專利名稱:利用氣升式生物反應(yīng)器高效生產(chǎn)高純度花生四烯酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)高純度花生四烯酸(arachidonic acid，AA)的方法。具體地說，利用氣升式生物反應(yīng)器，在非機(jī)械攪拌及特定優(yōu)化的工藝條件下，高密度、高效培養(yǎng)非人工改造被孢霉(Mortierella)生產(chǎn)高純度花生四烯酸(arachidonic acid，AA)的方法。
技術(shù)背景近年來，長鏈多不飽和脂肪酸在人體中的生理和治療功能得到越來越多的重視和認(rèn)同。長鏈多不飽和脂肪酸通常包括Omega-3，Omega-6和Omega-9多不飽和脂肪酸。由于Omega-3和Omega-6多不飽和脂肪酸具有極其重要和獨(dú)特的生理及營養(yǎng)功能，這些多不飽和脂肪酸的開發(fā)和利用得到人們的普遍重視(Chen F & Jiang Y.Algae and Their B iotechnologicalPotential，Kluwer Academic Publishers，316pp.(2001)；陳峰，姜悅《微藻生物技術(shù)》，共348頁，中國輕工出版社(1999))。花生四烯酸(arachidonic acid，AA)屬Omega-6長鏈多不飽和脂肪酸，而二十二碳六烯酸(docosahexaenoicacid，DHA)則屬于Omega-3長鏈多不飽和脂肪酸。這兩種多不飽和脂肪酸是人的神經(jīng)和視覺組織中結(jié)構(gòu)性成分，因此在神經(jīng)和視覺系統(tǒng)中必不可少。人體并不能有效地從頭生物合成花生四烯酸(AA)或二十二碳六烯酸(DHA)；所以必須從食物中攝取以滿足人體的需求。關(guān)于多不飽和脂肪酸的生理功能和營養(yǎng)學(xué)方面的研究已有較多的報(bào)道。目前研究的重點(diǎn)在于如何通過生物技術(shù)的方法，利用微生物(包括海洋微藻，真菌等)來高效生產(chǎn)純度高、雜質(zhì)少的多不飽和脂肪酸。尤其是由于生產(chǎn)花生四烯酸(AA)或二十二碳六烯酸(DHA)的菌種通常會(huì)同時(shí)生物合成二十碳五烯酸(EPA)，可是EPA對(duì)嬰幼兒的生長發(fā)育有一定的不良影響。因此，利用微生物生產(chǎn)不含EPA的花生四烯酸(AA)或二十二碳六烯酸(DHA)是目前世界范圍內(nèi)的重要研究課題。
花生四烯酸(AA)存在于多種微生物中，尤其是真菌(例如，Mortierellaspp.，包括Mortierella alpina，Conidiobolus nanodes，Entomophthora exitalis，Blastocladiella emersonit)和微藻(例如，Porphyridium cruentum，Sargassumsalicifolium，Euglena gracilis)(J.Biosci Bioeng.871-14(1999))。其中高山被孢霉(Mortierella alpina)是最高效的花生四烯酸(AA)生產(chǎn)菌之一(J.Biotechnol.56153-165(1997))。在本專利申請(qǐng)之前，也有幾份有關(guān)利用高山被孢霉生產(chǎn)花生四烯酸申請(qǐng)(包括，馬泰克公司，公開號(hào)CN1175976A；華中科技大學(xué)，公開號(hào)CN1323904A，CN1539982A；烯王生物公司，公開號(hào)CN1362522A)。然而，這些專利申請(qǐng)存在著種種缺點(diǎn)與不足。包括(1)生產(chǎn)規(guī)模小、產(chǎn)油量低、花生四烯酸生產(chǎn)能力低等缺點(diǎn)(公開號(hào)CN1175976A)；(2)由于采用超低溫，發(fā)酵周期長。且通氣量太高，不但高耗能，現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)難以實(shí)現(xiàn)(CN1323904A)；(3)花生四烯酸油脂中含有難以去除的二十碳五烯酸(EPA)(高達(dá)3.7％)(CN1539982A)；(4)生物工程誘變菌存在生產(chǎn)穩(wěn)定性與食用安全性等潛在的問題(CN1362522A)。同時(shí)，這些專利申請(qǐng)也忽略了機(jī)械攪拌對(duì)被孢霉菌絲體的破壞以致可能導(dǎo)致生物量和花生四烯酸產(chǎn)量低等問題。因此，需要一種生產(chǎn)高效花生四烯酸的新方法。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種高效生產(chǎn)花生四烯酸的方法。本發(fā)明的另一目的是提供由本發(fā)明的方法得到的花生四烯酸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種生產(chǎn)高純度花生四烯酸的方法，其包括在通風(fēng)條件下，利用非機(jī)械攪拌，采用深層液體高密度培養(yǎng)被孢霉(Mortierella)。
具體實(shí)施方式
為了達(dá)到高密度、高效、低耗能、規(guī)?；a(chǎn)高純度食用安全性高的花生四烯酸油脂，本發(fā)明采用非人工改造被孢霉(包括Mortierella alpine和同屬的其他種株，例如Mortierella alliacea)，利用氣升式生物反應(yīng)器(80L至10000L)，通風(fēng)速度為不低于0.5VVM，但通?？删S持在低于3VVM的較低水平，通過噴氣口，反向?qū)_噴射，以增加發(fā)酵液溶解氧濃度。這樣一方面減少機(jī)械攪拌的能耗，另一方面可以保護(hù)被孢霉細(xì)胞不被攪碎或剪切損傷，從而增大了細(xì)胞的存活率，并使細(xì)胞內(nèi)含物(包括花生四烯酸油脂)不會(huì)流失，從而大大提高產(chǎn)油率。
本發(fā)明所用的液體培養(yǎng)基為以海水或海鹽為主要成分的基本培養(yǎng)液，并添加葡萄糖、氨基酸、酵母浸出物、無機(jī)鹽、微量元素等成分，通過高溫(121℃)蒸氣消毒20分鐘，快速冷卻后接種培養(yǎng)。培養(yǎng)液的啟始pH為6，而發(fā)酵過程中pH控制在6-8的范圍內(nèi)。培養(yǎng)溫度在細(xì)胞的大量積累階段(通常是首5.5天)控制在約31℃從而使細(xì)胞維持在較高的繁殖速率，而主要碳源葡萄糖濃度控制在40g/L以下，使細(xì)胞不受抑制，保持較高的比生長速率，而葡萄糖的補(bǔ)充則采用指數(shù)添加的補(bǔ)料方式。在花生四烯酸大量積累階段(通常是后1.5天)，溫度降為23-25℃，從而促進(jìn)長鏈多不飽和脂肪酸的形成。在此同時(shí)，通氣量應(yīng)維持在較高的水平(接近3VVM)以保持溶解氧不低于30％飽和度，這樣有利于花生四烯酸的合成和積累。通過本發(fā)明所描述的方法，細(xì)胞干重可達(dá)40g/L，產(chǎn)油可達(dá)50％(細(xì)胞干重)，花生四烯酸含量可達(dá)45-53％(總油)并不含二十碳五烯酸(EPA)。耗能為機(jī)械攪拌發(fā)酵的40％。
以上為本發(fā)明的總體描述，以下所列實(shí)施例只供說明本發(fā)明之用，而不是對(duì)本發(fā)明的任何限制。
實(shí)施例1高山被孢霉實(shí)驗(yàn)室保存培養(yǎng)在含有土豆葡萄糖的培養(yǎng)基(將土豆粉碎、煮沸、用0.4微米濾紙過濾、加入葡萄糖40g/L)中加進(jìn)DIFCO公司瓊脂(10g/L)，配制成固體培養(yǎng)基。高溫蒸氣消毒(121℃)20分鐘后供接種用。將高山被孢霉(Mortierella alpineRK0233)菌絲體用接種環(huán)轉(zhuǎn)移少許到土豆葡萄糖固體培養(yǎng)基上。在30℃靜置培養(yǎng)。為保證菌種的無污染和健康，每天進(jìn)行顯微鏡鏡檢，若受污染必須馬上純化，并每3天利用氣相質(zhì)譜儀分析一次脂肪酸組成(尤其是花生四烯酸含量的穩(wěn)定性)，以確保菌種的原有特性。
實(shí)施例2氣升式生物反應(yīng)器(80L)培養(yǎng)生產(chǎn)花生四烯酸將保存培養(yǎng)的少許高山被孢霉(Mortierella alpine RK0233)菌絲體首先接種于250mL裝有100-150mL經(jīng)高溫蒸氣消毒滅菌的培養(yǎng)液的三角瓶中。該培養(yǎng)液含有大約20％的深海水，并含有以下成分葡萄糖，20g/L；酵母浸出物，10g/L；硝酸鈉，7g/L；谷氨酸，2g/L；KH2PO4，1g/L；CaCl2.H2O，0.1g/L；MgSO4.7H2O，0.5g/L；FeCl3.6H2O，15mg/L；Zn SO4.7H2O，7.5mg/L；及CuSO4.5H2O，0.5mg/L。pH調(diào)為6.0。培養(yǎng)溫度為31℃。搖床速度為150rpm。在三角瓶搖床培養(yǎng)2天后接種到裝有80L同樣培養(yǎng)液的氣升式生物反應(yīng)器中，接種量為3.5％。培養(yǎng)溫度為31℃。通風(fēng)速率啟始為0.5VVM。并通過模擬指數(shù)生長連續(xù)添加葡萄糖，但在任何情況下葡萄糖濃度維持在40/L以下。在此條件下培養(yǎng)5天。然后停止流加葡萄糖，并開始降溫至23-24℃，加大通風(fēng)速率至2VVM，二天后離心收集菌絲體，熱風(fēng)干燥，然后冷凍(-20℃)保藏。
通過此實(shí)施例方法氣升式生物反應(yīng)器培養(yǎng)，比生長速率高達(dá)0.06h-1，菌絲體干重為37.5g/L，生物量(對(duì)葡萄糖)轉(zhuǎn)化率為0.48g/g，產(chǎn)油率(占菌絲體干重)為47.6％，花生四烯酸(AA)占總油含量為52.8％，二十碳五烯酸(EPA)含量為0。
實(shí)施例3氣升式生物反應(yīng)器(10,000L)培養(yǎng)生產(chǎn)花生四烯酸此實(shí)施例中的三角瓶搖床培養(yǎng)及80L生物反應(yīng)器的培養(yǎng)方式大致與上述相同。80L生物反應(yīng)器的培養(yǎng)被用作為一級(jí)種子培養(yǎng)，所以省略了低溫(23-24℃)加大通氣積累多不飽和脂肪酸階段。培養(yǎng)期也相應(yīng)縮短為2天。另外，增加1000L規(guī)模的二級(jí)種子培養(yǎng)階段，培養(yǎng)方式與一級(jí)種子培養(yǎng)相似，即高溫31℃快速培養(yǎng)2天，然后以5％的接種量接到10,000L氣升式生物反應(yīng)器。讓其培養(yǎng)5.5天直至菌絲體大量積累至37-40g/L干重。在此期間，葡萄糖采用指數(shù)生長添加法(按比生長速率高達(dá)0.06h-1計(jì)算流加速率)。然后，急速降溫至23-24℃，通風(fēng)速率提高至3VVM，保持1.5天后放罐，離心收集菌絲體，熱風(fēng)干燥，然后冷凍(-20℃)保藏。在整個(gè)10,000L氣升式生物反應(yīng)器發(fā)酵過程中，嚴(yán)格間隙式取樣分析檢查生物量增長、糖氮消耗、脂肪酸組成、細(xì)胞狀態(tài)等，確保產(chǎn)量和質(zhì)量的穩(wěn)定性。表1和2列出氣升式生物反應(yīng)器(10,000L)培養(yǎng)生產(chǎn)花生四烯酸(AA)的相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
表1脂肪酸的組成


*含量少于0.5％。
表2其他的重要參數(shù)


權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)高純度花生四烯酸的方法，其包括在通風(fēng)條件下，利用非機(jī)械攪拌，采用深層液體高密度培養(yǎng)被孢霉(Mortierella)。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中被孢霉為非人工改造，包括高山被孢霉(Mortierella alpine)和同屬的其他種株，例如Mortierella alliacea。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中在被孢霉種株在非機(jī)械攪拌的氣升式通風(fēng)培養(yǎng)條件下快速生長。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中所采用的培養(yǎng)液為以海水或海鹽為主要成分的基本培養(yǎng)液，并添加葡萄糖、氨基酸、酵母浸出物、無機(jī)鹽、微量元素等成分。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中所述的通風(fēng)為氣升式噴射，通風(fēng)速度為不低于0.5VVM(每分鐘單位培養(yǎng)液的通氣量)，pH為6-8。
6.根據(jù)權(quán)利要求
2-5的方法，被孢霉的培養(yǎng)分為兩個(gè)階段，即細(xì)胞的大量積累和產(chǎn)物的大量積累階段。
7.根據(jù)權(quán)利要求
6的方法，其中在細(xì)胞的大量積累階段，控制葡萄糖濃度在每升40克以下以防止基質(zhì)抑制影響，同時(shí)溫度維持在約31℃。
8.根據(jù)權(quán)利要求
6的方法，其中在產(chǎn)物的大量積累階段提供充分的溶解氧(高于30％飽和度)，并處于較低溫(低于25℃)。
9.根據(jù)權(quán)利要求
1-8的方法，其中被孢霉積累大量高純度花生四烯酸(AA)；細(xì)胞中抽提所得的粗油不含二十碳五烯酸(EPA)；發(fā)酵周期為七天。
10.根據(jù)權(quán)利要求
1-9的方法生產(chǎn)的高純度花生四烯酸。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種利用氣升式生物反應(yīng)器，在特定優(yōu)化的工藝條件下，高密度、高效培養(yǎng)非人工改造被孢霉(Mortierella)生產(chǎn)高純度花生四烯酸(arachidonic acid，AA)的新方法。本方法具有節(jié)能、高密度、高效、花生四烯酸純度高并不含二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12R1/645GKCN1786178SQ200410100348
公開日2006年6月14日 申請(qǐng)日期2004年12月6日
發(fā)明者姜悅, 陳璇 申請(qǐng)人:姜悅, 陳璇導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan