專利名稱：使超晝夜節(jié)律正?；幕ㄉ南┧岬挠猛镜闹谱鞣椒?br> 技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種涉及調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律(circadian rhythm)的組合物。
背景技術(shù)：
人類和其它生物體的多種功能在有限的范圍內(nèi)完成，且其變化具有規(guī)則的周期，這通常稱為生物節(jié)律。最基本的生物節(jié)律是具有近似一天的周期變化且被稱為晝夜節(jié)律。晝夜節(jié)律是活的機(jī)體本身固有的“自動(dòng)計(jì)算時(shí)間的程序”，或所謂的內(nèi)在時(shí)鐘功能(也被稱為生物鐘或機(jī)體鐘)操縱的一種內(nèi)在的節(jié)律，與完全依賴于活的機(jī)體周圍的物理變化(例如白天和黑夜、地球的自轉(zhuǎn)、以及溫度、濕度和大氣壓的變化)的外部節(jié)律不同。
這些節(jié)律可以通過當(dāng)最大可能性地完全去除外部因素時(shí)，檢測(cè)該節(jié)律是否仍然存在而區(qū)分。當(dāng)在一個(gè)周期沒有作用的環(huán)境下，例如在與外界隔離的實(shí)驗(yàn)室中，人體表現(xiàn)出大于24小時(shí)的周期。該周期被稱為自由運(yùn)轉(zhuǎn)(free-run)周期，且確信為是一種內(nèi)在周期，或機(jī)體時(shí)鐘(人類的自由運(yùn)轉(zhuǎn)周期為24.2小時(shí))。
具有自由運(yùn)轉(zhuǎn)周期的并非24小時(shí)的機(jī)體時(shí)鐘，與外界物理變化同步，且通常與日夜變化一致，產(chǎn)生24小時(shí)周期。這被稱為節(jié)律同步化，導(dǎo)致的24小時(shí)周期節(jié)律被稱為超晝夜節(jié)律(infradian rhythm)，然而，節(jié)律的同步化不僅意味著與24小時(shí)周期的一致，也意味著建立起機(jī)體時(shí)鐘的特定階段和外部環(huán)境節(jié)律的特定階段1∶1的時(shí)間關(guān)系，后者更為重要。例如，動(dòng)物的活動(dòng)時(shí)期的起始時(shí)間由機(jī)體時(shí)鐘決定。在晝出動(dòng)物中，由于節(jié)律的同步化，在環(huán)境節(jié)律的特定階段的日出以及由機(jī)體時(shí)鐘的特定階段建立的活動(dòng)期之間具有一致性。
超晝夜節(jié)律不僅在睡眠習(xí)慣和飲食中有所表現(xiàn)，也在體溫、血壓、心率和內(nèi)分泌，以及在心血管系統(tǒng)疾病的治療和預(yù)防中有所表現(xiàn)，了解自主神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、血液動(dòng)力學(xué)等等的超晝夜節(jié)律以及使其維持正常是十分重要的。在現(xiàn)代社會(huì)，輪班工作、長(zhǎng)途航空旅行、老齡化社會(huì)、生活模式的多樣化等導(dǎo)致的人工的、不規(guī)則的生活周期正變得很普遍，已經(jīng)發(fā)生了由生物節(jié)律失調(diào)導(dǎo)致的多種疾病的意外增長(zhǎng)，例如超晝夜節(jié)律睡眠失調(diào)，且具有對(duì)治療這些疾病的有效措施的強(qiáng)烈需求。
在由于超晝夜節(jié)律異常導(dǎo)致的一種不同步綜合征(時(shí)差癥(jetlag))中，可導(dǎo)致夜里失眠或白天困倦，另外還可導(dǎo)致頭痛、耳鳴、心悸、惡心、胃痛和腹瀉，造成判斷力和注意力的下降。另外，延遲睡眠階段綜合征(delayed sleep phase syndrome(DSPS))在青春期開始時(shí)發(fā)病率最高(Diagnostic Classification SteeringCommittee，Thorpy，M.J.International Classification of SleepDisordersDiagnostic and Coding Manual.American SleepDisorders Association，Rochester，1990)。青年人的超晝夜節(jié)律睡眠失調(diào)使其適應(yīng)社會(huì)困難，使他們的發(fā)展受到阻礙(Kajimura，N.，等人Nippon Rinsho，Vol.56，No.2，404頁，1998)。
作為調(diào)整導(dǎo)致這些病癥的超晝夜節(jié)律異常的方法，有心里治療法、非藥物療法和藥物療法。作為非藥物療法，可利用亮光照射，目前，它被肯定地用于季節(jié)性的情緒失調(diào)以及超晝夜節(jié)律睡眠失調(diào)的治療。用于藥物治療的催眠藥被粗略地分為巴比妥酸鹽型、非巴比妥酸鹽型和benzodian型。盡管苯巴比妥酸鹽型藥物具有強(qiáng)烈的睡眠誘導(dǎo)作用，它們也是有毒性的，且其抑制呼吸和循環(huán)的傾向隨其血藥濃度的增加而變得更強(qiáng)烈，所以必需謹(jǐn)慎地控制它們的使用。
在非苯巴比妥酸鹽型藥物中，可以導(dǎo)致呼吸抑制、催吐、惡心和昏迷，且具有依賴的危險(xiǎn)。因此，目前，從安全的角度來看，以benzodian型藥物為主流，但是，也會(huì)表現(xiàn)出例如抗焦慮作用、抗驚厥作用和肌肉放松作用等的副作用。也已經(jīng)了解強(qiáng)烈表現(xiàn)出困倦、搖擺、頭昏眼花、疲勞和乏力的“殘留效應(yīng)”和“健忘癥效應(yīng)”，因此必需非常謹(jǐn)慎地控制這些藥物的應(yīng)用。因此，目前為止，沒有針對(duì)超晝夜節(jié)律的具有安全有效的正常化作用的極好的化合物。此外，催眠藥僅僅誘導(dǎo)睡眠而沒有晝夜節(jié)律的同步化功能，例如，當(dāng)與晝夜節(jié)律同步化時(shí)，可能減輕時(shí)差感，但催眠藥不能作到這一點(diǎn)。
作為一種能夠與晝夜節(jié)律同步化的化合物，已經(jīng)推薦了褪黑素。褪黑素是一種主要由松果體產(chǎn)生的激素，且其產(chǎn)生在一天內(nèi)表現(xiàn)出顯著的變化。夜間的產(chǎn)生高達(dá)日間的50到100倍。
當(dāng)通過給與β-阻斷劑抑制褪黑素在夜間的產(chǎn)生時(shí)，可以導(dǎo)致睡眠-覺醒節(jié)律失調(diào)，例如睡眠褪化，如夜晚增加的中途覺醒(Brismar等人Acta Med.Scand.，223，p.525，1988)和白天清醒水平的降低(Dimenas等人J.Clin.Pharmacol.，30，s103，1990)。由于老年人褪黑素分泌降低，補(bǔ)充褪黑素被稱為一種有效的治療(Garfinkel等人Lancet，346，p.541，1995)。即便在褪黑素的生理產(chǎn)生顯著下降的高齡老年人中，在那些能夠具有良好睡眠的人中，褪黑素產(chǎn)生的量仍然很高(Haimov等人Sleep，18，p.598，1995)。從這些事實(shí)已經(jīng)確信內(nèi)源性的褪黑素是一種參與睡眠-覺醒節(jié)律調(diào)節(jié)的生理性催眠物質(zhì)。
已經(jīng)有許多關(guān)于內(nèi)源性褪黑素以晝夜節(jié)律同步化為目的的催眠作用的報(bào)告。然而，盡管有報(bào)告說作為給與褪黑素的結(jié)果，可以獲得高質(zhì)量的睡眠，例如縮短入睡潛伏時(shí)間、降低中途的覺醒和改善失眠(Zhdanova等人Clin.Pharmacol.Ther.，57，p.552，1995)，還存在另一報(bào)告，否認(rèn)對(duì)睡眠失調(diào)的睡眠調(diào)節(jié)效應(yīng)和改善效應(yīng)(James等人Neuropsychopharmacology，3，p.19，1990)。
非專利文獻(xiàn)1Brismar等人Acta Med.Scand.，223，p.525，1988非專利文獻(xiàn)2Dimenas等人J.Clin.Pharmacol.，30，s103，1990非專利文獻(xiàn)3Garfinkel等人Lancet，346，p.541，1995
非專利文獻(xiàn)4Haimov等人Sleep，18，p.598，1995非專利文獻(xiàn)5Zhdanova等人Clin.Pharmacol.Ther.，57，p.552，1995非專利文獻(xiàn)6James等人Neuropsuchopharmacology，3，p.19，1990附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了含有花生四烯酸的脂肪/油對(duì)光照時(shí)期12小時(shí)的運(yùn)動(dòng)率(％)的影響。
圖2顯示了含有花生四烯酸的脂肪/油對(duì)伴隨向后和向前移動(dòng)6小時(shí)的位相(phase)的晝夜節(jié)律同步化的影響。
圖3顯示了通過用光刺激黑暗條件下(自由運(yùn)轉(zhuǎn))飼養(yǎng)24小時(shí)的小鼠使位相向后移動(dòng)和位相向前移動(dòng)時(shí)，含有花生四烯酸的脂肪/油對(duì)位相(時(shí)間)移動(dòng)量的影響。

發(fā)明內(nèi)容
已經(jīng)有文獻(xiàn)指出(MishimaNippon Rinsho，Vol.56，No.2，p.302，1998)這些結(jié)果彼此相反的原因之一是依賴于給藥時(shí)間而獲得，且沒有任何已知化合物不依賴于給藥時(shí)間而具有使超晝夜節(jié)律正?；淖饔煤?或使晝夜節(jié)律(生物鐘)的同步化改善的作用。
因此，強(qiáng)烈需要開發(fā)一種改善超晝夜節(jié)律正?；饔煤?或晝夜節(jié)律(生物鐘)同步化的化合物，副作用小，且良好地用于藥物和食物。
相應(yīng)地，本發(fā)明的目的在于提供一種具有使超晝夜節(jié)律正?；墓δ芎?或使晝夜節(jié)律(生物鐘)的同步化改善的作用的食品/飲料，含有花生四烯酸和/或含花生四烯酸的化合物，還提供其生產(chǎn)方法。更具體地，本發(fā)明的目標(biāo)為提供一種對(duì)由超晝夜節(jié)律異常導(dǎo)致的生物節(jié)律失調(diào)、睡眠失調(diào)和延遲睡眠階段綜合征，也對(duì)由晝夜節(jié)律(生物鐘)同步化延遲導(dǎo)致的病癥(例如時(shí)差癥、頭痛、耳鳴、心悸、惡心、胃痛、腹瀉和判斷和注意力的下降)具有改善作用的食品/飲料，其中至少有一種成分選自花生四烯酸、花生四烯酸醇酯和一部分或所有的組成的脂肪酸為花生四烯酸的甘油三酯、磷脂和糖脂類作為有效成分，同時(shí)也提供其生產(chǎn)方法。
為了闡明花生四烯酸和/或含有花生四烯酸的化合物的使超晝夜節(jié)律正?；淖饔煤?或使晝夜節(jié)律(生物鐘)的同步化改善的作用，本發(fā)明進(jìn)行了深入研究。通過評(píng)估花生四烯酸和/或含有花生四烯酸的化合物對(duì)大鼠晝夜節(jié)律同步化的效應(yīng)，已經(jīng)在行為藥理學(xué)上闡明了它的效應(yīng)。
本發(fā)明進(jìn)一步成功地用微生物工業(yè)化生產(chǎn)含有不低于10％重量比的花生四烯酸的甘油三酯，因此現(xiàn)在能夠?qū)⑵溆糜跈z測(cè)本發(fā)明的效應(yīng)，且已經(jīng)闡明了所述的甘油三酯的效應(yīng)。
而且本發(fā)明已經(jīng)成功地生產(chǎn)了含有1、3位結(jié)合了中鏈脂肪酸且通過酶學(xué)方法在第2位結(jié)合了花生四烯酸的甘油三酯的脂肪/油，因此現(xiàn)在能夠?qū)⑵溆糜跈z測(cè)本發(fā)明的效應(yīng)，且已經(jīng)闡明了所述的甘油三酯的效應(yīng)。
相應(yīng)地，本發(fā)明目的在于提供一種具有使超晝夜節(jié)律正?；淖饔煤?或使晝夜節(jié)律(生物鐘)的同步化改善的作用的食品/飲料，含有花生四烯酸和/或含花生四烯酸的化合物，還提供其生產(chǎn)方法。
更具體地，本發(fā)明提供一種對(duì)由超晝夜節(jié)律異常導(dǎo)致的生物節(jié)律失調(diào)、睡眠失調(diào)和延遲睡眠階段綜合征，也對(duì)由晝夜節(jié)律(生物鐘)同步化延遲導(dǎo)致的紊亂(例如時(shí)差癥、頭痛、耳鳴、心悸、惡心、胃痛、腹瀉和判斷和注意力的下降)具有減輕作用的食品/飲料，其中至少有一種成分選自花生四烯酸、花生四烯酸醇酯和一部分或所有的組成的脂肪酸為花生四烯酸的甘油三酯、磷脂和糖脂類作為有效成分，同時(shí)也提供其生產(chǎn)方法。
相應(yīng)于本發(fā)明，可能提供一種具有使超晝夜節(jié)律正?；淖饔煤?或使晝夜節(jié)律(生物鐘)的同步化改善的作用的食品/飲料，含有花生四烯酸和/或含花生四烯酸的化合物，還提供其生產(chǎn)方法，且對(duì)現(xiàn)代社會(huì)的人們十分有用。
相應(yīng)地，本發(fā)明提供了(1)一種具有使超晝夜節(jié)律正常化的作用和/或使晝夜節(jié)律(生物鐘)的同步化改善的作用的組合物，含有花生四烯酸和/或含花生四烯酸的化合物。上述的含花生四烯酸的化合物優(yōu)選花生四烯酸的醇酯，或包括花生四烯酸作為其一部分或所有的組成的脂肪酸的甘油三酯、磷脂或糖脂。含有花生四烯酸作為其組成的脂肪酸的一部分或全部的甘油三酯，優(yōu)選1、3位結(jié)合了中鏈脂肪酸且第2位結(jié)合了花生四烯酸的甘油三酯。上述的中鏈脂肪酸優(yōu)選選自具有6到12個(gè)碳原子的脂肪酸，例如，選自具有8個(gè)碳原子的脂肪酸。
本發(fā)明也提供了(2)一種具有使超晝夜節(jié)律正?；淖饔煤?或使晝夜節(jié)律(生物鐘)的同步化改善的作用的組合物，其包含甘油三酯類，所述的甘油三酯類含有花生四烯酸作為其組成的脂肪酸的全部或一部分的甘油三酯。包含含有花生四烯酸作為其組成的脂肪酸的全部或一部分的甘油三酯的甘油三酯類的花生四烯酸的比例優(yōu)選不低于組成甘油三酯的總脂肪酸重量的10％。包含含有花生四烯酸作為其組成的脂肪酸的全部或一部分的甘油三酯的甘油三酯類優(yōu)選從屬于被孢霉屬(Mortierella)的微生物中提取。包含含有花生四烯酸作為其組成的脂肪酸的全部或一部分的甘油三酯的甘油三酯類優(yōu)選不含二十碳五烯酸，或即便含有，它的量不大于1％。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種具有使超晝夜節(jié)律正?；淖饔煤?或使晝夜節(jié)律(生物鐘)的同步化改善的作用的組合物，其含有甘油三酯類，所述的甘油三酯類含有不少于5mol％的其中1、3位結(jié)合了中鏈脂肪酸且第2位結(jié)合了花生四烯酸的甘油三酯。上述的中鏈脂肪酸優(yōu)選選自具有6到12個(gè)碳原子的脂肪酸，例如，選自具有8個(gè)碳原子的脂肪酸。
上述(1)到(3)提及的組合物優(yōu)選對(duì)由超晝夜節(jié)律異常導(dǎo)致的生物節(jié)律失調(diào)具有預(yù)防和減輕作用。生物節(jié)律失調(diào)的例子為睡眠失調(diào)、由晝夜節(jié)律(生物鐘)同步化延遲導(dǎo)致的紊亂以及由晝夜節(jié)律(生物鐘)同步化延遲導(dǎo)致的時(shí)差癥、頭痛、耳鳴、心悸、惡心、腹痛、腹瀉和判斷能力和注意力的下降。
上述(1)到(3)的組合物的具體實(shí)施方式
的例子為食物組合物和藥物組合物。對(duì)于花生四烯酸的量，一個(gè)成年人每天的攝入量?jī)?yōu)選0.001到20g?；ㄉ南┧釣榻M成的脂肪酸的化合物優(yōu)選為花生四烯酸乙醇酯或其組成的脂肪酸的全部或一部分為花生四烯酸的甘油三酯、磷脂或糖脂。上述的組成的脂肪酸的一部分或全部為花生四烯酸的甘油三酯為1、3位結(jié)合了中鏈脂肪酸且第2位結(jié)合了花生四烯酸的甘油三酯，中鏈脂肪酸優(yōu)選選自具有6到12個(gè)碳原子的脂肪酸，例如，選自具有8個(gè)碳原子的脂肪酸。
本發(fā)明還進(jìn)一步提供了一種食品組合物，其中該組合物含有不少于0.001％重量比的甘油三酯，其中1、3位結(jié)合了中鏈脂肪酸且花生四烯酸結(jié)合在第2位。上述的中鏈脂肪酸優(yōu)選選自具有6到12個(gè)碳原子的脂肪酸，例如，選自具有8個(gè)碳原子的脂肪酸。該食品組合物為例如一種功能性食品、營(yíng)養(yǎng)添加劑、一種指定的健康食品或老年人食品。
而且，本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)具有使超晝夜節(jié)律正?；淖饔煤?或使晝夜節(jié)律(生物鐘)的同步化改善的作用的組合物的方法，特征在于花生四烯酸和/或含有花生四烯酸的化合物為單獨(dú)或與基本上不含花生四烯酸或即便含有，其含量也很少的食品材料共同混合。
實(shí)施本發(fā)明的具體方式本發(fā)明涉及一種具有使超晝夜節(jié)律正?；淖饔煤?或使晝夜節(jié)律(生物鐘)的同步化改善的作用的食品/飲料，含有花生四烯酸和/或含花生四烯酸的化合物，還涉及其生產(chǎn)方法。
本發(fā)明的組合物對(duì)由超晝夜節(jié)律異常導(dǎo)致的生物節(jié)律失調(diào)、睡眠失調(diào)和延遲睡眠階段綜合征以及由晝夜節(jié)律(生物鐘)同步化延遲導(dǎo)致的病癥(時(shí)差癥、頭痛、耳鳴、心悸、惡心、胃痛、腹瀉和判斷和注意力的下降)具有預(yù)防或減輕作用，是一種有效的飲料/食品、健康食品、功能性食品、指定的健康食品、嬰兒和幼兒食品、老年食品或藥品、準(zhǔn)藥品等等。
除了花生四烯酸，也可利用任何含有花生四烯酸的化合物作為本發(fā)明的有效成分。含花生四烯酸化合物的例子為花生四烯酸鹽，例如鈣鹽和鈉鹽。其它的例子為花生四烯酸醇酯，例如花生四烯酸甲酯和花生四烯酸乙酯。還可以采用甘油三酯、甘油二酯、甘油一酯、磷脂、糖脂等等，含有花生四烯酸作為全部或部分的組成脂肪酸。
當(dāng)考慮到應(yīng)用于食品時(shí)，優(yōu)選花生四烯為甘油三酯或磷脂的形式，或更優(yōu)選以甘油三酯的形式。盡管幾乎沒有自然來源的含有花生四烯酸的甘油三酯(這與含有包含作為部分或全部的組成脂肪酸的花生四烯酸的甘油三酯的甘油三酯類具有同樣含義)，現(xiàn)在通過本發(fā)明工業(yè)化地利用含有花生四烯酸作為組成脂肪酸的甘油三酯成為可能，且作為對(duì)大鼠晝夜節(jié)律的效應(yīng)的評(píng)估結(jié)果，已經(jīng)闡明了本發(fā)明的有效成分的效果，且已經(jīng)闡明具有具有使超晝夜節(jié)律正?；淖饔煤?或使晝夜節(jié)律(生物鐘)的同步化改善的作用。
相應(yīng)地，本發(fā)明中，可能利用包含含有花生四烯酸作為部分或全部的組成脂肪酸的甘油三酯的甘油三酯類，是本發(fā)明的有效成分(含有花生四烯酸的甘油三酯)。考慮到含有花生四烯酸的甘油三酯，在應(yīng)用于食品中時(shí)，在所有的組成甘油三酯的脂肪酸中，花生四烯酸的比不少于20(w/w)％重量，優(yōu)選重量不少于30％，或更優(yōu)選重量不少于40％的脂肪/油(甘油三酯)是優(yōu)選的形式。相應(yīng)地，在本發(fā)明中可以采用任意的通過孵育具有生產(chǎn)含有花生四烯酸的脂肪/油(甘油三酯)能力的微生物而制備的產(chǎn)品。
具有生產(chǎn)含有花生四烯酸的脂肪/油(甘油三酯)的能力的微生物的例子是那些屬于被孢霉屬(Mortierella)、耳霉屬(Conidiobolus)、腐霉屬(Pythium)、疫霉屬(Phytophthora)、青霉屬(Penicillium)、枝孢屬(Cladosporium)、毛霉屬(Mucor)、鐮孢屬(Fusarium)、曲霉屬(Aspergillus)、紅酵母屬(Rhodotorula)、蟲霉屬(Entomophthora)、刺孢囊霉屬(Echinosporangium)和水霉屬(Saprolegnia)的微生物。
關(guān)于屬于被孢霉屬(Mortierella)的被孢霉亞屬的微生物，其例子為長(zhǎng)形被孢霉(Mortierella elongate)、微小被孢霉(Mortierellaexigua)、喜濕被孢霉(Mortierella hygrophiia)和高山被孢霉(Mortierella alpine)。為了更具體，諸如長(zhǎng)形被孢霉(Mortierellaelongate)IFO 8570、微小被孢霉(Mortierella exigua)IFO 8571、喜濕被孢霉(Mortierella hygrophila)IFO 5941和高山被孢霉(Mortierella alpine)IFO 8568、ATCC 16266、ATCC 32221、ATCC42430、CBS 219.35、CBS 224.37、CBS 250.53、CBS 343.66、CBS 527.72、CBS 529.72、CBS 608.70、CBS 754.68等等的株系在此作為例證。
所有的這些株系均可從大阪Institute for Fermentation，Osaka(IFO)(日本大阪財(cái)團(tuán)法人發(fā)酵研究所(IFO))、美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(American Type Culture Collection，ATCC)和Centralbureau voor Schimmelcultures(CBS)無限制地獲得。除此之外，也可以使用長(zhǎng)形被孢霉SAM 0219(在Fermentation Research Institute的保藏號(hào)8703)(在Fermentation Research Institute的保藏號(hào)1239)，該菌株是由本發(fā)明的研究人員從土壤中分離出來的。
在本發(fā)明中采用的株系的培養(yǎng)中，孢子、菌絲體或預(yù)先孵育的預(yù)培養(yǎng)物接種于液體或固體培養(yǎng)基中后進(jìn)行孵育。在液體培養(yǎng)基的情形下，可以采用任意通常作為碳源的物質(zhì)，例如葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麥芽糖、可溶淀粉、糖蜜、甘油以及甘露醇，但是并非限于它們。
除了例如蛋白胨、酵母提取物、麥芽提取物、肉類提取物、酪蛋白氨基酸(Casamino acid)、谷物浸泡液、大豆蛋白、脫脂大豆和棉籽餅的自然氮源，也可以采用有機(jī)氮源，例如尿素以及無機(jī)氮源，例如硝酸鈉、硝酸銨作為氮源。除了上述物質(zhì)外，如果需要另外還可以采用無機(jī)鹽，例如磷酸鹽、硫酸鎂、硫酸鐵以及硫酸銅、維生素等作為輔助營(yíng)養(yǎng)。對(duì)這些進(jìn)行培養(yǎng)的成分沒有特殊限制，只要它們的濃度不妨礙微生物的生長(zhǎng)。實(shí)際上和通常地，推薦碳源的濃度為0.1到40重量(w/v)％或，優(yōu)選1到25重量(w/v)％。至于起始加入氮源的量為0.1到10重量(w/v)％或優(yōu)選0.1到6重量(w/v)％，在孵育期間可以另外加入氮源。
當(dāng)控制培養(yǎng)基中的碳源濃度時(shí)，也可以采用含有不少于45重量(w/w)％的花生四烯酸的脂肪/油(甘油三酯)作為本發(fā)明的有效成分。在孵育中，從第二到第四天為細(xì)胞生長(zhǎng)期，在第二到第四天后的時(shí)期為脂肪/油聚積期。起始碳源濃度為1到8％重量比，或優(yōu)選地1到4％重量比，接著，僅在細(xì)胞生長(zhǎng)期以及脂肪/油聚積期后繼地加入碳源，且后繼加入的碳源總量為2到20％重量比，或優(yōu)選5到15％重量比。順便提及，在細(xì)胞生長(zhǎng)期間以及脂肪/油聚積期間后繼加入的碳源的量依賴于起始氮源的濃度以及孵育7天后培養(yǎng)基中碳源的濃度，優(yōu)選孵育6天后，或更優(yōu)選地在孵育4天后為0，由此能夠制備含有不少與45％重量比的花生四烯酸的脂肪/油(甘油三酯)，并作為本發(fā)明的有效成分。
孵育生產(chǎn)花生四烯酸的微生物的溫度可以依賴于采用的微生物而變化，可以為5到40℃或優(yōu)選20到30℃，在細(xì)胞在20到30℃孵育生長(zhǎng)后，在5到20℃繼續(xù)孵育，由此能夠生產(chǎn)不飽和脂肪酸。通過這種溫度控制的方式，也可能提高獲得的脂肪酸中高度不飽和脂肪酸的比例。培養(yǎng)基的pH為4到10或優(yōu)選5到9，通風(fēng)攪拌培養(yǎng)基，采用搖動(dòng)培養(yǎng)基或固定培養(yǎng)基。通常進(jìn)行2到30天孵育，優(yōu)選5到20天，或更優(yōu)選5到15天。
除了控制培養(yǎng)基中碳源的濃度，作為提高含有花生四烯酸的脂肪/油(甘油三酯)中花生四烯酸比例的另外的方式，也可通過對(duì)含花生四烯酸的脂肪/油進(jìn)行選擇性的水解來制備高含量花生四烯酸的脂肪/油。由于進(jìn)行這樣的選擇性水解采用的脂肪酶對(duì)甘油三酯沒有位點(diǎn)特異性，且其水解活性的降低與雙鍵數(shù)目成比例，除高度不飽和脂肪酸外的脂肪酸的酯鍵均被水解。然后在獲得的PUFA部分甘油三酯之間發(fā)生轉(zhuǎn)酯作用等，由此得到提高了高度不飽和脂肪酸的甘油三酯(″Enhancement of ArchidonicSelective Hydrolysis of aSingle-Cell Oil from Mortierella with Candida cylindraceaLipase″J.Am.Oil Chem.Soc.，72，1323-1327(1998))。
同樣，由選擇水解含花生四烯酸的脂肪/油而制備的花生四烯酸高含量的脂肪/油(甘油三酯)也可以用作本發(fā)明的有效成分。盡管為了排除其它脂肪酸的影響，本發(fā)明中花生四烯酸與含花生四烯酸的脂肪/油(甘油三酯)的全部脂肪酸的比例優(yōu)選較高，對(duì)這樣的高比例沒有限制，但是實(shí)際上有一些情況下，當(dāng)應(yīng)用于食物中時(shí)，花生四烯酸的絕對(duì)量很重要，因此，即便含有不少于10％重量比的花生四烯酸的脂肪/油(甘油三酯)也可以被充分地利用。
在本發(fā)明中，關(guān)于含有花生四烯酸作為全部或部分組成脂肪酸的甘油三酯，也可以采用中鏈脂肪酸連接至1、3位而花生四烯酸連接至第2位的甘油三酯。另外還可以采用含有不少于5mol％，優(yōu)選不少于10mol％，更優(yōu)選不少于20mol％或最優(yōu)選不少于30mol％的中鏈脂肪酸連接至1、3位而花生四烯酸連接至第2位的甘油三酯的脂肪/油(甘油三酯)。關(guān)于上述的中鏈脂肪酸連接至1、3位的甘油三酯，可以采用選自具有6到12碳原子的脂肪酸。具有6到12個(gè)脂肪酸的例子為辛酸以及癸酸，且特別優(yōu)選的是1，3-辛酰-2-花生四烯酰-甘油(下文中用“8A8”表示)。
當(dāng)以嬰兒和老年人作為對(duì)象時(shí)，這樣中鏈脂肪酸連接至1、3位而花生四烯酸連接至第2位的甘油三酯是理想的脂肪/油(甘油三酯)。當(dāng)脂肪/油(甘油三酯)被攝入且進(jìn)入小腸時(shí)，它通常被胰脂肪酶水解。該胰脂肪酶特異于1，3-位，因此甘油三酯的1，3-位被剪切，產(chǎn)生2分子的游離脂肪酸，且同時(shí)產(chǎn)生1分子的2-單甘油酯(MG)。2-MG對(duì)膽汁酸具有很高的溶解性，且具有良好的可吸收性，因此，通常說2-位點(diǎn)的脂肪酸具有更好的吸收性。
當(dāng)2-MG溶解于膽汁酸中時(shí)，它如同表面活性劑地發(fā)揮作用，提高游離脂肪酸的吸收。接著，游離脂肪酸和2-MG與膽固醇、磷脂等一同生物合成膽汁酸復(fù)合體微團(tuán)，整合入小腸的表皮細(xì)胞，重新合成甘油三酯并最終作為乳糜微粒釋放入淋巴。然而，胰脂肪酶的脂肪酸特性具有典型的特性，它對(duì)飽和脂肪酸高活性，且對(duì)花生四烯酸很難剪切。另外的問題在于，由于胰脂肪酶活性在嬰兒和老年人中活性較低，中鏈脂肪酸連接至1、3位而花生四烯酸連接至第2位的甘油三酯是最適宜的脂肪/油(甘油三酯)。
作為生產(chǎn)中鏈脂肪酸連接至1、3位而花生四烯酸連接至第2位的甘油三酯的特異性方法之一，能夠在含有花生四烯酸的脂肪/油(甘油三酯)和中鏈脂肪酸的存在下通過只作用于甘油三酯的1，3位酯鍵的脂肪酶的作用而生產(chǎn)該甘油三酯。
用作起始材料的脂肪/油(甘油三酯)是一種組成脂肪酸為花生四烯酸的甘油三酯，且當(dāng)花生四烯酸與組成甘油三酯的總脂肪酸的比例較高時(shí)，為了預(yù)防未反應(yīng)的脂肪/油材料(起始甘油三酯以及只有1、3位的一個(gè)脂肪酸為中鏈脂肪酸的甘油三酯)的增加所導(dǎo)致的反應(yīng)產(chǎn)量的降低，將溫度設(shè)定于30到50℃，或優(yōu)選40到50℃，比一般的酶反應(yīng)溫度20到30℃高。
特異性作用于甘油三酯1，3位點(diǎn)酯鍵的酯酶的例子為由諸如根霉屬(Rhizopus)、根毛霉屬(Rhizomucor)和曲霉屬(Aspergillus)的微生物生產(chǎn)的脂酶以及豬胰脂肪酶。關(guān)于這種脂肪酶，可使用商購(gòu)獲得的產(chǎn)品。實(shí)例包括，但不限于，德列馬根霉(Rhizopus delemar)的脂酶(Tanabe Seiyaku制備的Talipase)、米赫根毛酶(Rhizomucormiehei)的脂酶(Novo Nordisk，Ribozyme IM)和黑曲霉(Aspergillusniger)的脂酶(Amano Seiyaku，Lipase A)，以及可以使用的任何脂酶，前提條件是它對(duì)1、3-位是特異性的。
至于使用上述脂肪酶的形式，為了提高反應(yīng)效率的目的以及對(duì)增加酶的耐熱性的目的，需要采用用固定載體固定的脂肪酶，使反應(yīng)溫度不低于30℃，或優(yōu)選不低于40℃。至于固定載體，具有不小于100?？讖降母叨榷嗫讟渲碾x子交換樹脂載體可以作為例證，例如DowexMarathon WBA(商品名；Dow Chemical)。
固定載體的一部分懸浮于0.5到20份重量的1，3位點(diǎn)特異性脂肪酶水溶液中，向懸浮液中邊攪拌邊緩緩加入2到5份冷丙酮(如，-80℃)，由此形成沉淀物。通過在真空中干燥沉淀物而制備固定的酶。在一種簡(jiǎn)單的方法中，將0.05到4份的1，3位點(diǎn)特異性脂肪酶，1份的固定載體溶解于最少量的水中，攪動(dòng)以混合固定載體，將混合物真空干燥以制備固定的酶。作為這種操作的結(jié)果，大約90％的脂肪酶被固定于載體，但該產(chǎn)物并未表現(xiàn)出任何的轉(zhuǎn)酯作用活性。因此，當(dāng)將其在加入了1到10％(w/v)的水的底物，優(yōu)選在加入了1到3％的水的底物中預(yù)處理時(shí)(含有起始脂肪/油和中鏈脂肪酸)，固定的酶能夠被最大效率地活化且用于生產(chǎn)。
在一些類型的酶中，在本發(fā)明的反應(yīng)體系中加入的水的量非常重要，因此，當(dāng)不含水時(shí)，很難發(fā)生轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，而當(dāng)水的量很大時(shí)，發(fā)生水解反應(yīng)，且甘油酯的回收率降低(當(dāng)發(fā)生水解時(shí)，產(chǎn)生甘油二酯和甘油一酯)。然而，當(dāng)在那種情況下采用預(yù)處理的方式活化固定的酶時(shí)，在本發(fā)明的反應(yīng)體系中加入的水的量不再重要，且即便在一點(diǎn)也不含水的體系中，轉(zhuǎn)酯反應(yīng)也能有效地進(jìn)行。當(dāng)適時(shí)地選擇酶制備的類型時(shí)，也可以忽略預(yù)處理。
當(dāng)采用這種耐熱固定酶和提高酶反應(yīng)溫度時(shí)，現(xiàn)在可以有效地生產(chǎn)中鏈脂肪酸連接至1、3位而花生四烯酸連接至第2位的甘油三酯，即便在含有花生四烯酸的脂肪/油(甘油三酯)對(duì)1，3位點(diǎn)特異性脂肪酶低反應(yīng)的情況下仍不降低反應(yīng)性。
在一種生產(chǎn)具有使超晝夜節(jié)律正常化的功能和/或使晝夜節(jié)律(生物鐘)的同步化改善的作用的食品/飲料的方法中，一種為花生四烯酸的化合物和/或花生四烯酸為組成性脂肪酸的化合物能夠與實(shí)質(zhì)上不含花生四烯酸或如果含有，量也很少的飲料/食品材料復(fù)合。這里量很少的表達(dá)表示即便當(dāng)飲料/食品材料中含有花生四烯酸，以及當(dāng)與之復(fù)合的食品組合物被人攝取，其含量仍然低于后文將提及的本發(fā)明的花生四烯酸的每日攝取量。
特別是在甘油三酯的部分或全部的組成脂肪酸為花生四烯酸的情況下，關(guān)于脂肪/油(甘油三酯)的應(yīng)用有無限的可能性，可以用作食品、飲料、藥品、準(zhǔn)藥品和其添加劑材料。對(duì)其應(yīng)用目的和應(yīng)用量沒有任何限制。
除了一般的食品，食品組合物的例子為功能性食品、營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物、早期嬰兒的精制奶、嬰兒精制奶、嬰兒食品、孕婦和哺乳母親食品以及老年人食品。含有脂肪/油的食品的例子為本身含有脂肪/油的天然食品，例如肉、魚和堅(jiān)果；烹飪中加入脂肪/油的食品如湯；作為加熱基質(zhì)加入脂肪/油的食品如油炸圈；脂肪/油食品如黃油；加工時(shí)加入脂肪/油的加工食品如甜餅；以及加工結(jié)束時(shí)噴灑或施用脂肪/油的食品如硬餅干。也可以向不含脂肪/油的農(nóng)作物食品、發(fā)酵食品、家畜食品、海洋食品或飲料中加入。另外，可以接受功能性食品、藥品和準(zhǔn)藥品的形式，可以是例如腸營(yíng)養(yǎng)素、粉末、顆粒、片劑、口服液、懸浮液、乳液和糖漿等的加工形式。
除了本發(fā)明的有效成分外，本發(fā)明的組合物可以含有多種通常用于飲料/食品、藥物或準(zhǔn)藥品的載體以及添加劑。為了預(yù)防本發(fā)明的有效成分的氧化，特別優(yōu)選含有抗氧化劑?？寡趸瘎┑睦訛樘烊晃镔|(zhì)，例如維生素E化合物、黃酮衍生物、甜茶內(nèi)酯化合物、曲酸，沒食子酸衍生物、兒茶素化合物、fukiic酸、棉酚、吡嗪衍生物、芝麻酚、guaiaol，、guaiacic酸、p-香豆酸(p-coumalic acid)、去甲二氫愈創(chuàng)木酸、固醇化合物、萜烯化合物、核酸堿基化合物、類胡蘿卜素化合物和木脂體(lignan)化合物，以及以抗壞血酸棕櫚酸鹽、抗壞血酸硬脂酸鹽、丁基羥基苯甲醚(butylhydroxyanisole，BHA)、丁基羥基甲苯(butylhydroxytoluene，BHT)、一叔丁基氫醌(mono-tert-butylhydroquinone，TBHQ)、4-羥甲基-2，6-二叔丁基苯酚(4-hydroxymethyl-2，6-di-tert-butylphenol，HMBP)為代表的合成物質(zhì)。
維生素E化合物的例子為α-維生素E、β-維生素E、γ-維生素E、δ-維生素E、ε-維生素E、ζ-維生素E、η-維生素E以及維生素E酯(例如維生素E醋酸鹽)。類胡蘿卜素化合物的例子為β-胡蘿卜素、角黃素以及蝦青素。
除了本發(fā)明的有效成分外，本發(fā)明的組合物可以包括如多種載體的載體、膨脹劑(extender)、稀釋劑、填充劑、分散劑、賦形劑、粘合劑、溶解劑(如水、乙醇和植物油)、溶解輔助劑、緩沖劑、溶解促進(jìn)劑、膠凝劑、懸浮劑、面粉、米粉、淀粉、玉米淀粉、多糖、乳蛋白、膠原、稻米油以及卵磷脂，而添加劑的例子為維生素化合物、甜味劑、有機(jī)酸、著色劑、香味劑、防潮劑、纖維、電解液、礦物質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)素、抗氧化劑、防腐劑、芳香劑、濕潤(rùn)劑以及天然食物提取物和植物提取物，但并不限于這些。
花生四烯酸和花生四烯酸為組成脂肪酸的化合物的主要藥學(xué)成分為花生四烯酸。已經(jīng)報(bào)道在Kanto區(qū)每天從食物中攝入的花生四烯酸的量為0.14g，在Kansai區(qū)為0.19到0.20g(Shishitsu Eiyogaku，4，73-82，1995)，必需攝入相應(yīng)或更多量的花生四烯酸。相應(yīng)地，根據(jù)本發(fā)明，按照花生四烯酸的量計(jì)算，成年人(如體重為60kg)每天花生四烯酸和花生四烯酸為組成脂肪酸的化合物的攝取量為0.001到20g，優(yōu)選0.01到10g，更優(yōu)選0.05到5g且最優(yōu)選0.1到2g。
當(dāng)本發(fā)明的有效成分應(yīng)用于飲料/食品時(shí)，與食品復(fù)合的花生四烯酸的絕對(duì)量也很重要。然而，由于與飲料/食品復(fù)合的絕對(duì)量根據(jù)欲被復(fù)合的飲料/食品的攝入量而變化，當(dāng)含有部分或全部組成的脂肪酸為花生四烯酸的甘油三酯的甘油三酯與食品復(fù)合時(shí)，復(fù)合按照花生四烯酸的量不少于0.0003％重量進(jìn)行，優(yōu)選不少于0.003％重量或更優(yōu)選不少于0.03％重量進(jìn)行。另外，當(dāng)中鏈脂肪酸連接至1、3位而花生四烯酸連接至第2位的甘油三酯與食品復(fù)合時(shí)，作為中鏈脂肪酸連接至1、3位而花生四烯酸連接至第2位的甘油三酯，其含量不少于0.001％重量，優(yōu)選不少于0.01％重量，或更優(yōu)選地，不少于0.1％重量。
當(dāng)本發(fā)明的組合物用作藥物時(shí)，通過藥物制備領(lǐng)域常用的方法來生產(chǎn)，例如日本藥典中提及的方法及其類似的方法。
當(dāng)本發(fā)明的組合物用作藥物時(shí)，只要達(dá)到本發(fā)明的目標(biāo)，并不特別限制組合物中有效成分的復(fù)合量，但應(yīng)當(dāng)采用合適的復(fù)合比例。
當(dāng)本發(fā)明的組合物用作藥物時(shí)，優(yōu)選以單位劑量的形式給藥，且特別優(yōu)選口服給藥。本發(fā)明的組合物的劑量可以根據(jù)年齡、體重、癥狀、給藥頻率等改變，例如，根據(jù)本發(fā)明，按照花生四烯酸的量計(jì)算，推薦成年人(大約60kg)每天的花生四烯酸化合物和/或花生四烯酸為組成脂肪酸的化合物的施用量為大約0.001到20g，優(yōu)選大約0.01到10g，更優(yōu)選大約0.05到5g或最優(yōu)選大約0.1到2g，1天分1到3次給藥。
生物鐘位于大腦中的視上核。大腦磷脂膜的主要脂肪酸是花生四烯酸和二十二碳六烯酸，且當(dāng)考慮到它們的平衡時(shí)，在本發(fā)明的組合物中優(yōu)選花生四烯酸與二十二碳六烯酸的組合。通常，花生四烯酸(n-6型不飽和脂肪酸)和二十二碳六烯酸(n-3型不飽和酸)為用同樣的酶分別從亞麻酸和α-亞麻酸生物合成的。因此，當(dāng)單獨(dú)給予花生四烯酸時(shí)，它抑制了二十二碳六烯酸的生物合成。另一方面，當(dāng)單獨(dú)給予二十二碳六烯酸時(shí)，抑制了花生四烯酸的合成。
為了預(yù)防這一缺陷，需要花生四烯酸和二十二碳六烯酸組合攝入。由于大腦的磷脂膜中的二十碳五烯酸的比例很低需要很少含有二十碳五烯酸。最優(yōu)選很少含有二十碳五烯酸且含有花生四烯酸和二十二碳六烯酸的組合物。在花生四烯酸與二十二碳六烯酸的組合中，花生四烯酸/二十二碳六烯酸的比例(重量比)需要在0.1到15范圍內(nèi)，優(yōu)選0.25到10。最優(yōu)選其中混合了少于花生四烯酸的五分之一(重量比)的二十碳五烯酸的飲料/食品。
實(shí)施例下面通過實(shí)施例的方式更加具體地闡述本發(fā)明，然而本發(fā)明并非限于下列實(shí)施例。
本發(fā)明的食品組合物為飲料/食品、健康食品、功能性食品、指定的健康食品、嬰兒和老年人食品，包括通過在包裝所述的食品組合物的容器上和/或促進(jìn)所述的食品組合物的銷售的工具(如宣傳冊(cè))上描述或顯示下列事實(shí)而銷售的情形。因此，它們是所述的食品組合物和/或所述食品組合物的成分具有使超晝夜節(jié)律正常化的作用和/或使晝夜節(jié)律(生物鐘)的同步化改善的作用，且具有對(duì)由晝夜節(jié)律異常導(dǎo)致的生物節(jié)律失調(diào)、睡眠失調(diào)和延遲睡眠階段綜合征以及晝夜節(jié)律同步化延遲的病癥(時(shí)差癥、頭痛、耳鳴、心悸、惡心、胃痛、腹瀉和判斷和注意力的下降)的預(yù)防或改善作用實(shí)施例1.生產(chǎn)含有花生四烯酸作為組成脂肪酸的甘油三酯的方法采用高山被孢霉作為生產(chǎn)花生四烯酸的微生物。在10kL發(fā)酵罐中制備含有1.8％的葡萄糖、3.1％的脫脂大豆粉、0.1％的大豆油、0.3％的KH2PO4、0.1％的Na2SO4、0.05％的CaCl2.2H2O和0.05％的MgCl2.6H2O的培養(yǎng)基(6kL)，調(diào)整起始pH為6.0。將預(yù)培養(yǎng)溶液(30L)接種，并在溫度為26℃、通風(fēng)為360m3/小時(shí)和內(nèi)部壓力為200kPa的條件下將其置于通風(fēng)攪拌培養(yǎng)8天。攪拌的速率調(diào)整至保持溶解的氧濃度為10到15ppm。關(guān)于葡萄糖的濃度，通過flowing-down法將培養(yǎng)基內(nèi)的濃度設(shè)置為在1到2.5％的范圍內(nèi)，直到第4天，之后將其維持在0.5到1％(上文的％表示重量(w/v)％)。
在培養(yǎng)完成后，通過過濾和干燥回收含有花生四烯酸為組成脂肪酸的甘油三酯的細(xì)胞，并用己烷從得到的細(xì)胞中提取脂肪/油，且進(jìn)行純化步驟以獲得可食用的脂肪/油(脫膠、脫酸、脫臭和脫色)，以產(chǎn)生150kg含有花生四烯酸的甘油三酯(其中花生四烯酸連接至甘油三酯的任意位置)。將獲得的脂肪/油(甘油三酯)制成甲酯，用氣相色譜分析獲得的脂肪酸甲酯，其中花生四烯酸在總脂肪酸的比例為40.84％。
另外，棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞麻酸、γ-亞麻酸以及雙高-γ-亞麻酸分別為11.63％、7.45％、7.73％、9.14％、2.23％和3.27％。另外，將上述的含有花生四烯酸的脂肪/油(甘油三酯)制成乙酯，將含有40％花生四烯酸乙酯的脂肪酸乙酯混合物用常規(guī)的高效液相色譜進(jìn)行分離，獲得99％純度的花生四烯酸乙酯。
實(shí)施例2.含有不少于5％的中鏈脂肪酸連接至1、3位而花生四烯酸連接至第2位的甘油三酯(8A8)的甘油三酯的制備將離子交換樹脂載體(Dowex Marathon WBA；Dow Chemical；TradeMark)(100g)懸浮在80ml 12.5％的德列馬根霉(Rhizopus delemar)脂肪酶(Talipase Powder；Tanabe Seiyaku)水溶液中，并真空干燥以產(chǎn)生固定脂肪酶。
之后，采用實(shí)施例1中制備的80g含有40％重量比的花生四烯酸的甘油三酯(TGA 40S)、160g辛酸、12g上述的固定脂肪酶和4.8ml水在30℃攪拌(130rpm)進(jìn)行反應(yīng)48小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，去除反應(yīng)溶液以產(chǎn)生活化的固定脂肪酶。
接著將固定脂肪酶(德列馬根霉脂肪酶；載體Dowex MarathonWBA，商標(biāo))(10g)裝入配有包裝套的玻璃柱中(1.8×12.5cm；體積31.8ml)，實(shí)施例1中制備的TGA 40S和辛酸按1∶2混合的混合脂肪/油以恒定的流速(4ml/小時(shí))流入柱子，以進(jìn)行持續(xù)反應(yīng)，產(chǎn)生400g的反應(yīng)脂肪/油。同時(shí)，柱子的溫度保持為40到41℃。從獲得的反應(yīng)脂肪/油中，通過分子蒸餾將未反應(yīng)的辛酸和游離脂肪酸除去，然后進(jìn)行純化步驟以獲得可食用的脂肪/油(脫膠、脫酸、脫臭脫臭和脫色)，以產(chǎn)生含有8A8的脂肪/油(甘油三酯)。
當(dāng)檢測(cè)用氣相色譜和高效液相色譜制備的含有8A8的脂肪/油(甘油三酯)中的8A8比率時(shí)，為31.6％(順便提及，8P8、8O8、8L8、8G8和8D8的比率分別為0.6、7.9、15.1、5.2和4.8％。結(jié)合到甘油三酯二位的脂肪酸P、O、L、G和D分別為棕櫚酸、油酸、亞麻酸、γ-亞麻酸、和雙高-γ-亞麻酸，8P8為1，3-辛酰-2-棕櫚酰-甘油，8O8為1，3-辛酰-2-油酰-甘油，8L8為1，3-辛酰-2-亞麻酰-甘油，8G8為1，3-辛酰-2-γ-亞麻酰-甘油以及8D8為1，3-辛酰-2-雙高-γ-亞麻酰-甘油)。順便提及，將得到的含有8A8的脂肪/油(甘油三酯)用常規(guī)的高效液相色譜進(jìn)行分離和純化，得到96mol％的8A8。
實(shí)施例3.含花生四烯酸的脂肪/油對(duì)光照和黑暗周期的相變(phase change)的同步化促進(jìn)作用在大鼠中研究了實(shí)施例1中制備的以花生四烯酸為組成脂肪酸的甘油三酯(含花生四烯酸的脂肪/油)對(duì)光照和黑暗周期的相變的影響。
大鼠具有大多在光照階段休息(睡覺)，而在黑暗期間活動(dòng)的習(xí)性。因此將光照和黑暗周期改變?yōu)槠?小時(shí)前和6小時(shí)后的范圍，以天的方式檢測(cè)了對(duì)同步化影響，直到達(dá)到對(duì)新的光照和黑暗周期的同步化。順便提及的是，為了評(píng)估同步化，通過連續(xù)測(cè)量日間的活動(dòng)量并檢測(cè)在光照期間和黑暗期間活動(dòng)量隨時(shí)間的變化，而研究大鼠的超晝夜節(jié)律。
按照將大鼠在安裝了紅外線傳感器的盒子中分別飼養(yǎng)，用紅外線傳感器對(duì)運(yùn)動(dòng)量進(jìn)行計(jì)數(shù)的形式對(duì)大鼠的超晝夜運(yùn)動(dòng)量進(jìn)行檢測(cè)。因此，每當(dāng)動(dòng)物經(jīng)過紅外線傳感器，都計(jì)數(shù)一次，數(shù)字被整合以產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)量(計(jì)數(shù))。用ANOVA和Student′st檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。
18個(gè)月大小的20只雄性Fischer種系的大鼠被分為2組，對(duì)照飼料組(10只大鼠OC(18M)組)和含花生四烯酸脂肪/油復(fù)合飼料組(10只大鼠OA(18M)組)，在預(yù)飼養(yǎng)大約2周后，給與列于表1的對(duì)照飼料和含花生四烯酸脂肪/油復(fù)合飼料。
表1.試驗(yàn)飼料

大鼠攝入飼料的量為大約20g，每天每只大鼠攝入的含有花生四烯酸的脂肪/油的量為0.1g。與實(shí)施例1中制備的含有花生四烯酸的脂肪/油結(jié)合的總脂肪酸中，花生四烯酸占40％，因此，每只大鼠每天攝入的花生四烯酸的量為40mg。對(duì)人攝入量而言，40mg相應(yīng)于133mg/60kg/天。將動(dòng)物在動(dòng)物室飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度保持在23.5±1℃，濕度保持在55±5％，且讓動(dòng)物自由攝入飼料和飲水。光照和黑暗周期包括12小時(shí)的(01:00到13:00)黑暗期和12小時(shí)(13:00到01:00)的光照期間。
從攝入試驗(yàn)飼料的2周后開始持續(xù)檢測(cè)超晝夜移動(dòng)量(記錄位相的開始)。每天，計(jì)算運(yùn)動(dòng)總量和光照階段運(yùn)動(dòng)與運(yùn)動(dòng)總量的比例([光照期間的運(yùn)動(dòng)量]/[運(yùn)動(dòng)總量]×100％)。從記錄階段的起始開始的第十天(開始飼養(yǎng)的第40天，開始攝入試驗(yàn)飼料的第26天)，將光照和黑暗周期的位相(phase)推后6小時(shí)(12小時(shí)的黑暗期(07:00到19:00)以及12小時(shí)的光照期間(19:00到07:00))，直到確定晝夜節(jié)律同步化的日子。接著，10天后，(記錄階段開始后第20天)，將光照和黑暗周期位相提前6小時(shí)(12小時(shí)的黑暗期(01:00到13:00)以及12小時(shí)的光照期(13:00到01:00))，直到確定晝夜節(jié)律同步化的日子。
按照下列方式進(jìn)行同樣的試驗(yàn)，將8只Fischer種系的2個(gè)月大小的雄性大鼠分為2組，對(duì)照組(4只大鼠；YC(2M)組)以及含有花生四烯酸的脂肪/油復(fù)合飼料組(4只大鼠；YA(2M)組)，另外，將8只Fischer種系的22個(gè)月大小的雄性大鼠分為2組，對(duì)照組(4只大鼠；OC(22M)組)以及含有花生四烯酸的脂肪/油復(fù)合飼料組(4只大鼠；OA(22M)組)。
顯示了2個(gè)月、18個(gè)月和22個(gè)月的對(duì)照飼料組和含有花生四烯酸的脂肪/油復(fù)合飼料組的12小時(shí)光照階段的運(yùn)動(dòng)率(％)(圖1)。很明顯，當(dāng)攝入含有花生四烯酸的脂肪/油時(shí)，年老大鼠(18M和22M)的12小時(shí)的光照階段的運(yùn)動(dòng)率(％)顯著地抑制，由此優(yōu)化了超晝夜節(jié)律。
接著，圖2顯示了2個(gè)月、18個(gè)月和22個(gè)月的對(duì)照飼料組和含有花生四烯酸的脂肪/油復(fù)合飼料組大鼠位相推后和提前6小時(shí)后同步化所需要的天數(shù)(圖2)。至于環(huán)境的光照和黑暗周期位相改變期間的晝夜節(jié)律同步化所需要的時(shí)間(天)，在年輕(2M)大鼠中，位相提前比位相推后所需時(shí)間更長(zhǎng)，而在年老大鼠(18M和22M)中，位相推后比位相提前所需時(shí)間更長(zhǎng)。然而，作為攝入含花生四烯酸的脂肪/油的結(jié)果，同步化所需的時(shí)間(天)顯著縮短。由于這在年老大鼠中特別有效，確定了在衰老晝夜節(jié)律的光照同步化的改變，而不是節(jié)律分派(rhythm dispatch)，花生四烯酸具有調(diào)整因衰老而變化的作用。
實(shí)施例4.含有花生四烯酸的脂肪/油對(duì)光照刺激24小時(shí)黑暗條件下飼養(yǎng)(自由運(yùn)動(dòng))的大鼠使位相推后和位相提前的同步化的改善作用當(dāng)在黑暗條件下飼養(yǎng)24小時(shí)后，沒有從外界獲得信息(光)，因此大鼠在固有的時(shí)期(生物鐘)(被稱為自由運(yùn)轉(zhuǎn)，含義為不受同步化影響)變得活躍。當(dāng)計(jì)算基于24小時(shí)的自由運(yùn)轉(zhuǎn)周期，在定義為晝夜節(jié)律時(shí)間的橫坐標(biāo)上表示時(shí)，其開始的一半(12小時(shí))稱為個(gè)體日間(生物鐘判斷其為日間，大鼠休息)而第二個(gè)一半(12小時(shí))稱為個(gè)體夜間(生物鐘判斷其為夜間，小鼠變得活躍)。當(dāng)光照射大鼠時(shí)，自由運(yùn)轉(zhuǎn)的節(jié)律位相根據(jù)該時(shí)期向前或向后移動(dòng)。例如在15:00的晝夜節(jié)律時(shí)間，用130luxes的光照射以檢測(cè)位相的向后移動(dòng)，在20:00的節(jié)律時(shí)間，同樣的光照照射以檢測(cè)位相的向前移動(dòng)。
將18個(gè)月大小Fischer種系的20只雄性大鼠分為2組，對(duì)照飼料組(10只大鼠OC(18M)組)和含花生四烯酸脂肪/油復(fù)合飼料組(10只大鼠OA(18M)組)，在與實(shí)施例3相同，預(yù)飼養(yǎng)2周后，每組給與列于表1的對(duì)照飼料和含花生四烯酸脂肪/油復(fù)合飼料。
大鼠攝入飼料的量為大約20g，每天每只大鼠攝入的含有花生四烯酸的脂肪/油的量為0.1g。實(shí)施例1中制備的與含有花生四烯酸的脂肪/油結(jié)合的總脂肪酸中，花生四烯酸占40％，因此，每只大鼠每天攝入的花生四烯酸的量為40mg。對(duì)人攝入量而言，40mg相應(yīng)于133mg/60kg/天。將動(dòng)物在動(dòng)物室飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度保持在23.5±1℃，濕度保持在55±5％，且讓動(dòng)物自由攝入飼料和飲水。光照和黑暗周期包括12小時(shí)的(01:00到13:00)黑暗期和12小時(shí)(13:00到01:00)的光照期。
從攝入試驗(yàn)飼料的第70天，開始24小時(shí)黑暗條件下(自由運(yùn)轉(zhuǎn))的飼養(yǎng)，連續(xù)測(cè)量超晝夜的運(yùn)動(dòng)(記錄位相的開始)。從自由運(yùn)轉(zhuǎn)飼養(yǎng)的2周后，用130luxes的光在已經(jīng)提及的15:00的晝夜節(jié)律時(shí)間照射30分鐘，測(cè)量位相的移動(dòng)量(小時(shí))。接著，2周后，在20:00的晝夜節(jié)律時(shí)間用光同樣照射，測(cè)量位相的移動(dòng)量(小時(shí))。將8只Fischer種系的2個(gè)月大小的雄性大鼠分為對(duì)照組(4只大鼠；YC(2M)組)以及含有花生四烯酸的脂肪/油復(fù)合飼料組(4只大鼠；YA(2M)組)進(jìn)行同樣的試驗(yàn)。
另外，將8只Fischer種系的22個(gè)月大小的雄性大鼠分為2組，對(duì)照飼料組(4只大鼠；OC(22M)組)以及含有花生四烯酸的脂肪/油復(fù)合飼料組(4只大鼠；OA(22M)組)，在包括12小時(shí)(01:00到13:00)的黑暗期和12小時(shí)(13:00到01:00)的光照期的光照和黑暗循環(huán)下飼養(yǎng)8天，接著開始24小時(shí)黑暗條件下飼養(yǎng)(自由運(yùn)轉(zhuǎn))，同時(shí)開始攝入試驗(yàn)食物，持續(xù)測(cè)量超晝夜運(yùn)動(dòng)量(位相記錄的開始)。從自由運(yùn)轉(zhuǎn)飼養(yǎng)的第12天，用130luxes的光照在15:00的晝夜節(jié)律時(shí)間照射30分鐘，測(cè)量位相的移動(dòng)量(小時(shí))。接著，2周后在20:00的晝夜節(jié)律時(shí)間用光同樣照射，測(cè)量位相的移動(dòng)量(小時(shí))。
結(jié)果在圖3中顯示。在2個(gè)月、18個(gè)月和22個(gè)月的對(duì)照飼料組中，年齡對(duì)光照的晝夜節(jié)律的位相移動(dòng)量沒有大的影響，而作為攝入含有花生四烯酸的脂肪/油的結(jié)果，位相移動(dòng)量增加了。
實(shí)施例5.光照和黑暗循環(huán)中8A8(96mol％)對(duì)相變的同步化的改善作用實(shí)施例2中制備的8A8(96mol％)對(duì)光照和黑暗循環(huán)的相變的影響按照與實(shí)施例3相同的方式進(jìn)行。
將18個(gè)月大小Fischer種系的20只雄性大鼠分為2組，對(duì)照飼料組(10只大鼠OC(18M)組)和8A8復(fù)合飼養(yǎng)組(10只大鼠OA(18M)組)，每組給與列于表2的對(duì)照飼料和8A8復(fù)合飼料。
表2.試驗(yàn)飼料

大鼠攝入飼料的量為大約20g，每天每只大鼠攝入的含有花生四烯酸的脂肪/油的量為0.1g。因此，每只大鼠每天攝入的花生四烯酸的量為40mg。對(duì)人攝入量而言，40mg相應(yīng)于133mg/60kg/天。將動(dòng)物在動(dòng)物室飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度保持在23.5±1℃，濕度保持在55±5％，且讓動(dòng)物隨意攝入飼料和飲水。光照和黑暗周期包括12小時(shí)的(01:00到13:00)黑暗期和12小時(shí)(13:00到01:00)的光照期間。從攝入試驗(yàn)飼料的2周后開始持續(xù)檢測(cè)超晝夜運(yùn)動(dòng)量(位相記錄的開始)。每天，計(jì)算運(yùn)動(dòng)總量和光照階段運(yùn)動(dòng)與運(yùn)動(dòng)總量的比例([光照期間的運(yùn)動(dòng)量]/[運(yùn)動(dòng)總量]×100％)。
從記錄位相的起始開始的第十天(開始飼養(yǎng)的第40天，開始攝入試驗(yàn)飼料的第26天)，將光照和黑暗周期的位相推后6小時(shí)(12小時(shí)的黑暗期(07:00到19:00)以及12小時(shí)的光照期(19:00到07:00))，確定直到晝夜節(jié)律同步化的日子。接著，10天后(位相記錄開始后第20天)，將光照和黑暗周期位相提前6小時(shí)(12小時(shí)的黑暗期(01:00到13:00)以及12小時(shí)的光照期(13:00到01:00))，直到確定晝夜節(jié)律同步化的日子。將8只Fischer種系的2個(gè)月大小的雄性大鼠分為2組，對(duì)照飼料組(4只大鼠；YC(2M)組)以及8A8復(fù)合飼料組(4只大鼠；YA(2M)組)，按照這樣的方式進(jìn)行同樣的試驗(yàn)。
關(guān)于位相向后移動(dòng)的同步化天數(shù)，2個(gè)月的對(duì)照飼料組和8A8復(fù)合飼料組大鼠同步化所需要的天數(shù)分別為3.7天和4.1天，18個(gè)月大小的分別為7.28天和5.72天。關(guān)于位相向前移動(dòng)的同步化天數(shù)，2個(gè)月的對(duì)照飼料組和8A8復(fù)合飼料組大鼠同步化所需要的天數(shù)分別為9.8天和9.43天，18個(gè)月大小的分別5.63天和3.32天。因此作為攝入8A8的結(jié)果，縮短了需要的同步化的時(shí)間(天數(shù))。
實(shí)施例6.制備復(fù)合了含有花生四烯酸作為組成脂肪酸的脂肪/油(甘油三酯)的膠囊的實(shí)例將作為食品添加劑的明膠(100重量份)和35重量份的甘油溶解在50到60℃的水中，以制備具有2,000cps粘度的明膠膜。接著，將實(shí)施例1中制備的含有花生四烯酸的脂肪/油(甘油三酯)與0.05％重量比的維生素E油混合，制備成分1。將實(shí)施例2中制備的含32mol％的8A8的脂肪/油(甘油三酯)與0.05％重量比的維生素E油復(fù)合，制備成分2。
之后，將50％重量的實(shí)施例1中制備的含花生四烯酸的脂肪/油(甘油三酯)與50％重量的魚油(鮪魚(tuna)油二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸在總脂肪酸的比例分別為5.1％和26.5％)混合，接著將0.05％重量的維生素E油與其混合產(chǎn)生成分3。將80％重量的含有花生四烯酸的脂肪/油(甘油三酯)與20％重量的魚油(鮪魚(tuna)油二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸在總脂肪酸的比例分別為5.1％和26.5％)，接著，將0.05％重量的維生素E油與其混合，產(chǎn)生成分4。將99％的實(shí)施例1中制備的花生四烯酸乙酯與0.05％重量的維生素E油混合以制備成分5。用這些成分1到5進(jìn)行膠囊制造，且用常規(guī)方法干燥以產(chǎn)生每個(gè)含有200mg成分的軟膠囊。
實(shí)施例7.脂肪輸液(transfusion)的應(yīng)用將含有96％的實(shí)施例2中制備的8A8的脂肪/油(甘油三酯)(400g)、48g純化的卵黃卵磷脂、20g油酸、100g甘油和40ml 0.1N的氫氧化鈉混合并均質(zhì)化，接著加入注射用蒸餾水至4升。采用高壓噴霧乳化器將其乳化以制備脂質(zhì)乳液。將每200ml的脂質(zhì)乳液裝入塑料袋中，并用高壓蒸汽在121℃滅菌20分鐘，以生產(chǎn)脂肪輸液。
實(shí)施例8.果汁的應(yīng)用將β-環(huán)糊精(2g)加入20ml的20％乙醇水溶液，將100mg實(shí)施例1中制備的含有花生四烯酸的甘油三酯(與0.05％的維生素E復(fù)合)加入其中，并在50℃下溫育混合物2小時(shí)。在冷卻至室溫后(大約1小時(shí))，另外在4℃下邊攪拌邊進(jìn)行溫育10小時(shí)。通過離心分離回收獲得的沉淀物，用正己烷沖洗并冷凍干燥，產(chǎn)生1.8g的包含含有花生四烯酸的甘油三酯的環(huán)糊精的包含復(fù)合物。將粉末(1g)與10升果汁均質(zhì)地混合，以制備含有花生四烯酸的甘油三酯的果汁。
權(quán)利要求
1.一種具有使超晝夜節(jié)律正?；淖饔煤?或使晝夜節(jié)律(生物鐘)的同步化改善的作用的組合物，含有花生四烯酸和/或含花生四烯酸的化合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中含花生四烯酸的化合物為花生四烯酸醇酯或含有花生四烯酸作為一部分或所有的組成脂肪酸的甘油三酯、磷脂或糖脂。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的組合物，其中含有花生四烯酸作為一部分或所有的組成脂肪酸的甘油三酯為中鏈脂肪酸連接至1、3位而花生四烯酸連接至2位的甘油三酯。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的組合物，其中中鏈脂肪酸選自具有6到12個(gè)碳原子的脂肪酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的組合物，其中中鏈脂肪酸選自具有8個(gè)碳原子的脂肪酸。
6.一種具有使超晝夜節(jié)律正常化的作用和/或使晝夜節(jié)律(生物鐘)的同步化改善的作用的組合物，含有甘油三酯類，所述的甘油三酯類包含含有花生四烯酸作為所有或一部分組成脂肪酸的甘油三酯。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的組合物，其中含有包含花生四烯酸作為所有或一部分組成脂肪酸的甘油三酯的甘油三酯類的花生四烯酸不低于組成甘油三酯的總脂肪酸的10％重量。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7的組合物，其中含有花生四烯酸作為所有或一部分組成脂肪酸的甘油三酯從屬于被孢霉屬(Motiierella)的微生物中提取。
9.根據(jù)權(quán)利要求6到8的任一項(xiàng)的組合物，其中含有花生四烯酸作為所有或一部分組成脂肪酸的甘油三酯為不含二十碳五烯酸或即使含有，量也不超過1％的甘油三酯。
10.一種具有使超晝夜節(jié)律正?；淖饔煤?或使晝夜節(jié)律(生物鐘)的同步化改善的作用的組合物，含有甘油三酯類，所述的甘油三酯類含有不少于5mol％的中鏈脂肪酸連接至1、3位而花生四烯酸連接至2位的甘油三酯。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的組合物，其中中鏈脂肪酸選自具有6到12個(gè)碳原子的脂肪酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的組合物，其中中鏈脂肪酸選自具有8個(gè)碳原子的脂肪酸。
13.權(quán)利要求1到12所述的組合物，對(duì)由超晝夜節(jié)律異常導(dǎo)致的生物節(jié)律失調(diào)具有預(yù)防或減輕作用。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的組合物，其中該組合物對(duì)生物節(jié)律失調(diào)的睡眠失調(diào)具有預(yù)防或減輕作用。
15.根據(jù)權(quán)利要求13的組合物，其中該組合物對(duì)生物節(jié)律失調(diào)的晝夜節(jié)律(生物鐘)同步化延遲導(dǎo)致的病癥具有預(yù)防或減輕作用。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的組合物，其中該組合物對(duì)由晝夜節(jié)律(生物鐘)同步化延遲導(dǎo)致的時(shí)差癥、頭痛、耳鳴、心悸、惡心、胃痛、腹瀉和判斷和注意力的下降具有預(yù)防或減輕作用。
17.根據(jù)權(quán)利要求13的組合物，其中該組合物對(duì)生物節(jié)律失調(diào)的延遲睡眠階段綜合征具有預(yù)防或減輕作用。
18.權(quán)利要求1到17的任一項(xiàng)所述的組合物，其中該組合物為食品組合物或藥物組合物。
19.一種含有花生四烯酸或含花生四烯酸的化合物的食品組合物，使成年人每天花生四烯酸的攝取量為0.001到20g。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的食品組合物，其中含花生四烯酸的化合物為花生四烯酸醇酯或含有花生四烯酸作為一部分或所有的組成脂肪酸的甘油三酯、磷脂或糖脂。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的食品組合物，其中含有花生四烯酸作為一部分或所有的組成脂肪酸的甘油三酯為中鏈脂肪酸連接至1、3位而花生四烯酸連接至2位的甘油三酯。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的食品組合物，其中中鏈脂肪酸選自具有6到12個(gè)碳原子的脂肪酸。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的組合物，其中中鏈脂肪酸選自具有8個(gè)碳原子的脂肪酸。
24.一種食品組合物，其中含有不少于0.001％重量的中鏈脂肪酸連接至1、3位而花生四烯酸連接至2位的甘油三酯。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的食品組合物，其中中鏈脂肪酸選自具有6到12個(gè)碳原子的脂肪酸。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的食品組合物，其中中鏈脂肪酸選自具有8個(gè)碳原子的脂肪酸。
27.根據(jù)權(quán)利要求19到26任一項(xiàng)的組合物，其中食品組合物為一種功能性食品、營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物、指定的健康食品或老年人食品。
28.一種生產(chǎn)具有使超晝夜節(jié)律正?；淖饔煤?或使晝夜節(jié)律(生物鐘)的同步化改善的作用的組合物的方法，其特征在于將花生四烯酸和/或含花生四烯酸的化合物單獨(dú)或與基本上不含花生四烯酸或，即便含有，量也很少的食品材料一起復(fù)合。
全文摘要
一種具有使超晝夜節(jié)律正?；墓δ芎?或使晝夜節(jié)律(生物鐘)的同步化改善的作用的組合物，含有花生四烯酸和/或含花生四烯酸的化合物。
文檔編號(hào)A61P43/00GK1756544SQ200480005559
公開日2006年4月5日 申請(qǐng)日期2004年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月27日
發(fā)明者秋元健吾, 小野佳子, 河島洋, 永井克也 申請(qǐng)人:三得利株式會(huì)社