本發(fā)明涉及藥物領(lǐng)域，具體地，涉及一種黃酮二葡萄糖醛酸苷類化合物在制備環(huán)氧合酶抑制劑中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

黃酮二葡萄糖醛酸苷類成分，可以從植物(如蒺藜苜蓿)中分離出來，在結(jié)構(gòu)上兩分子葡萄糖醛酸苷通過1-2糖苷鍵相連，再與黃酮苷元苷化。這類結(jié)構(gòu)活性報道很少，主要集中在抗氧化，抗衰老活性。

環(huán)氧合酶(cyclooxygenase,COX)又稱前列腺素(pros-taglandins,PG)內(nèi)過氧化合成酶，為一種膜結(jié)合蛋白，是機體催化花生四烯酸轉(zhuǎn)變?yōu)榍傲邢偎氐南匏倜?。目前研究表明，COX至少存在兩種異構(gòu)體，即COX-1和COX-2。COX-1結(jié)構(gòu)性表達(dá)于大多數(shù)組織細(xì)胞內(nèi)，參與維持生理功能。當(dāng)前，COX抑制劑是抗炎藥物開發(fā)的重要靶點，如我們熟悉的非甾體抗炎藥吲哚美辛、布洛芬等均為COX抑制劑。此外，最新研究也表明，COX抑制劑有可能成為腫瘤、阿爾茨海默癥和動脈粥樣硬化等重大疾病的藥物開發(fā)新靶點。

目前，大多環(huán)氧合酶抑制劑為選擇性抑制劑，即只對COX－1或COX－2有抑制作用，然而，這種選擇性抑制劑通常對胃腸道、心血管有副作用。

因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)一種副作用小、對環(huán)氧合酶抑制效果好的COX抑制劑。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種副作用小、對環(huán)氧合酶抑制效果好的COX抑制劑。

本發(fā)明的第一方面提供了一種式I化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的用途，用于制備(i)抗炎性疾病的組合物或制劑；和/或(ii)環(huán)氧合酶(COX)抑制劑，

式中，R₁為H、甲氧基或羥基；R₂為羥基。

在另一優(yōu)選例中，所述環(huán)氧合酶(COX)抑制劑包括COX-1抑制劑和COX-2抑制劑。

在另一優(yōu)選例中，所述炎性疾病選自下組：神經(jīng)性炎癥、婦科炎癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、或其組合。

在另一優(yōu)選例中，所述炎性疾病選自下組：宮頸炎、陰道炎、或其組合。

在另一優(yōu)選例中，所述式I化合物具有以下一個或多個特點：

(1)抗炎活性；

(2)抑制環(huán)氧合酶的活性。

在另一優(yōu)選例中，所述環(huán)氧合酶選自下組：COX-1、COX-2、或其組合。

在另一優(yōu)選例中，所述抑制環(huán)氧合酶的活性包括共抑制COX-1和COX-2的活性。

在另一優(yōu)選例中，所述的組合物包括：藥物組合物、保健品組合物、或食品組合物、或膳食補充劑組合物。

在另一優(yōu)選例中，所述的組合物為藥物組合物。

在另一優(yōu)選例中，所述的食品組合物包括飲料組合物。

在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物含有(a)式I所示的化合物以及(b)藥學(xué)上可接受的載體。

在另一優(yōu)選例中，所述組分(a)占所述藥物組合物總重量的0.1-99.9wt％,較佳地10-99.9wt％，更佳地70％-99.9wt％。

在另一優(yōu)選例中，所述組分(a)占所述藥物組合物總重量的60.0％-99.5wt％，較佳地70.0-99.5wt％，更佳地80.0％-99.5wt％。

在另一優(yōu)選例中，所述藥物組合物為液態(tài)、固體、或半固體。

在另一優(yōu)選例中，所述藥物組合物的劑型包括片劑、顆粒劑、膠囊、口服液、或注射劑。

在另一優(yōu)選例中，所述組合物為口服制劑。

在另一優(yōu)選例中，所述組合物(如藥物組合物)通過以下方式施用于哺乳動物：口服、靜脈注射、局部施用。

在另一優(yōu)選例中，所述哺乳動物包括人或非人哺乳動物。

在另一優(yōu)選例中，所述非人哺乳動物包括嚙齒動物，如小鼠、大鼠。

在另一優(yōu)選例中，所述式I化合物為黃酮葡萄糖醛酸苷類化合物。

在另一優(yōu)選例中，所述式I化合物為黃酮二葡萄糖醛酸苷類化合物。

在另一優(yōu)選例中，所述式I化合物為植物提取物。

在另一優(yōu)選例中，所述植物選自下組：蒺藜苜蓿、紫珠、海州常山、或其組合。

本發(fā)明第二方面提高了一種用于抗炎的藥物組合物，包括：

(a1)用于抗炎的第一活性成分，所述第一活性成分為式I化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽；和

(a2)用于抗炎的第二活性成分，所述第二活性成分為非甾體抗炎成分；

(b)藥學(xué)上可接受的載體，

其中式I化合物的定義如本發(fā)明第一方面中所述。

在另一優(yōu)選例中，所述非甾體抗炎成分選自下組：吲哚美辛、阿司匹林、或其組合。

在另一優(yōu)選例中，所述第一活性成分和第二活性成分的重量比為1:100至100：1，較佳地為1:10至10：1。

本發(fā)明第三方面提供了一種非治療性的抑制環(huán)氧合酶活性的方法，包括：

在式I化合物存在下，體外培養(yǎng)細(xì)胞，從而抑制細(xì)胞中環(huán)氧合酶的活性。

在另一優(yōu)選例中，所述細(xì)胞表達(dá)環(huán)氧合酶。

在另一優(yōu)選例中，所述環(huán)氧合酶選自下組：COX-1、COX-2、或其組合。

在另一優(yōu)選例中，所述環(huán)氧合酶包括COX-1和COX-2。

本發(fā)明第四方面提供了一種非治療性的抗炎的方法，包括：

(a)給需要的對象施用式I化合物或其藥物組合物，其中式I化合物如本發(fā)明第一方面中所述。

在另一優(yōu)選例中，所述對象包括非人哺乳動物。

在另一優(yōu)選例中，所述對象包括嚙齒動物，如大鼠、小鼠。

在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括步驟：(b)對所述對象進(jìn)行處死，檢測所述對象中環(huán)氧合酶的水平或活性。

在另一優(yōu)選例中，所述環(huán)氧合酶選自下組：COX-1、COX-2、或其組合。

在另一優(yōu)選例中，所述環(huán)氧合酶包括COX-1和COX-2。

本發(fā)明第五方面提供了一種篩選抗炎的候選藥物的方法，所述方法包括步驟：

(a)提供一待測化合物以及陽性對照化合物，所述的陽性對照化合物為式I化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽；

(b)在測試組中，檢測所述待測化合物對環(huán)氧合酶的影響，并與陽性對照組以及陰性對照組中相應(yīng)的實驗結(jié)果進(jìn)行比較，其中，在陽性對照組中，檢測陽性對照化合物對環(huán)氧合酶的影響；

其中，如果所述待測化合物對環(huán)氧合酶的抑制程度顯著高于陰性對照組，則提示所述待測化合物是抗炎的候選藥物。

在另一優(yōu)選例中，在步驟(b)中，將測試組與陽性對照組相比，并比較I1與I2的比值，其中I1為所述待測化合物對環(huán)氧合酶的抑制程度I 1，而I2為陽性對照化合物對環(huán)氧合酶的抑制程度，如果I 1/I2≥80％，則提示所述待測化合物是抗炎的候選藥物。

在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括步驟(c)：對步驟(b)中篩選出的待測化合物，進(jìn)一步測定其抗炎效果。

在另一優(yōu)選例中，所述的“顯著高于”指I1/I0≥2，較佳地≥3，更佳地≥4，

其中，I1為所述待測化合物環(huán)氧合酶的抑制程度；而I0為陰性對照組中環(huán)氧合酶的抑制程度。

在另一優(yōu)選例中，所述的方法是非診斷和非治療性的。

在另一優(yōu)選例中，所述環(huán)氧合酶選自下組：COX-1、COX-2、或其組合。

在另一優(yōu)選例中，所述環(huán)氧合酶包括COX-1和COX-2。

本發(fā)明第六方面提供了一種治療炎性疾病的方法，包括：

給需要的哺乳動物施用式I化合物或其可接受的鹽，其中式I化合物如本發(fā)明第一方面中所述。

在另一優(yōu)選例中，所述式I化合物為黃酮二葡萄糖醛酸苷類化合物。

在另一優(yōu)選例中，所述的哺乳動物包括人。

在另一優(yōu)選例中，所述哺乳動物包括非人哺乳動物。

在另一優(yōu)選例中，所述哺乳動物包括嚙齒動物，如大鼠、小鼠。

在另一優(yōu)選例中，施用劑量為1-100mg/kg/天，較佳地，10-100mg/kg/天， 更佳地，50-100mg/kg/天。

在另一優(yōu)選例中，施用頻率為1-5次/天，較佳地1-2次/天。

在另一優(yōu)選例中，施用包括一個或多個周期，各周期為2-30天，較佳地3-7天。

在另一優(yōu)選例中，所述炎性疾病選自下組：神經(jīng)性炎癥、婦科炎癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、或其組合。

應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附圖說明

圖1顯示了實施例1制得的化合物1的ESI-MS譜譜。

圖2顯示了實施例1制得的化合物1的¹H-NMR譜。

圖3顯示了實施例1制得的化合物1的¹³C-NMR。

圖4顯示了實施例1制得的化合物2的ESI-MS譜。

圖5顯示了實施例1制得的化合物2的¹H-NMR譜。

圖6顯示了實施例1制得的化合物2的¹³C-NMR譜。

圖7顯示了實施例1制得的化合物3的ESI-MS譜。

圖8顯示了實施例1制得的化合物3的¹H-NMR譜。

圖9顯示了實施例1制得的化合物3的¹³C-NMR譜。

具體實施方式

本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次意外地發(fā)現(xiàn)，黃酮二葡萄糖醛酸苷類化合物能夠同時抑制環(huán)氧合酶COX-1和環(huán)氧合酶COX-2的活性，并且還具有顯著優(yōu)異的抗炎活性，因此，可以將其開發(fā)成抗炎藥。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。

如本文所用，所述“抗炎”、“抗炎性疾病”可互換使用。在本發(fā)明中，式I化合物可以治療抗炎性疾病，也可以預(yù)防抗炎性疾病。

如本文所用，所述“環(huán)氧合酶抑制劑”與“COX抑制劑”可以互為使用，均指對環(huán)氧合酶的活性有抑制作用的物質(zhì)(如化合物)。

活性成分

如本文所用，所述“活性成分”、“式I化合物”、“本發(fā)明的黃酮二葡萄糖醛酸苷類化合物”、“黃酮二葡萄糖醛酸苷類化合物”可以互為使用，具有式I結(jié)構(gòu)，

其中，R₁為H、甲氧基或羥基；R₂為羥基。

式I化合物可以是化學(xué)合成的，可以從植物(如蒺藜苜蓿)中提取。

本發(fā)明的活性成分包括式I化合物，還可以包括式I化合物的藥學(xué)上可接受的鹽或酯。

本發(fā)明的活性成分具有以下特點：(i)同時抑制環(huán)氧合酶COX-1和環(huán)氧合酶COX-2的活性；(ii)抗炎活性，可以制備COX抑制劑和抗炎藥物。

環(huán)氧合酶抑制劑

環(huán)氧合酶(cyclooxygenase,COX)又稱前列腺素(pros-taglandins,PG)內(nèi)過氧化合成酶，為一種膜結(jié)合蛋白，是機體催化花生四烯酸轉(zhuǎn)變?yōu)榍傲邢偎氐南匏倜浮－h(huán)氧合酶至少存在兩種異構(gòu)體，即COX-1和COX-2。

本發(fā)明的“環(huán)氧合酶抑制劑”為廣譜抑制劑，即能夠同時抑制COX－1和COX－2，對環(huán)氧合酶具有更好的抑制效果，且副作用小。

組合物及其應(yīng)用

本發(fā)明的黃酮二葡萄糖醛酸苷類化合物以及含有本發(fā)明化合物為主要活性成分的組合物可用作環(huán)氧合酶抑制劑，用于治療、預(yù)防以及緩解炎癥疾病(如神經(jīng)性炎癥、婦科炎癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等)。

本發(fā)明所述的組合物包括(但并不限于)：藥物組合物、食品組合物、保健組合物、膳食補充劑、飲料組合物等。

以藥物組合物為例。本發(fā)明的藥物組合物包含安全有效量范圍內(nèi)的黃酮二葡萄糖醛酸苷類化合物或其藥理上可接受的鹽及藥理上可以接受的賦形劑或載體。其中“安全有效量”指的是：化合物的量足以明顯改善病情，而不至于 產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用。通常，藥物組合物含有1-2000mg黃酮二葡萄糖醛酸苷類化合物/劑，更佳地，含有5-200mg黃酮二葡萄糖醛酸苷類化合物/劑，最佳地含有10-100mg黃酮二葡萄糖醛酸苷類化合物/劑。較佳地，所述的“一劑”為一個膠囊或藥片。

“藥學(xué)上可以接受的載體”指的是：一種或多種相容性固體或液體填料或凝膠物質(zhì)，它們適合于人使用，而且必須有足夠的純度和足夠低的毒性?！跋嗳菪浴痹诖酥傅氖墙M合物中各組份能和本發(fā)明的化合物以及它們之間相互摻和，而不明顯降低化合物的藥效。藥學(xué)上可以接受的載體部分例子有纖維素及其衍生物(如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素鈉、纖維素乙酸酯等)、明膠、滑石、固體潤滑劑(如硬脂酸、硬脂酸鎂)、硫酸鈣、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄欖油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化劑(如)、潤濕劑(如十二烷基硫酸鈉)、著色劑、調(diào)味劑、穩(wěn)定劑、抗氧化劑、防腐劑、無熱原水等。

本發(fā)明化合物或藥物組合物的施用方式?jīng)]有特別限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、直腸、腸胃外(靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下)、和局部給藥，優(yōu)選的給藥方式為口服給藥。

用于口服給藥的固體劑型包括膠囊劑、片劑、丸劑、散劑和顆粒劑。在這些固體劑型中，活性化合物與至少一種常規(guī)惰性賦形劑(或載體)混合，如檸檬酸鈉或磷酸二鈣，或與下述成分混合：(a)填料或增容劑，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合劑，例如，羥甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯膠；(c)保濕劑，例如，甘油；(d)崩解劑，例如，瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些復(fù)合硅酸鹽、和碳酸鈉；(e)緩溶劑，例如石蠟；(f)吸收加速劑，例如，季胺化合物；(g)潤濕劑，例如鯨蠟醇和單硬脂酸甘油酯；(h)吸附劑，例如，高嶺土；和(i)潤滑劑，例如，滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、十二烷基硫酸鈉，或其混合物。膠囊劑、片劑和丸劑中，劑型也可包含緩沖劑。

固體劑型如片劑、糖丸、膠囊劑、丸劑和顆粒劑可采用包衣和殼材制備，如腸衣和其它本領(lǐng)域公知的材料。它們可包含不透明劑，并且，這種組合物中活性化合物或化合物的釋放可以延遲的方式在消化道內(nèi)的某一部分中釋放?？? 采用的包埋組分的實例是聚合物質(zhì)和蠟類物質(zhì)。必要時，活性化合物也可與上述賦形劑中的一種或多種形成微膠囊形式。

用于口服給藥的液體劑型包括藥學(xué)上可接受的乳液、溶液、懸浮液、糖漿或酊劑。除了活性化合物外，液體劑型可包含本領(lǐng)域中常規(guī)采用的惰性稀釋劑，如水或其它溶劑，增溶劑和乳化劑，例知，乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特別是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油或這些物質(zhì)的混合物等。

除了這些惰性稀釋劑外，組合物也可包含助劑，如潤濕劑、乳化劑和懸浮劑、甜味劑、嬌味劑和香料。

除了活性化合物外，懸浮液可包含懸浮劑，例如，乙氧基化異十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脫水山梨醇酯、微晶纖維素、甲醇鋁和瓊脂或這些物質(zhì)的混合物等。

用于腸胃外注射的組合物可包含生理上可接受的無菌含水或無水溶液、分散液、懸浮液或乳液，和用于重新溶解成無菌的可注射溶液或分散液的無菌粉末。適宜的含水和非水載體、稀釋劑、溶劑或賦形劑包括水、乙醇、多元醇及其適宜的混合物。

用于局部給藥的本發(fā)明化合物的劑型包括軟膏劑、散劑、貼劑、噴射劑和吸入劑。活性成分在無菌條件下與生理上可接受的載體及任何防腐劑、緩沖劑，或必要時可能需要的推進(jìn)劑一起混合。

本發(fā)明化合物可以單獨給藥，或者與其他藥學(xué)上可接受的化合物(如吲哚美辛、阿司匹林等)聯(lián)合給藥。

使用藥物組合物時，是將安全有效量的本發(fā)明化合物適用于需要治療的哺乳動物(如人)，其中施用時劑量為藥學(xué)上認(rèn)為的有效給藥劑量，對于60kg體重的人而言，日給藥劑量通常為1～2000mg，優(yōu)選5～500mg，更優(yōu)選為10-100mg。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。

本發(fā)明的主要優(yōu)點包括：

(1)本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)黃酮二葡萄糖醛酸苷類化合物具有顯著的抗炎活性。

(2)本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)黃酮二葡萄糖醛酸苷類化合物能夠同時抑制環(huán)氧合酶 COX-1和環(huán)氧合酶COX-2的活性。

(3)黃酮二葡萄糖醛酸苷類化合物從植物提取出來，具有副作用小的特點。

(4)黃酮二葡萄醛酸苷類化合物從多種植物中均能提取得到，來源多樣化，獲取方便。

下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。以下實施例在統(tǒng)計學(xué)上例均以*P<0.05視為顯著差異。

儀器及試劑

核磁共振儀：Bruker DRX 400(德國)，TMS內(nèi)標(biāo)；FTIR-8201 PC型紅外分光光度計(日本島津)；WATERS ZQ2000質(zhì)譜儀(美國)；中低壓柱色譜儀(日本YMC公司)。

硅膠(200～300，300～400目)，薄層色譜分析預(yù)制板和制備預(yù)制板均為青島海洋化工廠生產(chǎn)；C18填料(日本YMC公司)。所用試劑均為分析純(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)。

實施例1 金圣草黃素-7-O-[β-D-葡萄糖醛酸-(1→2)]-β-D葡萄糖醛酸苷，芹菜素-7-O-[β-D-葡萄糖醛酸-(1→2)]-β-D-萄糖醛酸苷和木犀草素-7-O-[β-D-葡萄糖醛酸-(1→2)]-β-D-萄糖醛酸苷的制備

實驗方法一：

(1)提取：取藥材蒺藜苜蓿，粉碎(過24目篩)，加80％甲醇水溶液回流提取，醇用量為藥材量的10(v/m)倍，提取3次，每次1小時，將提取液過濾后合并，干燥，得蒺藜苜蓿干浸膏。浸膏混懸于4倍量水中，上清液上AB-8大孔吸附樹脂，靜態(tài)吸附2小時，用3倍樹脂體積的水除雜，后用20％乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮即得總黃酮葡萄糖醛酸苷部位。

(2)柱層析：將得到的總黃酮葡萄糖醛酸苷部位，進(jìn)行ODS C18常壓柱層析(10倍體積于樣品質(zhì)量的ODS，即30ml ODS C-18/1g樣品，100cm*20cm 的玻璃柱)，分別用甲醇水溶液(10％→15％→20％→25％→30％)梯度洗脫，每個梯度所用混合溶劑量為3倍柱體積，按每個柱體積依次收集，共得到8個組份。

(3)HPLC制備：將上述各組分進(jìn)一步精制并用HPLC分離，對得到的組分進(jìn)行鑒定，其中一個組分對應(yīng)的化合物為化合物2：芹菜素-7-O-[β-D-葡萄糖醛酸-(1→2)]-β-D葡萄糖醛酸苷(t_R＝18.3min)。

實驗方法二：

1)提取：取藥材紫珠，粉碎(過24目篩)，加60％乙醇回流提取，醇用量為藥材量的12(v/m)倍，提取3次，每次2小時，將提取液過濾后合并，干燥，得紫珠干浸膏。浸膏混懸于4倍量水中，上清液上AB-8大孔吸附樹脂，靜態(tài)吸附2小時，用3倍樹脂體積的水除雜，后用20％乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮即得總黃酮葡萄糖醛酸苷部位。

2)柱層析：將得到的總黃酮葡萄糖醛酸苷部位，進(jìn)行ODS C18常壓柱層析(10倍體積于樣品質(zhì)量的ODS，即30ml ODS C-18/1g樣品，100cm*20cm的玻璃柱)，分別用甲醇水溶液(5％→10％→15％→20％→25％)梯度洗脫，每個梯度所用混合溶劑量為3倍柱體積，按每個柱體積依次收集，共得到15個組份。收集15％甲醇洗脫第二個柱體積，即組份8，減壓濃縮得洗脫部位I；收集20％甲醇洗脫第一個柱體積，即組份10，減壓濃縮得到洗脫部位II；收集25％甲醇洗脫第一個柱體積，即組份13，減壓濃縮得到洗脫部位III。

3)HPLC制備：將上述部位I用HPLC制備(14％甲醇水溶液，檢測波長210nm，流速4ml/min),得到化合物3：木犀草素-7-O-[β-D-葡萄糖醛酸-(1→2)]-β-D葡萄糖醛酸苷(t_R＝20.5min)；將上述部位II經(jīng)HPLC制備(17％甲醇水溶液，檢測波長210nm，流速4ml/min)，得到化合物2：芹菜素-7-O-[β-D-葡萄糖醛酸-(1→2)]-β-D葡萄糖醛酸苷(t_R＝18.3min)；將上述部位III用HPLC制備(23％甲醇水溶液，檢測波長210nm，流速4ml/min)，得到化合物1：金圣草黃素-7-O-[β-D-葡萄糖醛酸-(1→2)]-β-D葡萄糖醛酸苷(t_R＝16.8min)。

鑒定結(jié)果

化合物1 (金圣草黃素-7-O-[β-D-葡萄糖醛酸-(1→2)]-β-D葡萄糖醛酸苷)，淺黃色無定形粉末，微溶于水，不溶于甲醇，可溶于DMSO。ESI-MS m/z651[M-H]^-1，確定化合物分子量為652(見圖1)。¹H-NMR(DMSO-d₆，400MHz)δ：12.87(1H，s，5-OH)，7.56(1H，dd，J＝8.4，2.0Hz，H-6′)，7.49(1H，d，J＝2.0Hz，H-2′)，7.11(1H，d，J＝8.4Hz，H-5′)，6.69(1H，d，J＝1.6 Hz，H-8)，6.69(1H，s，H-3)，6.43(1H，d，J＝1.6Hz，H-6)，5.39(1H，d，J＝6.4Hz，H-1″)，4.56(1H，d，J＝8.0Hz，H-1″′)，4.02(1H，d，J＝9.6Hz，H-5″)，3.88(3H，s，OCH₃-3′)，3.65(1H，d，J＝9.2Hz，H-5″′)，3.58(1H，t，J＝8.8Hz，H-3″)，3.55(1H，t，J＝4.8Hz，H-2″)，3.47(1H，t，J＝8.8Hz，H-4″)，3.29(1H，t，J＝8.8Hz，H-4″′)，3.27(1H，t，J＝9.2Hz，H-3″′)，3.05(1H，t，J＝8.0Hz，H-2″′)，以上數(shù)據(jù)見圖2。¹³C-NMR數(shù)據(jù)見表1，圖3。

化合物2 (芹菜素-7-O-[β-D-葡萄糖醛酸-(1→2)]-β-D葡萄糖醛酸苷)，淺黃色無定形粉末，微溶于水，不溶于甲醇，可溶于DMSO。ESI-MS m/z 621[M-H]^-1，確定化合物分子量為622(見圖4)。¹H-NMR(DMSO-d₆，400MHz)δ：12.98(1H，s，5-OH)，7.94(1H，dd，J＝6.8，1.8Hz，H-2′)7.92(1H，dd，J＝6.8，1.8Hz，H-6′)，6.96(1H，dd，J＝6.8，2.0Hz，H-3′)，6.94(1H，dd，J＝6.8，2.0Hz，H-5′)，6.81(1H，d，J＝2.0Hz，H-8)，6.79(1H，s，H-3)，6.44(1H，d，J＝2.0Hz，H-6)，5.31(1H，d，J＝5.6Hz，H-1″)，4.56(1H，d，J＝7.6Hz，H-1″′)，3.93(1H，d，J＝8.4Hz，H-5″)，3.71(1H，d，J＝8.4Hz，H-5″′)，3.65(1H，t，J＝8.4Hz，H-3″)，3.56(1H，t，J＝6.8Hz，H-2″)，3.42(1H，t，J＝8.8Hz，H-4″)，3.28(1H，t，J＝8.4Hz，H-4″′)，3.24(1H，t，J＝8.4Hz，H-3″′)，3.05(1H，t，J＝7.6Hz，H-2″′)，以上數(shù)據(jù)見圖5。¹³C-NMR數(shù)據(jù)見表1，圖6(來自蒺藜苜蓿和來自紫珠的化合物2是同一化合物)。

化合物3 (木犀草素-7-O-[β-D-葡萄糖醛酸-(1→2)]-β-D葡萄糖醛酸苷)，淡黃色無定型粉末，微溶于水，不溶于甲醇，可溶于DMSO。ESI-MS m/z637[M-H]^-1，確定化合物分子量為638，見圖7。¹H-NMR(DMSO-d₆，400MHz)δ:12.96(1H，s，5-OH)，7.44(1H，dd，J＝8.4，2.0Hz，H-6′)，7.42(1H，dd，J＝8.4，2.0Hz，H-2′)，6.91(1H，d，J＝8.8Hz，H-5′)，6.74(1H，d，J＝2.0Hz，H-8)，6.71(1H，s，H-3)，6.42(1H，d，J＝1.6Hz，H-6)，5.41(1H，d，J＝6.8Hz，H-1″)，4.56(1H，d，J＝7.6Hz，H1″′)，4.06(1H，d，J＝9.2Hz，H-5″)，3.65(1H，d，J＝9.2Hz，H-5″′)，3.58(1H，t，J＝6.4Hz，H-3″)，3.56(1H，t，J＝6.4Hz，H-2″)，3.49(1H，t，J＝8.0Hz，H-4″)，3.29(1H，t，J＝8.8Hz，H-4″′)，3.27(1H，t，J＝9.2Hz，H-3″′)，3.05(1H，t，J＝8.0Hz，H-2″′)，見圖8。¹³C-NMR數(shù)據(jù)見表1，圖9。

表1.化合物1-3的¹³C-NMR數(shù)據(jù)表

實施例2 本發(fā)明黃酮二葡萄糖醛酸苷類化合物的COX抑制活性

1.儀器

酶標(biāo)儀Labsystems,wellscan，MK.2

離心機KA-1000上海飛鴿

雙人超凈工作臺，蘇州凈化

CO₂培養(yǎng)箱，PHARMA SCIENTIFIC

可調(diào)式移液器(芬蘭，5-40ul，40-200ul，200-1000ul)

2.材料

Cox Fluorescent Inhibitor Screening Assay Kit(Cayman,USA)；

96孔黑板(Corning，USA)；

進(jìn)口槍頭(Axygen，USA)；

吲哚美辛批號：080401Sigma公司；

SC－560：

NS－398：

對比化合物1：

3.方法

1)在200μl的反應(yīng)體系中依次混合緩沖液(1X)、亞鐵血紅素、熒光底 物ADHP、COX-1/COX-2、待測化合物，25℃溫孵5分鐘。

2)加入環(huán)氧酶底物花生四烯酸。

3)小心振搖板幾秒鐘，25℃溫孵2min

4)Ex:530-540nM；Em:585-590nM檢測。

4.待測樣品與陽性藥處理方法

待測樣品和吲哚美辛精確稱樣，實驗前使用檢測緩沖液稀釋到工作濃度。

COX-1選擇性抑制劑SC-560(CAS 188817-13-2)，按照說明書要求吸取15μl加入985μl DMSO稀釋成工作液；COX-2選擇性抑制劑DuP-697(CAS88149-94-4))，按照說明書要求吸取50μl加入550μl DMSO稀釋成工作液。

5.計算

6.實驗結(jié)果

6.1初篩

表2.抑制率初篩表

6.2IC₅₀值測定

表3、化合物1-3環(huán)氧合酶IC₅₀表

結(jié)果如表2和表3所示。結(jié)果表明，本發(fā)明的黃酮二葡萄糖醛酸苷化合物(I)有較強的COX-1和COX-2抑制活性，顯著高于對比化合物1的抑制活性。并且，化合物3對COX-1和COX-2的IC₅₀均達(dá)到nM級，其中對COX-2的IC₅₀強于COX-2選擇性抑制劑NS-398，對COX-1的IC₅₀與吲哚美辛處于同一數(shù)量級。因此，本發(fā)明的黃酮二葡萄糖醛酸苷(I)可為宮頸炎、陰道炎等炎癥疾病的預(yù)防或治療提供一種新途徑，同時可以開發(fā)為新的環(huán)氧合酶抑制劑。

實施例3 本發(fā)明黃酮二葡萄糖醛酸苷類化合物對對角叉菜膠引起的大鼠急性炎癥的藥效學(xué)作用

1實驗動物

1.1名稱：SD大鼠

1.2來源：上海西普爾-必凱實驗動物有限公司

1.3體重：130—150g

1.4性別：雄性

1.5合格證：SCXK(滬)2008-0016

2.實驗劑量設(shè)計

設(shè)計低、高兩個藥效劑量組，劑量分別為：5mg/kg、25mg/kg。

3藥物配制

低劑量組將5mg藥品溶至10ml，高劑量組將25mg藥品溶至10ml。

4給藥途徑及容量

4.1途徑：口服

4.2容量：100g大鼠：1ml

4陽性藥：

4.1名稱:吲哚美辛

4.2提供單位：上海信誼黃河制藥有限公司

4.3批號：091201

4.4劑量：5mg/kg

5實驗制劑與儀器

5.1致炎劑：角叉菜膠，sigma產(chǎn)品，批號：1408463。

0.1g用雙蒸水配至10ml成1％的角叉菜膠。每只大鼠右后足足趾中部皮下注射0.1ml致炎。

5.2測量儀：意大利UGO公司肢體體積測量儀7140–Plethysmometer

生產(chǎn)單位：Biological Research Apparatus 21025 Comerio VA Italy

6實驗方法

6.1分組與給藥

將大鼠隨機分為正常組、模型組及樣品的高低劑量組，并在實驗當(dāng)天按分組給予各劑量藥物。

6.2造模

給藥后1小時各組大鼠于右后肢足跖部皮下注射1％的角叉菜膠0.1ml致炎，造成大鼠急性炎癥模型。

6.3指標(biāo)測量

在致炎前及致炎后不同時間(0，1、2、3h)分別測定致炎足的足墊體積，在足正面做一清晰標(biāo)線，用足趾容積測量儀進(jìn)行測量記錄。以腫脹值計算腫脹率，再以模型組及給藥組的大鼠腳趾腫脹率計算抑制率。

腫脹率％＝(En-Eo)/Eo*100％

En：致炎后不同時間的腫脹值Eo：致炎前的腫脹值

抑制率％＝(Zn-Zo)/Zo*100％

Zn：各給藥組的腫脹率Zo：模型組的腫脹率

7實驗結(jié)果

實驗數(shù)據(jù)見表4。致炎后，模型組的腫脹率明顯升高，說明造模成功，在致炎后的2h達(dá)到頂峰。與模型組相比，陽性藥吲哚美辛各時間點的腫脹率均有所降低，致炎后1h、2h、3h的抑制率分別為25.79％、45.50％、45.71％(P<0.05、P<0.01、P<0.01),顯示出較好的治療效果。

與模型組相比，化合物3低劑量組在2h抑制率為26.31％(P<0.05)；高劑量組在1h、2h的抑制率分別為33.25％(P<0.01)和43.25％(P<0.01)；化合物1高劑量組在1h抑制率為37.77％(P<0.01)；化合物2高劑量組在2h抑制率為37.40％(P<0.01)；而對比化合物1的低劑量組(相當(dāng)于化合物1/2/3的高劑量組)在2h抑制率只有16.78％(P＜0.01)，顯著低于化合物1/2/3的抑制水平。

結(jié)果表明，化合物1-3的高劑量組均顯示出抗炎效果，以化合物3高劑量組效果最為顯著?；衔?-3可以顯著降低角叉菜膠致急性炎癥的大鼠的足趾腫脹率，具有一定的預(yù)防大鼠急性炎癥的藥效學(xué)作用，因此，具有較好的抗炎 藥物的開發(fā)潛力。

表4 化合物1-3對角叉菜膠致大鼠急性炎癥的藥效學(xué)作用

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