本發(fā)明屬于臨床生物技術領域，特別涉及一種在單堿基延伸技術平臺上檢測大片段缺失基因的方法及應用。

背景技術：

基因大片段測序目前主要采用sanger測序法進行檢測，該方法存在敏感性低的劣勢。

massarray單堿基延伸技術質(zhì)譜平臺是個敏感度較高的基因分析平臺，檢測靈敏度可達0.5％，并且可實現(xiàn)多基因多位點同步檢測。常規(guī)的單堿基延伸設計方法僅僅限于單堿基突變或小片段插入或刪除(小于50個堿基)。

如果能在massarray單堿基延伸技術質(zhì)譜平臺快速、準確檢測大片段缺失基因，將能有效提高massarray單堿基延伸技術質(zhì)譜平臺的利用效率。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術的缺點與不足，提供一種在單堿基延伸技術平臺上檢測大片段缺失基因的方法。

本發(fā)明的另一目的在于提供所述在單堿基延伸技術平臺上檢測大片段缺失基因的方法的應用。

本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn)：一種在單堿基延伸技術平臺上檢測大片段缺失基因的方法，包括如下步驟：

(1)軟件設計引物文檔：對已知會產(chǎn)生大片段缺失的基因的序列進行分析，將每個檢測堿基側(cè)翼序列拷貝到引物設計固定格式文本中設計引物序列；其中，野生型引物序列和突變型引物序列分別置于兩孔進行設計，同時，野生型引物序列的設計以大片段缺失的第一個堿基做為檢測堿基，突變型引物序列的設計以大片段刪除后的第一個堿基做為檢測堿基，同時野生/大片段刪除突變型都在檢測的堿基處設計其他三個堿基做為對照；對照堿基的設置也有助于發(fā)現(xiàn)新的變異方式；

(2)多重引物設計：通過massarray網(wǎng)站ads(assaydesignsuite)引物設計軟件，運行第1步設計序列的文檔，調(diào)整相關參數(shù)，設計基因大片段缺失引物，設計參數(shù)選擇如下：在高級設置中改identifyoptimalprimerareas(確定最佳的引物區(qū)域)中ampliconlengthminimum(最小擴增長度)為60，ampliconlengthmaximum(最大擴增長度)為400，并選擇designablesequencesretained(設計保留序列)為0and1×mapped(匹配)；設置designassays(設計分析)中ampliconlength(擴增長度)為60-400，并設置minimummultiplexlevel(最小多重水平)為1；最后點擊運行，從ads軟件導出設計好的擴增引物序列、延伸引物序列以及延伸引物分子量等相關參數(shù)與文件；其中，擴增引物序列包括野生型引物對和突變型引物對，延伸引物序列包括野生型延伸引物和突變型延伸引物。

所述的方法還包括如下步驟：

(3)芯片點樣樣品的制備：依據(jù)步驟(2)設計得到的擴增引物序列和延伸引物序列，獲取得到相應的擴增引物和延伸引物；使用野生型引物對進行pcr，得到pcr產(chǎn)物①，進行堿性磷酸酶消化后加入野生型延伸引物進行延伸，將延伸產(chǎn)物脫鹽，得到芯片點樣樣品①；使用突變型引物對進行pcr，得到pcr產(chǎn)物②，進行堿性磷酸酶消化后加入突變型延伸引物進行延伸，將延伸產(chǎn)物脫鹽，得到芯片點樣樣品②；

(4)點樣掃描：使用massarray系統(tǒng)nanodispenser點樣儀將步驟(3)制備的芯片點樣樣品①和芯片點樣樣品②分別進行芯片點樣，利用analyzer分析儀芯片掃描；掃描結(jié)果以typer4.0軟件分析各目的基因的突變狀況，在質(zhì)譜峰變異堿基處出現(xiàn)峰，則判斷為突變；在野生型設計質(zhì)譜圖譜有堿基峰，在突變型設計質(zhì)譜圖譜也有堿基峰，則判斷為突變；若僅在野生型設計質(zhì)譜圖譜有堿基峰，則判斷無突變。

步驟(1)中所述的大片段指的是超過50bp的片段；更優(yōu)選為超過1000bp的片段；最優(yōu)選為1000～5000bp的片段。

步驟(1)中所述的已知會產(chǎn)生大片段缺失的基因優(yōu)選為bim基因。2012年natmed雜志報道bim(bcl2-like11)基因刪除多態(tài)性與肺癌egfrtki靶向治療原發(fā)耐藥相關，導致治療療效差；bim基因刪除多態(tài)性為2903個堿基刪除變異。

所述的側(cè)翼序列的長度優(yōu)選為200～400個堿基。

當所述的已知會產(chǎn)生大片段缺失的基因為bim基因時，所述的野生型的側(cè)翼序列如seqidno.1所示，所述的突變型的側(cè)翼序列如seqidno.2所示。

步驟(3)中所述的獲取是通過化學合成方法制備得到擴增引物和延伸引物。

步驟(3)中所述的pcr的體系優(yōu)選如下：10×pcr緩沖液0.5μl、濃度為25mm的mgcl2溶液0.4μl、濃度為25mm的dntps溶液0.1μl、濃度為5u/μl的pcr酶0.2μl、濃度為0.5μm的引物對混合液1μl、濃度為10ng/μl的待檢測基因組dna2μl，水補足至5μl。

步驟(3)中所述的pcr的條件優(yōu)選如下：94℃2分鐘；94℃30秒、56℃30秒、72℃1分鐘，45個循環(huán)；72℃5分鐘。

步驟(3)中所述的堿性磷酸酶消化的體系優(yōu)選如下：在5μlpcr產(chǎn)物中加入核酸外切酶sap0.3μl、sap緩沖液0.17μl、水補足至7μl。

步驟(3)中所述的堿性磷酸酶消化的條件優(yōu)選如下：37℃40分鐘，85℃5分鐘。

步驟(3)中所述的延伸的體系優(yōu)選如下：在7μl堿性磷酸酶消化后的產(chǎn)物中加入10×typeplex緩沖液0.2μl、10×typeplex終止混合液0.2μl、濃度為33u/μl的typeplex熱測序酶0.041μl、延伸引物混合液適量、h2o補足至9μl；其中，延生引物的加入量依據(jù)延伸引物分子量計算；延伸引物分子量在步驟(2)導出文件中顯示，依據(jù)massarray平臺延伸引物配置表中填入延伸引物的分子量，得到延伸引物的最優(yōu)濃度。

步驟(3)中所述的延伸的條件優(yōu)選如下：94℃30秒；94℃5秒、52℃5秒、80℃5秒、52℃5秒、80℃5秒、52℃5秒、80℃5秒、52℃5秒、80℃5秒、52℃5秒、80℃5秒，35個循環(huán)；72℃3分鐘，進行延伸反應。

步驟(3)中所述的脫鹽的具體步驟優(yōu)選如下：

(a)對于96孔板的操作：在9μl延伸產(chǎn)物中加入水41μl和清潔樹脂(cleanresin)15mg，旋轉(zhuǎn)板30～60分鐘進行脫鹽去離子防干擾處理；3200g離心5分鐘；

(b)對于384孔板的操作：在9μl延伸產(chǎn)物中加入水16μl和清潔樹脂6mg，旋轉(zhuǎn)板30～60分鐘進行脫鹽去離子防干擾處理；3200g離心5分鐘。

上述方法在大片段缺失基因檢測或是制備用于檢測大片段缺失基因的試劑盒中的應用。

一種用于檢測大片段缺失基因的試劑盒，是通過上述方法設計得到，包括通過單堿基延伸技術平臺設計得到的擴增引物和延伸引物；其中，擴增引物為野生型擴增引物和突變型擴增引物，延伸引物為野生型延伸引物和突變型延伸引物；野生型擴增引物以大片段缺失的第一個堿基做為檢測堿基，突變型引物序列的設計以大片段刪除后的第一個堿基做為檢測堿基。

一種用于檢測bim突變的試劑盒，是通過上述方法設計得到，包括通過單堿基延伸技術平臺設計得到的擴增引物和延伸引物；擴增引物如下：

bim_2903bpdel_f：5’-acgttggatgtaccatccagctctgtcttc-3’；

bim_2903bpdel_r：5’-acgttggatgaaatggcacagcctctatgg-3’；

bim_wt_f：5’-acgttggatgtaccatccagctctgtcttc-3’；

bim_wt_r：5’-acgttggatgtgaccaccactctgaggttc-3’；

延伸引物如下：

bim_2903bpdel_e：5’-cacagcctctatggagaaca-3’；

bim_wt_e：5’-ggcttcagtgaggtaaatca-3’。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術具有如下的優(yōu)點及效果：

(1)本發(fā)明提供了一種在massarray單堿基延伸技術平臺上檢測大片段缺失基因的方法，拓寬了massarray單堿基延伸技術平臺的使用范圍。

(2)在多重分析基因變異時，在單堿基延伸平臺可同步檢測大片段缺失基因，與其他單獨檢測大片段缺失基因具有明顯優(yōu)勢。

附圖說明

圖1為本發(fā)明方法檢測20455肺癌組織樣本得到的bim_del的結(jié)果圖；其中，a為bim基因野生型g，分子量為6468.20；b為bim基因突變型c，分子量為6382.20。

圖2為檢測20455肺癌組織樣本bim基因的一代(sanger)測序圖。

圖3是bim基因引物設計中不合適的參數(shù)造成設計被拒的界面截取圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

實施例1

(1)軟件設計引物文檔：首先依據(jù)基因的mrna序列號、cosmic數(shù)據(jù)庫號確定大片段刪除在基因組gdna序列中的變異位置。根據(jù)massarray平臺公司突變標示方式，將每個變異位點側(cè)翼約200個堿基拷貝到引物設計固定格式文本中設計引物。因為刪除片段較大，按常規(guī)設計在同一序列難以同步完成設計，本發(fā)明將采取把基因野生型和大片段刪除突變型放在2個不同序列分別設計的方法。即野生型序列的設計以大片段刪除的第一個堿基做為檢測堿基，檢測堿基后側(cè)翼約200堿基的序列為大片段刪除序列；大片段刪除突變型序列的設計以大片段刪除后的第一個堿基做為檢測堿基，檢測堿基后側(cè)翼約200堿基的序列為大片段刪除后的序列。同時野生/大片段刪除突變型都在檢測的堿基處設計其他三個堿基做為對照，對照堿基的設置也有助于發(fā)現(xiàn)新的變異方式。

以bim基因大片段刪除的引物設計為例:

首先確定bim基因的mrna序列號為nm_138621.4、cosmic數(shù)據(jù)庫號為enst_00000393256、gdna序列號為ng_029006.1，然后在gdna序列中標記bim基因2903個堿基的刪除片段。根據(jù)massarray平臺公司突變標示方式，將每個變異位點側(cè)翼約200個堿基拷貝到引物設計固定格式文本中設計引物。其中bim基因變異檢測設計，因為刪除片段較大(2903個堿基)，在同一序列難以同步完成檢測，本發(fā)明將采取bim基因野生型和突變型放在2孔分別設計的方法。同時野生/突變型都同時檢測其他三個堿基做為對照，即野生型的延伸堿基為g，同時檢測a/c/t堿基檢測做為對照；突變型的延伸堿基為c，則同時檢測a/g/t堿基檢測做為對照。對照堿基的設置同時有助于發(fā)現(xiàn)新的變異方式。bim_2903del的序列設計分別如下：

bim基因野生型檢測設計序列：

ttataatttagattgtacctcatgatgaaggctaactcaacaaacccatcagaacagacactggaacaaaatgacatttctaaataccatccagctctgtcttcataggcttcagtgaggtaaatca[g/a/c/t]gcaggcctttgcccatgttatagaattggaaagaacctcagagtggtggtcacttgtcagaggttgggcacacctgtgaggtggtggggagaaatgacagacatcccagcagctacacatgctggctgcacgtctcttgccaaatgccaggaggtaattttttagggtccctccttagggaaaggggctggaagt；為g時表示野生型，a/c/t堿基為配合設計設置；

bim基因2903個堿基大片段刪除檢測設計序列：

ttataatttagattgtacctcatgatgaaggctaactcaacaaacccatcagaacagacactggaacaaaatgacatttctaaataccatccagctctgtcttcataggcttcagtgaggtaaatca[c/a/g/t]tgttctccatagaggctgtgccattttacattcccaccaacagggcacaagggttccagtttctccacatacttaccaacacttttttttttttttttttaacagtagtcatcctagaggatataggtgatctttcactgtgctttggatttatatttactggcttagattt；為c時表示突變型，a/g/t堿基為配合設計設置。

(2)多重引物設計：通過massarray網(wǎng)站ads(assaydesignsuite)引物設計軟件，運行第1步設計序列的文檔，調(diào)整相關參數(shù)，關于bim基因大片段刪除設計參數(shù)選擇如下：在高級設置中改identifyoptimalprimerareas(確定最佳的引物區(qū)域)中ampliconlengthminimum(最小擴增長度)為60，ampliconlengthmaximum(最大擴增長度)為400，并選擇designablesequencesretained(設計保留序列)為0and1×mapped(匹配)；設置designassays(設計分析)中ampliconlength(擴增長度)為60-400，并設置minimummultiplexlevel(最小多重水平)為1。最后點擊運行。得到如下擴增引物序列和延伸引物序列：

bim_2903bpdel_f：5’-acgttggatgtaccatccagctctgtcttc-3’；

bim_2903bpdel_r：5’-acgttggatgaaatggcacagcctctatgg-3’；

bim_wt_f：5’-acgttggatgtaccatccagctctgtcttc-3’；

bim_wt_r：5’-acgttggatgtgaccaccactctgaggttc-3’；

延伸引物如下：

bim_2903bpdel_e：5’-cacagcctctatggagaaca-3’；

bim_wt_e：5’-ggcttcagtgaggtaaatca-3’。

3、引物的配置如下：pcr引物先稀釋成10μm，然后工作液以每條引物濃度為0.5μm進行混合，得到擴增引物混合液(每管包括正、反向引物)，野生型和突變型各1管；延伸引物先稀釋成500μm，然后根據(jù)ads軟件設計導出延伸引物的分子量數(shù)據(jù)，bim基因野生型延伸引物的分子量(uep_mass)為5851.8，大片段刪除突變型延伸引物的分子量為5203.4。根據(jù)massarray平臺延伸引物配置表，分別填入延伸引物的分子量，得到bim基因野生型的濃度為8.18μm，大片段刪除突變型的濃度為7.06μm。按計算出來的濃度分別稀釋野生型和突變型引物得到延伸引物液，野生型和突變型各1管。

實施例2使用實施例1的設計bim引物檢測肺癌組織樣本

1、選用10例肺癌組織樣本進行bim基因設計引物的可行性分析，同時設立正常人基因組dna(gdna)(promega公司人類基因組gdna：male做為陰性對照，水(h2o)做為空白對照。每個樣本檢測需要dna20ng，即10ng/孔×2孔。本檢測的操作如下：

(1)pcr的體系為：10×pcr緩沖液0.5μl、mgcl2(25mm)0.4μl、dntps(25mm)0.1μl、pcr酶(5u/μl)0.2μl、擴增引物混合液1μl、肺癌組織樣本基因組(10ng/μl)2μl，水補足至5μl。94℃2分鐘；94℃30秒、56℃30秒、72℃1分鐘，45個循環(huán)；72℃5分鐘；

(2)在步驟(1)得到的pcr產(chǎn)物中加入核酸外切酶sap0.3μl、sap緩沖液0.17μl、水補足至7μl。37℃40分鐘，85℃5分鐘，將步驟(1)獲得的pcr產(chǎn)物進行堿性磷酸酶消化；

(3)2管擴增引物分別對應2管延伸引物，p1對應e1，p2對應e2；在步驟(2)得到的產(chǎn)物中加入typeplex緩沖液(10×)0.2μl、typeplex終止混合液(10×)0.2μl、typeplex熱測序酶(33u/μl)0.041μl、延伸引物混合液0.804μl、h2o補足至9μl。94℃30秒；94℃5秒、52℃5秒、80℃5秒、52℃5秒、80℃5秒、52℃5秒、80℃5秒、52℃5秒、80℃5秒、52℃5秒、80℃5秒，35個循環(huán)；72℃3分鐘，進行延伸反應；

(4)將步驟(3)獲得產(chǎn)物中加入水41μl，清潔樹脂(cleanresin)15mg(96孔板)或者加入水16μl，清潔樹脂6mg(384孔板)，旋轉(zhuǎn)板30-60分鐘進行脫鹽去離子防干擾處理；3200g離心5分鐘；

(5)massarray系統(tǒng)nanodispenser點樣儀將上清液進行芯片點樣，利用analyzer分析儀芯片掃描；掃描結(jié)果以typer4.0軟件分析各目的基因的突變狀況，在質(zhì)譜峰變異堿基處出現(xiàn)峰，則判斷為突變。其中，對于bim基因大片段刪除，若在野生型設計質(zhì)譜圖譜有g堿基峰，在突變型設計質(zhì)譜圖譜有c堿基峰，則判斷為突變；若僅在野生型設計質(zhì)譜圖譜有g堿基峰，則判斷無突變。

使用本發(fā)明bim基因的引物在1例肺癌組織樣本(樣本號20455號)中檢測到bim基因的突變(野生型g堿基分子量為6468.2；刪除突變分子量為6382.2，見圖1)。bim基因是egfr靶向治療的原發(fā)耐藥基因，若檢測到該基因2903堿基刪除，可為臨床患者egfr靶向治療耐藥機制提供更準確的個體化信息，同時為醫(yī)生提供更準確的臨床治療抉擇。

進一步對本發(fā)明檢測bim基因陽性的20455號肺癌組織樣本進行一代(sanger)測序驗證，設置對照，測序分析引物序列如下：正向引物(f):cctcatgatgaaggctaactcaa；反向引物(r-野生型):tggtggtcacttgtcagaggtt；反向引物(r-突變型):tgttctccatagaggctgtgcc。一代測序結(jié)果blast分析顯示此樣本存在bim基因野生型與突變型兩種基因序列。圖2為檢測此樣本bim基因的sanger測序圖。該結(jié)果表明本試劑盒對bim基因檢測具有可靠性。

對比例1：

按照單堿基延伸技術的常規(guī)設計，一般序列設計長度為200bp左右，在單孔同時完成野生型和突變型檢測，野生型和突變型位點后面的序列相同。

比如序列egfr_l858r(c.2573t>g)點突變的普通設計如下：

egfr_l858r位點野生型與變異型檢測設計序列：

gacgtggagaggctcagagcctggcatgaacatgaccctgaattcggatgcagagcttcttcccatgatgatctgtccctcacagcagggtcttctctgtttcagggcatgaactacttggaggaccgtcgcttggtgcaccgcgacctggcagccaggaacgtactggtgaaaacaccgcagcatgtcaagatcacagattttgggc[t/g]ggccaaactgctgggtgcggaagagaaagaataccatgcagaaggaggcaaagtaaggaggtggctttaggtcagccagcattttcctgacaccagggaccaggctgccttcccactagctgtattgtttaacacatg；為t時表示野生型，為g時表示突變型。

而bim基因刪除了2903個檢測，已經(jīng)遠遠超過了序列對長度的要求，按照常規(guī)的單孔同時設計野生型與突變型的理念已經(jīng)無法實現(xiàn)目的。因此，本發(fā)明將bim基因的設計分開2孔進行設計，野生型和突變型分開在不同的孔，野生型和突變型位點后面的序列不同；同時野生/突變型都同時檢測其他三個堿基做為對照，野生型的延伸堿基為g，同時檢測a/c/t堿基檢測做為對照；突變型的延伸堿基為c，則同時檢測a/g/t堿基檢測做為對照。對照堿基的設置同時有助于發(fā)現(xiàn)新的變異方式。

bim基因野生型檢測設計序列：

ttataatttagattgtacctcatgatgaaggctaactcaacaaacccatcagaacagacactggaacaaaatgacatttctaaataccatccagctctgtcttcataggcttcagtgaggtaaatca[g/a/c/t]gcaggcctttgcccatgttatagaattggaaagaacctcagagtggtggtcacttgtcagaggttgggcacacctgtgaggtggtggggagaaatgacagacatcccagcagctacacatgctggctgcacgtctcttgccaaatgccaggaggtaattttttagggtccctccttagggaaaggggctggaagt；為g時表示野生型，a/c/t堿基為配合設計設置；

bim基因2903個堿基大片段刪除檢測設計序列：

ttataatttagattgtacctcatgatgaaggctaactcaacaaacccatcagaacagacactggaacaaaatgacatttctaaataccatccagctctgtcttcataggcttcagtgaggtaaatca[c/a/g/t]tgttctccatagaggctgtgccattttacattcccaccaacagggcacaagggttccagtttctccacatacttaccaacacttttttttttttttttttaacagtagtcatcctagaggatataggtgatctttcactgtgctttggatttatatttactggcttagattt；為c時表示突變型，a/g/t堿基為配合設計設置。

對比例2：

多重引物設計方法與實施例1所述的bim基因大片段刪除引物設計方法一致，區(qū)別僅在于：關于bim基因大片段刪除設計參數(shù)選擇如下：在高級設置中選擇默認設置designablesequencesretained(設計保留序列)為uniquelymapped(唯一匹配)，則在運行第3步bim基因大片段序列會拒絕設計(如圖3)。而野生型可以通過設計獲得引物。

該對比例說明，在大片段設計時，需要根據(jù)序列的特點，選擇正確的設置參數(shù)，才能設計出合適的引物序列。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學科學院）

<120>在單堿基延伸技術平臺上檢測大片段缺失基因的方法及應用

<130>1

<160>9

<170>patentinversion3.5

<210>1

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<223>bim基因野生型檢測設計序列

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<223>n=g、a、cort

<400>1

ttataatttagattgtacctcatgatgaaggctaactcaacaaacccatcagaacagaca60

ctggaacaaaatgacatttctaaataccatccagctctgtcttcataggcttcagtgagg120

taaatcangcaggcctttgcccatgttatagaattggaaagaacctcagagtggtggtca180

cttgtcagaggttgggcacacctgtgaggtggtggggagaaatgacagacatcccagcag240

ctacacatgctggctgcacgtctcttgccaaatgccaggaggtaattttttagggtccct300

ccttagggaaaggggctggaagt323

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<223>bim基因2903個堿基大片段刪除檢測設計序列

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<223>n=c、a、gort

<400>2

ttataatttagattgtacctcatgatgaaggctaactcaacaaacccatcagaacagaca60

ctggaacaaaatgacatttctaaataccatccagctctgtcttcataggcttcagtgagg120

taaatcantgttctccatagaggctgtgccattttacattcccaccaacagggcacaagg180

gttccagtttctccacatacttaccaacacttttttttttttttttttaacagtagtcat240

cctagaggatataggtgatctttcactgtgctttggatttatatttactggcttagattt300

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