所述Hcy轉(zhuǎn)化反應(yīng)中以形成基于Hcy共底物的酶循環(huán)反應(yīng)體系，所述Ado是用于被評估以確定樣品中Hcy的存在、不存在和/或數(shù)量。2.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述Ado被用于與腺苷轉(zhuǎn)化酶而非SAH水解酶接觸來評估Ado。3.權(quán)利要求2的應(yīng)用，其中通過評估所述腺苷轉(zhuǎn)化酶的腺苷轉(zhuǎn)化的共底物或反應(yīng)產(chǎn)物來間接進(jìn)行所述Ado的評估。4.權(quán)利要求3的應(yīng)用，其中所述腺苷轉(zhuǎn)化酶是腺苷激酶。5.權(quán)利要求3的應(yīng)用，其中所述腺苷轉(zhuǎn)化酶是腺苷脫氨酶。6.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述樣品是體液或生物組織。7.權(quán)利要求6的應(yīng)用，其中所述體液選自由下列各項組成的組尿，血液，血漿，血清，唾液，精液，糞便，痰液，腦脊髓液，淚液，粘液，和羊膜液。8.權(quán)利要求6的應(yīng)用，其中所述體液是血液。9.權(quán)利要求8的應(yīng)用，其中所述血液被進(jìn)一步分成血漿或血清級分。10.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中在所述樣品與Hcy共底物和Hcy轉(zhuǎn)化酶接觸之前或同時，樣品中氧化的或偶聯(lián)的Hcy被轉(zhuǎn)化為還原型Hey。11.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中在沒有色譜分離的情況下評估所述Ado。12.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述SAM是用于加入所述樣品中。13.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中通過SAM合酶由ATP和Met生成所述SAM。14.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中在沒有色譜分離的情況下測定樣品中的高半胱氨酸。15.一種測定樣品中的Hcy的試劑盒，該試劑盒包含a)S-腺苷甲硫氨酸(SAM)-依賴性高半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶；b)S-腺苷甲硫氨酸(SAM)；或ATP，Met和SAM合酶；c)SAH水解酶；和d)用于評估腺苷(Ado)的試劑。16.權(quán)利要求15的試劑盒，其中用于評估Ado的試劑包含腺苷轉(zhuǎn)化酶而非SAH水解酶。17.權(quán)利要求16的試劑盒，其中所述腺苷轉(zhuǎn)化酶是腺苷激酶或腺苷脫氨酶。18.權(quán)利要求15的試劑盒，其還包含實施評估樣品中高半胱氨酸(Hcy)的方法的說明書，所述方法包括a)在Hcy轉(zhuǎn)化反應(yīng)中將含有或懷疑含有Hcy的樣品與Hcy共底物和Hcy轉(zhuǎn)化酶接觸以形成Hcy轉(zhuǎn)化產(chǎn)物和Hcy共底物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，其中所述Hcy共底物是S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，所述Hcy轉(zhuǎn)化酶是S-腺苷甲硫氨酸(SAM)-依賴性高半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶，所述Hcy轉(zhuǎn)化產(chǎn)物是甲硫氨酸(Met)并且所述Hcy共底物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物是S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAH)；b)將步驟(a)中產(chǎn)生的所述SAH與SAH水解酶接觸以產(chǎn)生Hcy和腺苷(Ado)，所述Hcy通過SAM-依賴性高半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶循環(huán)至所述Hcy轉(zhuǎn)化反應(yīng)中以形成基于Hcy共底物的酶循環(huán)反應(yīng)體系，評估所述Ado以確定樣品中Hcy的存在、不存在和/或數(shù)量。19.權(quán)利要求15的試劑盒，其中在容器中包裝S-腺苷甲硫氨酸(SAM)-依賴性高半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶，S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，ATP,Met,SAM合酶，SAH水解酶和/或評估腺苷(Ado)的試劑中的至少一個。20.權(quán)利要求19的試劑盒，其中所述容器是玻璃或塑料容器。專利摘要本發(fā)明一般涉及高半胱氨酸檢測領(lǐng)域。特別是，本發(fā)明提供一種測定樣品中高半胱氨酸的存在或濃度的方法，該方法包含在Hcy轉(zhuǎn)化反應(yīng)中將含有或懷疑含有Hcy的樣品與Hcy共底物和Hcy轉(zhuǎn)化酶接觸以形成Hcy轉(zhuǎn)化產(chǎn)物和Hcy共底物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物；和評估Hcy共底物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物以確定樣品中Hcy的存在、不存在和/或數(shù)量。本發(fā)明還提供了基于相同原理測定高半胱氨酸的試劑盒。文檔編號C12Q1/48GKCN1849513B發(fā)布類型授權(quán)專利申請?zhí)朇N200480026009公開日2011年9月21日申請日期2004年7月9日發(fā)明者A·達(dá)塔,竇超,袁崇生申請人:通用原子公司導(dǎo)出引文BiBTeX,EndNote,RefMan非專利引用(1),