專利名稱：快速檢測水溶液中半胱氨酸的方法
快速檢測水溶液中半胱氨酸的方法技術(shù)領(lǐng)域-本發(fā)明涉及半胱氨酸檢測技術(shù)，具體屬于一種快速檢測水溶液中半胱氨酸的方法，包括 檢測試劑盒及檢測試紙。
技術(shù)背景-半胱氨酸(Cysteine,簡稱Cys )是一個重要的硫代化合物氨基酸，參與了各種重要的 細(xì)胞功能，包括蛋白質(zhì)的合成、解毒和代謝；在生物的新陳代謝中，半胱氨酸參與細(xì)胞的還 原過程，具有調(diào)節(jié)肝臟內(nèi)磷脂的代謝和保護(hù)肝臟細(xì)胞免受毒物損害等功能。紊亂的半胱氨酸 的代謝會導(dǎo)致胱氨酸病——一種染色體隱性遺傳疾病所產(chǎn)生的缺陷病。體內(nèi)半胱氨酸含量的 增多與高同型半胱氨酸血癥相牽連，會引起一些威脅生命的生理疾病，包括阿爾茨海默氏癥(老年癡呆癥李滎娟，閆福嶺，觀/f度學(xué)，2005， 33， 195)、帕金森氏病(王文霞，臧衛(wèi) 周，馮艷，徐軍，,齊訟沄染岳，2005， 9， 20)及心腦血管疾病(周憲梁，胡愛華，惠汰太 等.^舉A虛^^^^"， 1999， 27 ， 121)。低水平的半胱氨酸將導(dǎo)致發(fā)育緩慢，頭發(fā)色素 脫失，肌肉水腫，精神不振嗜睡，肝損傷等病狀，因此建立快速、準(zhǔn)確、靈敏的半胱氨酸的 檢測方法具有重要的意義，也是預(yù)防和監(jiān)測由它們所引發(fā)的疾病的重要措施之一。目前，關(guān)于測定溶液中的半胱氨酸，國內(nèi)外對檢測溶液中的半胱氨酸的方法可歸納為以 下幾種1、 高效液相色譜測定法((G. Chwatko， E. Bald， 7^朋ta' 2000， 52, 509);2、 電化學(xué)測定法(杜寶中，姚秉華，薛力等.分必:矜學(xué)學(xué)/^， 2004, 20， 622);3、 化學(xué)發(fā)光法(張韶虹，史伯安，郗娟，分橋宴'避皇，2007， 26， 5);4、 酶法(韓慶宏，徐明旭，譚玉英，唐莉，中國發(fā)明專利，02823051.5.);5、 熒光光譜測定方法(邱海鷗，席永清，曾凡蓉，楊明，湯志勇，i^^^^^"， 2006， 25， 34)6、 比色檢測分析方法(郭勇，邵士俊，蔣生祥，師彥平，徐健，中國發(fā)明專利， 200410092788.X)但以上的這些方法都分別存在一些不利因素，例如1、高效液相色譜、電化學(xué)測定法需要借助復(fù)雜的儀器，且需要預(yù)處理標(biāo)本且不能全自動 化，操作復(fù)雜，費時費力，限制了其在臨床上的應(yīng)用；2、酶免法雖然有較好的靈敏性和特異性，但因為是生物制劑，價格昂貴，亦限制了其推廣應(yīng)用；3、其他的分析法因為要在有機(jī)或半水溶液中進(jìn)行測定，容易造成二次污染，因此也存在 一定的局限性。所以，發(fā)展一種簡單靈敏的水溶液中檢測半胱氨酸的方法是非常必要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于突破以往傳統(tǒng)的檢測半胱氨酸的方法，提供一種簡單、靈敏、快速的 檢測水溶液中半胱氨酸的方法。本發(fā)明提供的快速檢測水溶液中半胱氨酸的方法，是基于二價銅Cu2+離子、以二甲酚橙為 顯色劑在pH為6. 0的HEPES緩沖溶液中直接定性定量地檢測半胱氨酸，其具體檢測方法如下本發(fā)明提供的一種快速檢測水溶液中半胱氨酸的方法(光譜法檢測)，包括如下步驟 (1 )、配制pH5. 5-6. 5濃度1-100 mM的HEPES緩沖溶液，并配制2 X 10—3M的Cu"溶液、 2X10—、的二甲酚橙溶液；(2) 、把2 ml的HEPES緩沖溶液加到干凈的紫外比色皿中，作為空白，用微量進(jìn)樣器吸 取2X10—3M的二甲酚橙溶液25 pl，加到上述比色皿中，此時溶液由無色變黃，在紫外可見 分光光度儀上檢測，441 nm有最大吸收；(3) 、在歩驟(2)的比色皿中，加入與二甲酚橙等量的Cu2+溶液，此時溶液由黃變紫紅， 在紫外可見分光光度儀上檢測，發(fā)現(xiàn)最大吸收峰由上述的441 nm變?yōu)?72 nm;(4) 、取半胱氨酸水溶液，逐漸用微量進(jìn)樣器加到步驟(3)比色皿中，邊加樣邊在紫外 可見分光光度儀上檢測，隨著半胱氨酸水溶液的加入，最大吸收峰又由572 nm逐漸向441 nm 變回，溶液的顏色也逐漸由紫紅變回黃色，此時441nm吸收峰達(dá)到最大值，停止加半胱氨酸 水溶液，此時加入半胱氨酸水溶液體積計為V M;(5) 、按[Cu2+]X4X25 yl / V滿酸u 1計算出半胱氨酸的含量。 本發(fā)明提供的另一種快速檢測水溶液中半胱氨酸的方法(溶液比色法-試劑盒法)，包括如下步驟(1 )、配制pH5. 5-6. 5濃度H00 mM的HEPES緩沖溶液，并配制2 X 10-:,M的0]2+溶液、2 X10—3M的二甲酚橙溶液；(2) 、取干凈的兩個比色管，各加2 ml的HEPES緩沖溶液，再用微量進(jìn)樣器各加入2X 10"M的二甲酚橙溶液25 ul ，此時溶液由無色變黃，記為&、 R2;(3) 、在R2中加入2X10—3M的Cu2+溶液25 w 1 ,此時溶液由黃變紫紅；(4) 、取半胱氨酸水溶液，逐漸用微量進(jìn)樣器加到R2中，加至顏色與R,相同，所半胱氨 酸水溶液體積計為V 半胱站酸;(5)、按[C]X4X25 Ul / V半隨酸"l計算出半胱氨酸的含量。本發(fā)明提供的另一種快速檢測水溶液中半胱氨酸的方法(試紙比色法)，包括如下步驟 (1 )、配制pH5. 5-6. 5濃度1-100 mM的服PES緩沖溶液，并配制2X 10—:'M的0:2+溶液、2 X1(T'M的二甲酚橙溶液；(2) 將25 ul的0_12+溶液與25 u 1的二甲酚橙溶液加入至2 ml的HEPES緩沖溶液中， 攪拌均勻后，此時溶液呈紫紅色；(3) 將大塊濾紙浸入步驟(2)的紫紅色溶液中5-10秒，取出在空氣中晾干，反復(fù)浸潤 1-3次，晾干后即成半胱氨酸試紙(顏色呈紫色)，將此試紙剪成條狀備用；(4) 取步驟(3)條狀試紙5條，分別浸潤于濃度為O、 0.01、 0.04、 0.08、 0.1 mM的 半胱氨酸水溶液中2-5秒，取出，即得到依次呈紫色(空白)、紫紅色(0.01mM)、紫黃色(0.04 mM)、 土黃色(0.08 mM)和金黃色(0.1 mM)的半胱氨酸試紙濃度梯度色階圖；(5) 取半胱氨酸試紙浸潤于待測樣中2-5秒取出，根據(jù)試紙顏色變化與半胱氨酸濃度梯 度色階圖對比，判定待測樣半胱氨酸的含量。所述的Cu"溶液是用可溶性二價銅鹽如氯化銅、醋酸銅、硫酸銅、硝酸銅、高氯酸銅、葡 萄糖酸銅等配制而成。所述的HEPES緩沖溶液可以用醋酸一醋酸鈉緩沖溶液、磷酸鈉緩沖溶液或磷酸鉀緩沖溶液。本發(fā)明快速檢測水溶液中半胱氨酸的方法，也可以用于同型半胱氨酸快速檢測。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點和效果1、本發(fā)明是在純水溶液中檢測半胱氨酸， 避免了使用有機(jī)或半水溶液檢測可能造成的二次污染，有益于環(huán)保和健康；2、本發(fā)明的檢測 體系制作成本較低，利用紫外分光光度儀，甚至可以不用任何儀器通過目視比色直接檢測， 檢測過程簡單、靈敏、快速；3、本發(fā)明的檢測方法，對半胱氨酸顯示了極高的靈敏性和選擇 性，其它氨基酸的存在不干擾檢測結(jié)果；4、在體液中廣泛存在的各種陰離子對我們的體系亦 沒有干擾，排除了它們對半胱氨酸定性定量檢測的影響；5、半胱氨酸的檢測是定量的，有很 大的線性范圍，而且誤差很??；6、本發(fā)明所提供的半胱氨酸試紙，使用方便，判別快速簡潔， 價格低廉，易于普及，適合大、中、小型醫(yī)院和診所日常檢測，有很廣的適用范圍。


圖1是在含有25 uM二甲酚橙，pH6. 0 HEPES(IO mM)緩沖溶液中逐漸加入Cu"的紫外可 見吸收圖。圖2是在含有25 yM二甲酚橙和25 yM Cu (N0:i) 2'3H20， pH6. 0 HEPES(IO mM)緩沖溶 液中逐漸加入半胱氨酸的紫外可見吸收圖。圖3是在含有25 u M 二甲酚橙和25 y M Cu 液中逐漸加入半胱氨酸的比色可視圖。圖4是在含有25 uM二甲酚橙和25 pMCu 液中加入待測樣品的比色可視圖。圖5是在含有25 liM二甲酚橙和25 uMCu 液中加入各種氨基酸的紫外可見吸收圖。圖6是在含有25 nM二甲酚橙和25 yMCu 液中加入各種陰離子的紫外可見吸收圖。圖7是在含有25 uM二甲酚橙和25 uMCu 液中加入各種氨基酸的比色可視圖。圖8是在含有25 uM二甲酚橙和25 pMCu 液中加入各種陰離子的比色可視圖。圖9是在含有25 uM二甲酚橙和25 nMCu 液中逐漸加入同型半胱氨酸的紫外可見吸收圖。圖10是在含有25 uM二甲酚橙和25 pMCu 液中加入大量同型半胱氨酸的比色可視圖。圖11是半胱氨酸試紙濃度梯度色階圖。
具體實施例方式實施例1:光譜法快速檢測水溶液中半胱氨酸的方法配制pH6. 0的HEPES (10 mM)緩沖水溶液，并配制2 X 10—3 M的硝酸銅水溶液、2 X l(T M的 二甲酚橙水溶液和2X 10—3 M的半胱氨酸水溶液；把2 mL的HEPES緩沖溶液加到干凈的紫外 比色皿中，作為空白，用微量進(jìn)樣器吸取2X10—1的二甲酚橙溶液25 txl ，加到此比色皿 中，此時溶液由無色變黃，在紫外可見分光光度儀上檢測，441 nm有最大吸收；在上述的比 色皿中，加入2X10—3M的硝酸銅溶液25 ul ，此時溶液由黃色變紫紅色，在紫外可見分光 光度儀上檢測，發(fā)現(xiàn)最大吸收峰由上述的441 nra變?yōu)?72 nm，紫外可見吸收光譜見圖l;取 半胱氨酸水溶液，逐漸用微量進(jìn)樣器加到此比色皿中，邊加樣邊在HP8453紫外可見分光光度 儀上檢測，隨著半胱氨酸的加入，最大吸收峰又由572 nm逐漸向441 nm變回，溶液的顏色 也逐漸由紫紅色變回黃色，當(dāng)吸收峰在441 nm達(dá)到最大時，此時半胱氨酸加入量為100 P 1; 計算2X10—:iX 100 y 1/2X1(TX25 u 1 = 4，計算確定半胱氨酸與銅離子配位比為4比1; 紫外可見吸收圖見圖2。半胱氨酸的含量按[C]X4X25 ul / V半隨酸ul計算得出。實施例2:溶液比色法(試劑盒法)快速檢測水溶液中半胱氨酸的方法(NO:,) 23H20， p服.0(N03) 2 3H20， p服.0(N0:!) 23H20， pH6, 0(N03) 2 3H20， p朋.0(N0:!) 23H20， p朋.O(N03) 2 3H20， pH6. 0(N0:i) 2.3H20， pH6. 0(N0:!) 2'3H20， p服.0HEPES (10 mM)緩沖溶HEPES (10 mM)'緩沖溶HEPES (10 raM)緩沖溶HEPES (10 raM)緩沖溶HEPES (10 mM)緩沖溶HEPES (10 mM)緩沖溶HEPES (10 mM)緩沖溶HEPES (10 mM)緩沖溶試劑盒制備配制p服.0的HEPES (10 mM)緩沖水溶液，并配制2 X l(T M的硝酸銅水溶液、2 X l(T" M的 二甲酚橙水溶液和2X10—"M的半胱氨酸水溶液；取五個比色管，分別加入2 ral的HEPES緩 沖溶液、25 y 1 2X10—3M的二甲酚橙溶液，此時溶液由無色變黃，記為R,、 R2、 R:,.I^.R5;在 R2、 R:i 、 R4、 R5中加入2X10—、的硝酸銅溶液25 y 1，此時溶液由黃色變紫紅色，分別用微 量進(jìn)樣器吸取35 u 1、 65" 1、 100 u 1半胱氨酸加到R:,、仏、Rs中，比色可視圖見圖3， R:i 、 R4、 R5所代表的半胱氨酸濃度分別為35 uM、 65 u M、 100 u M。未知濃度半胱氨酸測定配制P朋.0的服PES(IO慮)緩沖溶液，并配制2X 10-3 M的Cij2+溶液、2X 10—3 M的二甲酚 橙溶液；取比色管，加入2 ml的服PES緩沖溶液、25 u 1， 2X l(T M的二甲酚橙溶液，此 時溶液由無色變黃，加入2Xl(TM的ar溶液25 ul ，此時溶液由黃色變紫紅色；取待測樣， 用微量進(jìn)樣器加入該比色管，加至顏色與R,相同見圖4，所用體積為V M (ul);按[Cu2+] X4X25 u 1 / V半隨酸y 1計算出半胱氨酸的含量。實施例3:試紙比色法快速檢測水溶液中半胱氨酸的方法配制pH6. 0的HEPES (10 mM)緩沖水溶液，并配制2 X 10-3 M的硝酸銅水溶液、2 X 10—:i M的 二甲酚橙水溶液和濃度為0. 01、 0. 04、 0. 08、 0. 1 mM的半胱氨酸水溶液；將25 n 1的Cu2+ 溶液與25 ti 1的二甲酚橙溶液加入至2 ml的HEPES (10 raM)緩沖溶液中，攪拌均勻后溶液呈 紫紅色，將大塊濾紙浸入該紫紅色溶液中IO秒，取出在空氣中晾干，再反復(fù)浸潤晾干3次即 成可用半胱氨酸試紙，將此試紙剪成條狀待用；取歩驟條狀試紙5條，分別浸潤于濃度為O、 0.01、 0.04、 0.08、 0.1 tnM的半胱氨酸水 溶液中3秒，取出，即得到紫色(空白)、紫紅色(O.OlmM)、紫黃色(0.04mM)、 土黃色(0.08 mM)和金黃色③.1 mM)的半胱氨酸試紙濃度梯度色階圖見圖11;取半胱氨酸試紙浸潤于待測樣中3秒取出，根據(jù)試紙顏色變化與半胱氨酸濃度梯度色階 圖對比，即可判定待測樣半胱氨酸的含量。實施例4:其它氨基酸不干擾光譜法測定半胱氨酸配制p服.0的HEPES (10 mM)緩沖溶液，并配制2 X l(T'M的"2+溶液、2 X 10—3M的二甲酚橙 溶液和0. 1M的甘氨酸(Gly)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、蛋氨酸(Met)、天冬氨酸(Asp)、 精氨酸(Arg)、組氨酸(His)、酪氨酸(Tyr)、賴氨酸(Lys)、色氨酸(Try)、苯丙氨酸(Phe)、 谷氨酰胺(Glu)、亮氨酸(Leu)、纈氨酸(Val)、脯氨酸(Pro)、胱氨酸(Cystine);把2 ml的 冊PES緩沖溶液加到干凈的紫外比色皿中，作為空白，用微量進(jìn)樣器吸取2X10—'M的二甲酚橙溶液25 yl ，加到此比色皿中，此時溶液由無色變黃，在紫外可見分光光度儀上檢測，441 nm有最大吸收；在上述的比色皿中，加入2X10—3M的Cu'2+溶液25 ul ，此時溶液由黃 色變紫紅，在紫外可見分光光度儀上檢測，發(fā)現(xiàn)最大吸收峰441 nm變?yōu)?72 mn;分別取上 述各種氨基酸溶液25 iU，逐個加入到比色皿中，邊加樣邊在紫外可見分光光度儀上檢測， 隨著各種氨基酸的的加入，最大吸收峰為572皿，沒有變化；在上述溶液中加入2X10—'!M的 半胱氨酸溶液IOO ul，溶液顏色由紫紅色變?yōu)辄S色，最大吸收峰由572 nm藍(lán)移至441歷； 紫外可見吸收圖見圖5。實施例5:其它氨基酸不干擾比色測定半胱氨酸配制p服.0的HEPES (10 mM)緩沖溶液，并配制2 X 10—3 M的0/+溶液、2 X l(T M的二甲酚 橙溶液和O. lM的甘氨酸(Gly)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、蛋氨酸(Met)、天冬氨酸(A印)、 精氨酸(Arg)、組氨酸(His)、酪氨酸(Tyr)、賴氨酸(Lys)、色氨酸(Trp)、苯丙氨酸(Phe)、 谷氨酰胺(Glu)、亮氨酸(Leu)、纈氨酸(Val)、脯氨酸(Pro)、胱氨酸(Cystine)、半胱氨酸(Cys); 取18個比色管，分別加入2 ml的服PES緩沖溶液、25 yl 2X M的二甲酚橙溶液、2 Xl(TM的Cu2+溶液25 "1 ，此時溶液由黃變紫紅，取各種氨基酸25 ul，用微量進(jìn)樣器加 到比色管中，比色可視圖見圖7。 (50倍量的其他氨基酸不干擾半胱氨酸的檢測)實施例6:陰離子不干擾紫外可見光譜測定半胱氨酸配制p朋.0的HEPES(IO mM)緩沖溶液，并配制2X l(TM的Cu"容液、2X10—'M的二甲酚 橙溶液和O. 1M的草酸根、醋酸根、硝酸根、碳酸根、磷酸氫根、氟離子、氯離子；把2 ml 的HEPES緩沖溶液加到干凈的紫外比色皿中，作為空白，用微量進(jìn)樣器吸取2X1(TM的二甲 酚橙溶液25 yl ，加到此比色皿中，此時溶液由無色變黃，在紫外可見分光光度儀上檢測， 441 nm有最大吸收；在上述的比色皿中，加入2X l(T M的Cu"容液25 w 1 ，此時溶液由黃 變紫紅，在紫外可見分光光度儀上檢測，發(fā)現(xiàn)最大吸收峰441 nm變?yōu)?72 nm;分別取上述 各種陰離子溶液25 ul，逐個加入到比色皿中，邊加樣邊在紫外可見分光光度儀上檢測，隨 著各種陰離子的的加入，最大吸收峰為572 nm，沒有變化，紫外可見吸收圖見圖6。 (50倍 量的草酸根、醋酸根、硝酸根、碳酸根、磷酸氫根、氟離子、氯離子不干擾半胱氨酸的檢測)實施例7:陰離子不千擾比色測定半胱氨酸配制p朋.0的HEPES (10 mM)緩沖溶液，并配制2 X M的CiT"溶液、2 X 10—:i M的二甲酚橙溶液和O. 1 M的草酸根、醋酸根、硝酸根、碳酸根、磷酸氫根、氟離子、氯離子；取ll各比色管，分別加入2 ml的HEPES緩沖溶液、25 y 1 2X10—3 M的二甲酚橙溶液、2X10—:iM的Cu2+溶液25 ul ，此時溶液由黃變紫紅，取各種陰離子25 yl，用微量進(jìn)樣器加到比色管中，比色可視圖見圖8。實施例8:醋酸一醋酸鈉緩沖溶液的半胱氨酸的檢測配制p服.0的醋酸一醋酸鈉緩沖液，用其替代實施例1中的HEPES緩沖溶液，其他溶液 配制及檢測歩驟與實施例l相同，光譜法檢測紫外可見吸收光譜與圖1、圖2相同；比色法 檢測過程同實施例2，比色圖與圖3相同；實施例9:磷酸納緩沖溶液的半胱氨酸的檢測配制p服.0的0. 1 M磷酸鈉緩沖液溶液，用其替代實施例1中的服PES緩沖溶液，其他 溶液配制及檢測步驟與實施例l相同，光譜法檢測紫外可見吸收光譜與圖,l、圖2相同；比 色法檢測過程同實施例2，比色圖與圖3相同。實施例10:同型半胱氨酸檢測配制pH6. 0的HEPES (10 mM)緩沖溶液，并配制2 X 10—3 M的(^2+溶液、2 X 10—'' M的二甲酚 橙溶液和2X l(TM的同型半胱氨酸水溶液；把2 mL的HEPES緩沖溶液加到干凈的紫外比色皿 中，作為空白，用微量進(jìn)樣器吸取2X10—3M的二甲酚橙溶液25 lil ，加到此比色皿中，此 時溶液由無色變黃，在紫外可見分光光度儀上檢測，441nm有最大吸收；在上述的比色皿中， 加入2Xl(TM的Cu2+溶液25 ul ，此時溶液由黃變紫紅，在紫外可見分光光度儀上檢測， 發(fā)現(xiàn)最大吸收峰由上述的441皿變?yōu)?72 nm，紫外可見吸收光譜見圖1;取同型半胱氨酸， 逐漸用微量進(jìn)樣器加到此比色皿中，邊加樣邊在HP8453紫外可見分光光度儀上檢測，隨著同 型半胱氨酸的加入，最大吸收峰又由572 nm逐漸向441 nm變回，溶液的顏色也逐漸由紫紅 變回黃色，當(dāng)吸收峰在441 nm達(dá)到最大時，此時同型半胱氨酸加入量為320 n 1;計算2 X10—:'X320 y 1 /2X10—:iX25 u 1=12. 8，說明同型半胱氨酸與銅離子的配位關(guān)系不能科學(xué)確 定。雖然同型半胱氨酸也能引起檢測體系紫外吸收光譜和顏色的變化。但鑒于體液中半胱氨 酸的含量是同型半胱氨酸含量的20-30倍，它的存在并不影響此專利體系對半胱氨酸的檢測。 紫外可見吸收圖見圖9。其比色圖見圖IO。
權(quán)利要求
1、一種快速檢測水溶液中半胱氨酸的方法，其特征在于包括如下步驟(1)、配制pH5.5-6.5濃度1-100mM的HEPES緩沖溶液，并配制2×10-3M的Cu2+溶液、2×10-3M的二甲酚橙溶液；(2)、把2ml的HEPES緩沖溶液加到干凈的紫外比色皿中，作為空白，用微量進(jìn)樣器吸取2×10-3M的二甲酚橙溶液25μl，加到上述比色皿中，此時溶液由無色變黃，在紫外可見分光光度儀上檢測，441nm有最大吸收；(3)、在步驟(2)的比色皿中，加入與二甲酚橙等量的Cu2+溶液，此時溶液由黃變紫紅，在紫外可見分光光度儀上檢測，發(fā)現(xiàn)最大吸收峰由上述的441nm變?yōu)?72nm；(4)、取半胱氨酸水溶液，逐漸用微量進(jìn)樣器加到步驟(3)比色皿中，邊加樣邊在紫外可見分光光度儀上檢測，隨著半胱氨酸水溶液的加入，最大吸收峰又由572nm逐漸向441nm變回，溶液的顏色也逐漸由紫紅變回黃色，此時441nm吸收峰達(dá)到最大值，停止加半胱氨酸水溶液，此時加入半胱氨酸水溶液體積計為V半胱氨酸μl；(5)、按[Cu2+]×4×25μl/V半胱氨酸μl計算出半胱氨酸的含量。
2、 一種快速檢測水溶液中半胱氨酸的方法，其特征在于包括如下步驟(1 )、配制pH5. 5-6. 5濃度1-100 mM的HEPES緩沖溶液，并配制2X 10-3M的012+溶液、2 X10—'^的二甲酚橙溶液；(2) 、取干凈的兩個比色管，各加2 ml的HEPES緩沖溶液，再用微量進(jìn)樣器各加入2X 10—3M的二甲酚橙溶液25 "1 ，此時溶液由無色變黃，記為R,、 R2;(3) 、在R2中加入2X10—、的Cu2+溶液25 ul ，此時溶液由黃變紫紅；(4) 、取半胱氨酸水溶液，逐漸用微量進(jìn)樣器加到R2中，加至顏色與Rt相同，所加半胱氨酸水溶液體積計為V半隨ggU 1;(5) 、按[Cu2+]X4X25 ul / V半綠酸ul計算出半胱氨酸的含量。
3、 一種快速檢測水溶液中半胱氨酸的方法，其特征在于包括如下步驟(1) 、配制pH5. 5-6. 5濃度l-100mM的HEPES緩沖溶液，并配制2X 10—:iM的Cu"溶液、2 X1(TM的二甲酚橙溶液；(2) 將25 u 1的0:2+溶液與25 u 1的二甲酚橙溶液加入至2 ml的HEPES緩沖溶液中， 攪拌均勻后，此時溶液呈紫紅色；(3) 將大塊濾紙浸入步驟(2)的紫紅色溶液中5-10秒，取出在空氣中晾干，反復(fù)浸潤 1-3次，晾干后即成半胱氨酸試紙，將此試紙剪成條狀備用；(4) 取步驟(3)條狀試紙5條，分別浸潤于濃度為O、 0.01、 0.04、 0.08、 0. 1 mM的半胱氨酸水溶液中2-5秒，取出，即得到依次呈紫色、紫紅色、紫黃色、土黃色和金黃色的 半胱氨酸試紙濃度梯度色階圖；(5)取半胱氨酸試紙浸潤于待測樣中2-5秒取出，根據(jù)試紙顏色變化與半胱氨酸濃度梯 度色階圖對比，判定待測樣半胱氨酸的含量。
4、 如權(quán)利要求3所述的快速檢測水溶液中半胱氨酸的方法中制得的半胱氨酸試紙。
5、 如權(quán)利要求3所述的快速檢測水溶液中半胱氨酸的方法中制得的半胱氨酸試紙濃度梯 度色階圖。
6、 如權(quán)利要求l、 2或3所述的快速檢測水溶液中半胱氨酸的方法，其特征在于所述的 Cu2+溶液是用可溶性二價銅鹽配制而成。
7、 如權(quán)利要求6所述的快速檢測水溶液中半胱氨酸的方法，其特征在于所述的可溶性二 價銅鹽選自氯化銅、醋酸銅、硫酸銅、硝酸銅、高氯酸銅、葡萄糖酸銅。
8、 如權(quán)利要求l、 2或3所述的快速檢測水溶液中半胱氨酸的方法，其特征在于所述的 HEPES緩沖溶液用醋酸一醋酸鈉緩沖溶液、磷酸鈉緩沖溶液或磷酸鉀緩沖溶液代替。
9、 如權(quán)利要求l、 2或3所述的快速檢測水溶液中半胱氨酸的方法用于同型半胱氨酸快 速檢測。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種快速檢測水溶液中半胱氨酸的方法。該方法基于二價銅Cu²⁺離子、以二甲酚橙為顯色劑在pH為6.0的緩沖溶液中直接定性定量地檢測半胱氨酸的含量，檢測過程簡單，判別直觀方便，易于普及推廣應(yīng)用。該方法測量結(jié)果準(zhǔn)確，靈敏度高，而且不受其它氨基酸、陰離子的干擾，可以推廣應(yīng)用于臨床血樣、尿樣以及食品中半胱氨酸的測定。
文檔編號G01N33/68GK101329279SQ20081005545
公開日2008年12月24日 申請日期2008年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月18日
發(fā)明者孫遠(yuǎn)強(qiáng), 陰彩霞, 霍方俊 申請人:山西大學(xué)