專利名稱：：使用含有非常規(guī)堿基的引物的等溫鏈置換擴(kuò)增的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于在無熱循環(huán)下擴(kuò)增核酸分子的方法。
背景技術(shù)：
：用于從核酸序列群內(nèi)擴(kuò)增特定序列的使用最廣泛的方法是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法(DieffenbachC和DvekslerG編輯.PCRPrimer:ALaboratoryManual.ColdSpringHarborPress,PlainviewNY)。在這種擴(kuò)增方法中，使用通常在互補(bǔ)鏈上具有15至30個(gè)核苷酸長(zhǎng)度并且位于待擴(kuò)增區(qū)域兩末端的任意末端上的寡核香酸以便在變性的單鏈DNA模板上引發(fā)DNA合成。變性、引物雜交和使用熱穩(wěn)定性DNA聚合酶合成DNA鏈的連續(xù)循環(huán)允許以指數(shù)方式擴(kuò)增在引物之間的序列。RNA序列可以通過首先使用逆轉(zhuǎn)錄酶復(fù)制以產(chǎn)生cDNA拷貝而得到擴(kuò)增?？梢酝ㄟ^多種手段檢測(cè)擴(kuò)增的DNA片段，其中所述手段包括凝膠電泳、與標(biāo)記探針雜交、利用允許后續(xù)鑒定(例如通過酶聯(lián)測(cè)定法)的標(biāo)記性引物(taggedprimer)、利用與靶DNA雜交時(shí)產(chǎn)生信號(hào)的焚光標(biāo)記性引物(例如Beacon和TaqMan系統(tǒng))。PCR的一個(gè)不利之處是需要加熱和冷卻擴(kuò)增混合物的熱循環(huán)儀以使DNA變性。因此，擴(kuò)增不能在原始位點(diǎn)上實(shí)施或不能在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境之外輕易地搡作。除PCR以外，已經(jīng)開發(fā)用于檢測(cè)和擴(kuò)增特定序列的多種其它技術(shù)。一個(gè)實(shí)例是連4妄酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(BaranyF,GeneticdiseasedetectionandDNAamplificationusingclonedthermostableligase.Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:189-193(1991))。除依賴于擴(kuò)增反應(yīng)期間靶熱變性的常規(guī)DNA擴(kuò)增方法之外，在擴(kuò)增反應(yīng)期間不需要模板變性的眾多方法已經(jīng)得到描述并且因此稱作等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。等溫?cái)U(kuò)增首先于1992年得到描述(WalkerGT、LittleMC、NadeauJG和ShankD.IsothermalinvitroamplificationofDNAbyarestrictionenzyme/DNApolymerasesystem.PNAS89:392-396(1992))并被稱作鏈置換擴(kuò)增法(SDA)。從那時(shí)以來，已經(jīng)描述眾多其它的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，包括使用RNA聚合酶來拷貝RNA序列而不拷貝對(duì)應(yīng)基因組DNA的轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)性擴(kuò)增法(TMA)和基于核酸序列的擴(kuò)增法(NASBA)(GuatelliJC、WhitfieldKM、KwohDY、BarringerKJ、RichmannDD和GingerasTR.Isothermal,invitroamplificationofnucleicacidsbyamultienzymereactionmodeledafterretroviralreplication.PNAS87:1874-1878(1990);KievitsT、vanGemenB、vanStrijpD、SchukkinkR、DircksM、AdriaanseH、MalekL、SooknananR、LensP.NASBAisothermalenzymaticinvitronucleicacidamplificationoptimizedforthediagnosisofHIV-1infection.JVirolMethods.1991年12月；35(3):273-86)?；贒NA的其它等溫技術(shù)包括其中DNA聚合酶延長(zhǎng)針對(duì)環(huán)狀模板的引物的滾環(huán)擴(kuò)增法(RCA)(FireA和XuSQ.Rollingreplicationofshortcircles.PNAS92:4641-4645(1995)、使用用于輩巴^r測(cè)的環(huán)狀4笨針的分枝擴(kuò)增法(RAM)(ZhangW,CohenfordM、LentrichiaB、lsenbergHD、SimsonE、LiH、YiJ、ZhangDY.DetectionofChlamydiatrachomatisbyisothermalramificationamplificationmethod:afeasibilitystudy.JClinMicrobiol.2002年1月；40(l):128-32.)以及最近的使用解螺旋酶替代加熱以解開DNA鏈的解螺旋酶依賴性等溫DNA擴(kuò)增法(HDA)(VincentM，XuY,KongH.Helicase-dependentisothermalDNAamplification.EMBO2004年8月接收；5(8):795-800)。近來，已經(jīng)描述了DNA擴(kuò)增的等溫方法(WalkerGT、LittleMC、NadeauJG和ShankD.IsothermalinvitroamplificationofDNAbyarestrictionenzyme/DNApolymerasesystem.PNAS89:392-396(1992)。傳統(tǒng)擴(kuò)增技術(shù)依靠在擴(kuò)增反應(yīng)的每個(gè)循環(huán)中靶分子變性和復(fù)性的連續(xù)循環(huán)。DNA的熱處理在某種程度上導(dǎo)致DNA分子剪切，因此當(dāng)DNA有限的時(shí)候，如在從源于發(fā)育胚泡內(nèi)的少數(shù)細(xì)胞中分離DNA時(shí)，或特別是在DNA已經(jīng)是片段化形式的情況下，如在組織切片、石蠟塊和遠(yuǎn)古DNA樣品內(nèi)，這種加熱-冷卻循環(huán)可能進(jìn)一步損傷DNA并引起擴(kuò)增信號(hào)損失。等溫方法不依賴于模板DNA的連續(xù)變性以產(chǎn)生充當(dāng)用于進(jìn)一步擴(kuò)增的模板的單鏈分子，而依靠由特異限制性內(nèi)切核酸酶在恒定溫度下對(duì)DNA分子的酶切割。稱作鏈置換擴(kuò)增(SDA)的技術(shù)依靠某些限制酶切開半修飾DNA中的未修飾鏈的能力以及5'-3'外切核酸酶缺損的聚合酶延長(zhǎng)并置換下游鏈的能力。隨后通過有義反應(yīng)及反義反應(yīng)的偶聯(lián)實(shí)現(xiàn)指數(shù)性擴(kuò)增，在所述的反義反應(yīng)中來自有義反應(yīng)的置換鏈充當(dāng)反義反應(yīng)的模板(WalkerGT、LittleMC、NadeauJG和ShankD.IsothermalinvitroamplificationofDNAbyarestrictionenzyme/DNApolymerasesystem.PNAS89:392-396(1992)。此類才支術(shù)已經(jīng)用于成功地?cái)U(kuò)增結(jié)核分枝桿菌(綺coZ^c欲/謹(jǐn)勵(lì)e腦/節(jié)'5)(WalkerGT、LittleMC、NadeauJG禾口ShankD.IsothermalinvitroamplificationofDNAbyarestrictionenzyme/DNApolymerasesystem.PNAS89:392-396(1992)、HIV-1、丙型肝炎肝病毒和HPV-16(NuovoG.J.,2000)、沙眼衣原體(C/z/畫j^加c/zo廳fe)(SpearsPA、LinnP、WoodardDL和WalkerGT.SimultaneousStrandDisplacementAmplificationandFluorescencePolarizationDetectionofChlamydiatrachomatis.Anal.Biochem.247:130-137(1997)。SDA的使用迄今依賴修飾的硫代磷酸核苦酸以便產(chǎn)生半-硫代磷酸DNA雙鏈體，其中所述的雙鏈體在修飾的鏈上耐酶切割，導(dǎo)致非酶消化的酶切割以推動(dòng)置換反應(yīng)。然而，最近已經(jīng)設(shè)計(jì)數(shù)種"切口，，酶。這些酶不以傳統(tǒng)方式切割DNA，而在DNA鏈的一條鏈上產(chǎn)生切口。"切口"酶包括N.Alwl(XuY、LunnenKD和KongH.EngineeringanickingendonucleaseN.Alwlbydomainswapping.PNAS98:12990-12995(2001)、N.BstNBl(MorganRD、CalvetC、DemeterM、AgraR、KongH.CharacterizationofthespecificDNAnickingactivityofrestrictionendonucleaseN.BstNBl.BiolChem.2000Nov;381(ll):1123-5.)和Mlyl(BesnierCE、KongH.ConvertingMlylendonucleaseintoanickingenzymebychangingitsoligomerizationstate.EMBO2001年9月4妄受;2(9):782畫6.電子版2001年8月23日)。此類酶的使用因而將簡(jiǎn)化SDA方法。此外，已經(jīng)通過使用熱穩(wěn)定性限制酶(Aval)和熱穩(wěn)定性Exo-聚合酶(Bst聚合酶)的組合改良了SDA。該組合已經(jīng)證實(shí)增加反應(yīng)的擴(kuò)增效率，從108倍擴(kuò)增至101()倍擴(kuò)增，以致有可能使用該項(xiàng)技術(shù)來擴(kuò)增獨(dú)特的單拷貝分子。使用熱穩(wěn)定性聚合酶/熱穩(wěn)定性酶組合的所得擴(kuò)增系數(shù)(factor)是109數(shù)量級(jí)(MiIIaM.A.、SpearsP.A.、PearsonR.E.和WalkerG.T.UseoftheRestrictionEnzymeAvalandExo-BstPolymeraseinStrandDisplacementAmplification.Biotechniques199724:392-396)。迄今，全部等溫DNA擴(kuò)增技術(shù)均需要在啟動(dòng)擴(kuò)增之前加以變性的初始雙鏈模板DNA分子。此外，擴(kuò)增僅從每一個(gè)引發(fā)事件(primingevent)中啟動(dòng)一次。本發(fā)明的發(fā)明人現(xiàn)在已開發(fā)利用酶和引物并且不需要反復(fù)溫度循環(huán)的擴(kuò)增方法。
發(fā)明內(nèi)容在第一方面，本發(fā)明提供了用于等溫DNA擴(kuò)增的方法，該方法包括向待擴(kuò)增的DNA提供擴(kuò)增混合物，該擴(kuò)增混合物包含與DNA的區(qū)域至少部分互補(bǔ)并含有非常-見堿基的第一引物，與DNA的區(qū)域至少部分互補(bǔ)并含有非常規(guī)堿基的第二引物，DNA聚合酶，能夠進(jìn)行鏈置換的酶，識(shí)別雙鏈DNA內(nèi)的非常規(guī)堿基并在一條DNA鏈內(nèi)在非常規(guī)堿基處或其附近產(chǎn)生切口或切除石咸基的酶；以及在基本上無熱循環(huán)下擴(kuò)增DNA。任選地，DNA可以在添加擴(kuò)增混合物之前、期間或之后進(jìn)行變性。優(yōu)選地，第一引物與DNA的第一鏈的區(qū)域至少部分互補(bǔ)并且第二引物與DNA的第二鏈的區(qū)域至少部分互補(bǔ)。第一引物和第二引物可以是寡核苷酸、寡核苷酸類似物、具有嵌合特征的寡核苷酸如PNA/寡核苷酸或INA/寡核苷酸。優(yōu)選地，引物是脫氧寡核苷酸。優(yōu)選地，寡核苷酸類似物選自嵌入核酸(INA)、肽核酸(PNA)、己糖醇核酸(HNA)、MNA、阿卓糖S孚核酸(altritolnucleicacid,ANA)、鎖核酸(lockednucleicacid，LNA)、環(huán)己基核酸(CAN)、CeNA、蘇糖核酸(TNA)、(2'-NH)-TNA、基于核酸的綴合物、(3'-NH)-TNA、a-L-核糖-LNA、a-L-木糖-LNA、(3-D-木糖隱LNA、a-D-核糖-LNA、[3.2.1]-LNA、二環(huán)-DNA、6-氨基-二環(huán)-DNA、5-epi畫二環(huán)畫DNA、a-二環(huán)誦DNA、三環(huán)-DNA、二環(huán)[4.3.0]-DNA、二環(huán)[3.2.1]-DNA、二環(huán)[4.3.0]酰胺-DNA(Bicyclo[4.3.0]amide-DNA)、β-D-吡喃核糖基-NA(β-D-Ribopyranosyl-NA)、a-L-吡喃來蘇糖基-NA((3-D-Lyxopymnosyl-NA)、2'-R-RNA、2'-OR-RNA、a-L-RNA和P-D-RNA及它們的混合物和它們的雜交體(hybrid),以及它們的磷原子修飾物，例如但不限于硫代磷酸酯、磷酸甲基酯、亞磷酰胺、二碌u代磷酸酯、硒代磷酸酯、磷酸三酯和硼代磷酸酯。此外，不含磷的化合物可以用來與核苷酸(例如但不限于曱基亞胺甲基(methyliminomethyl)、formacetate、thioformacetate)及包含酰胺的接頭基團(tuán)(linkinggroup)連接。尤其，核酸和核酸類似物可以包含一個(gè)以上嵌入劑假核苷酸(intercalatorpseudonucleotide)。INA意指根據(jù)此處引入作為參考的WO03/051901、WO03/052132、WO03/052133和WO03/052134(UnestA/Sj受予HumanGeneticSignaturesPtyLtd)所教導(dǎo)的嵌入核酸。INA是包含一個(gè)以上嵌入劑假核苷酸(IPN)分子的寡核苦酸或寡核苦酸類似物。當(dāng)含有非常規(guī)堿基的引物與DNA結(jié)合時(shí)，該引物形成由酶識(shí)別的位點(diǎn)。非常規(guī)堿基(即非常規(guī)的DNA堿基)此處定義為除腺噤呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鳥。票呤(G)和胞嘧啶(C)之外的能夠插入DNA主鏈內(nèi)的化學(xué)實(shí)體。非常規(guī)堿基的實(shí)例包括，但不限于脫氧次黃苷、8-脫氧鳥噤呤、羥基尿嘧啶、5-曱基-dC、5-羥基尿苷、5陽(yáng)溴-dU、含有胞嘧啶的肌苷(lnosinewithC)、核糖核苷酸和尿嘧啶。更優(yōu)選地，非常規(guī)堿基是脫氧次黃苷。然而，可以理解的是非常規(guī)堿基實(shí)際上不必需具有核苷酸的結(jié)構(gòu)。引物可以具有一個(gè)以上非常規(guī)堿基。在一些情況下，兩個(gè)以上非常規(guī)石成基可以改善擴(kuò)增過程。非常規(guī)堿基可以定位密及或由至少幾個(gè)常規(guī)堿基隔開。DNA聚合酶可以是任何合適的聚合酶，如Taq聚合酶Stoffel片段、Taq聚合酶、AdvantageDNA聚合酶、AmpliTaq、AmplitaqGold、TitaniumTaq聚合酶、KlenTaqDNA聚合酶、PlatinumTaq聚合酶、AccuprimeTaq聚合酶、Pfu聚合酶、PfU聚合酶turbo、Vent聚合酶、VentExo-聚合酶、Pwo聚合酶、9。NmDNA聚合酶、Therminator、P&DNA聚合酶、ExpandDNA聚合酶、rTthDNA聚合酶、DyNAzymeT"EXT聚合酶、Klenow片段、DNA聚合酶1、DNA聚合酶、T7聚合酶、SequenaseTM、T4DNA聚合酶、BstB聚合酶、phi-29DNA聚合酶和DNA聚合酶Beta。鏈置換酶可以是任意合適的酶，如解螺旋酶、AP內(nèi)切核酸酶、能夠進(jìn)行鏈置換的錯(cuò)配修復(fù)酶或能夠進(jìn)行鏈置換的遺傳(或另外)修飾的酶。在優(yōu)選的形式中，DNA聚合酶還具有鏈置換能力。DNA聚合酶可以是具有鏈置換能力的任何合適的聚合酶。這種DNA聚合酶的實(shí)例包括，但不限于KlenowExo-(NewEnglandBiolabs(NEB)目錄號(hào)M0212S)、BstDNA聚合酶大片段(NEB目錄號(hào)M0275S)、VentExo-(NEB目錄號(hào)M0257S)、DeepVentExo國(guó)(NEB目錄號(hào)M0259S)、M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶(NEB目錄號(hào)M0253S)、9。NmDNA聚合酶(NEB目錄號(hào)M0260S)和Phi29DNA聚合酶(NEB目錄號(hào)M0269S)ThermoPhi(Prokariaehf)。優(yōu)選地，DNA聚合酶是KlenowExo-。優(yōu)選地，DNA聚合酶是外切核酸酶缺損的。酶可以是任意合適的酶，其中所述的酶能夠識(shí)別雙鏈DNA內(nèi)的非常規(guī)石咸基并可以產(chǎn)生切口或切除在非常規(guī)堿基處或其附近的堿基。所述酶的實(shí)例包括，但不限于內(nèi)切核酸酶V(脫氧次黃苦3'內(nèi)切核酸酶XNEB目錄號(hào)M0305S)、Fpg(NEB目錄號(hào)M0240S)、hOGGl(NEB目錄號(hào)M0241S)、RNA酶H(NEB目錄號(hào)M0297S)、APE1(NEB目錄號(hào)M0282S)、內(nèi)切核酸酶III(NEB目錄號(hào)M0268S)、內(nèi)切核酸酶IV(NEB目錄號(hào)M0304S)、內(nèi)切核酸酶VIII(NEB目錄號(hào)M0299S)、T7內(nèi)切核酸酶I(NEB目錄號(hào)M0302S)、USER酶(NEB目錄號(hào)M5505S)、McrBC(NEB目錄號(hào)M0272S)和尿嘧啶DNA糖基化敏NEB目錄號(hào)M0280S)。優(yōu)選地，所述酶是內(nèi)切核酸酶V。將理解的是在本發(fā)明方法中可以制造或獲得識(shí)別雙鏈DNA內(nèi)的非常規(guī)堿基并根據(jù)需要通過切割或造成堿基除去而起作用的其它合適的酶。用于DNA擴(kuò)增所需要的添加劑包括本領(lǐng)域已知的核苷酸、緩沖液或稀釋劑如鎂離子或錳離子、輔助因子等。所述擴(kuò)增混合物還可以含有核苷酸、緩沖液或稀釋劑如鎂離子或錳離子、輔助因子和合適的添加劑，如單鏈結(jié)合蛋白如T4gp32或RecA。擴(kuò)增可以在其中酶具有所需要活性的任何合適溫度下實(shí)施。通常，溫度可以是約20。C至約75t:、約25。C至6(TC或約3(rC至45i:。對(duì)于本研究中所用的酶，發(fā)現(xiàn)約42。C是特別適合的。將理解的是可以使用較高或較低的其它溫度并將包括環(huán)境溫度或室溫。重要的是，本發(fā)明不需要熱循環(huán)以擴(kuò)增核酸。在一個(gè)優(yōu)選形式中，DNA用修飾劑預(yù)處理，其中所述的修飾劑在形成單鏈修飾的DNA的條件下修飾胞嘧咬堿基，但不修飾5'-曱基-胞嘧咬堿基。優(yōu)選地，修飾劑選自亞硫酸氫鹽、乙酸鹽或檸檬酸鹽并且處理未造成大量的DNA片段化。更優(yōu)選地，修飾劑是亞硫酸氫鈉，其中亞硫酸氫鈉是一種在水存在下將胞嘧咬修飾成尿嘧咬的試劑。亞硫酸氬鈉(NaHS03)與胞嘧啶的5,6-雙鍵很容易反應(yīng)以形成易于脫氨在溫和堿性條件下除去亞硫酸酯基團(tuán)，導(dǎo)致尿嘧啶形成。因此，全部胞嘧啶有可能轉(zhuǎn)化成尿嘧啶。然而，因曱基化保護(hù)作用，任何曱基化胞嘧啶不能被修飾試劑轉(zhuǎn)化。用于亞辟u酸氫鹽處理核酸的優(yōu)選方法可以在HumanGeneticSignaturesPtyLtd(Australia)名下的WO2004/096825內(nèi)找到，其中所述文獻(xiàn)此處引用作為參考。如果處理的DNA的兩條鏈均需要在相同擴(kuò)增反應(yīng)內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增，則可以使用四條引物(即每條修飾的DNA鏈用兩條引物)。在第二方面，本發(fā)明提供用于等溫DNA擴(kuò)增的試劑盒，該試劑盒包含DNA聚合酶；能夠進(jìn)行鏈置換的酶；以及識(shí)別雙鏈DNA內(nèi)的非常規(guī)堿基并在一條DNA鏈內(nèi)在非常規(guī)堿基處或其附近產(chǎn)生切口或切除堿基的酶。優(yōu)選地，所述試劑盒還包含用于DNA擴(kuò)增所需要的添加劑。優(yōu)選地，所述試劑盒還包含使用該試劑盒的說明書。在優(yōu)選的形式中，所述DNA聚合酶與能夠進(jìn)行鏈置換的酶是相同的酶。在第三方面，本發(fā)明提供用于等溫DNA擴(kuò)增的引物，該引物含有至少一個(gè)內(nèi)部的非常M^成基并且當(dāng)該引物與DNA的區(qū)域結(jié)合時(shí)，形成由能夠產(chǎn)生切口或切除在一條DNA鏈內(nèi)在非常規(guī)堿基處或其附近的堿基的酶所識(shí)別的位點(diǎn)。優(yōu)選地，非常規(guī)減基是除腺嘌呤(A),胸腺嘧啶(T)、鳥嘌呤(G)和胞嘧啶(C)之外的能夠插入DNA主鏈內(nèi)的化學(xué)實(shí)體。更優(yōu)選地，非常規(guī)堿基選自由下列所組成的組中脫氧次黃苷、8-脫氧鳥嘌呤、5-曱基胞嘧啶、羥基尿嘧啶、核糖核苷酸和尿嘧啶。更優(yōu)選地，非常規(guī)》成基是脫氧次黃香。在第四方面，本發(fā)明提供根據(jù)本發(fā)明第二方面的試劑盒的用途，用于在基本上無熱循環(huán)下的DNA擴(kuò)增。在第五方面，本發(fā)明提供根據(jù)本發(fā)明第四方面的引物的用途，用于在基本上無熱循環(huán)下的DNA擴(kuò)增。在第六方面，本發(fā)明提供具有鏈置換能力的DNA聚合酶的用途，用于在基本上無熱循環(huán)下的DNA擴(kuò)增。在第七方面，本發(fā)明提供識(shí)別雙鏈DNA內(nèi)非常規(guī)堿基并在一條DNA鏈內(nèi)在非常規(guī)堿基處或其附近產(chǎn)生切口或切除堿基的酶的用途，用于在基本上無熱循環(huán)下的DNA擴(kuò)增。在第八方面，本發(fā)明提供具有鏈置換能力的DNA聚合酶以及識(shí)別雙鏈DNA內(nèi)的非常規(guī)堿基并在一條DNA鏈內(nèi)在非常規(guī)堿基部位或其附近產(chǎn)生切口或切除堿基的酶的用途，用于在基本上無熱循環(huán)下的DNA。包括，但不限于，疾病檢測(cè)、擴(kuò)增DNA或RNA中所需的基因或區(qū)段(segment)、SNP檢測(cè)、實(shí)時(shí)擴(kuò)增法、擴(kuò)增亞石危酸氫鹽處理的DNA、全基因組擴(kuò)增方法、作為克隆方法的附加、原位(/"Ww)擴(kuò)增細(xì)胞學(xué)標(biāo)本上的DNA(如檢測(cè)切片或才未片內(nèi)的樣i生物)、檢測(cè)食品污染中的微生物、擴(kuò)增染色體內(nèi)的斷點(diǎn)(如各種癌癥中的BCR-ABL易位)、擴(kuò)增已插入染色體的可能具有致癌性或預(yù)示疾病進(jìn)程的序列(如HPV片段插入物)、檢測(cè)正常細(xì)胞與癌細(xì)胞內(nèi)的曱基化序列與非曱基化序列以及原位檢測(cè)用于胚泡發(fā)育常態(tài)的IVF試驗(yàn)中的曱基化改變。通過在等溫?cái)U(kuò)增之前實(shí)施RNA的逆轉(zhuǎn)錄而用于RNA。此外，本發(fā)明不需要用于擴(kuò)增的加熱或冷卻。預(yù)期本發(fā)明的方法可以在"實(shí)地"，即在室溫或環(huán)境溫度下實(shí)施，不需要有動(dòng)力的實(shí)驗(yàn)設(shè)備。在本發(fā)明范圍內(nèi)，除非上下文另外要求，詞語(yǔ)"包含"或變化如"包含"或"包含"將理解為表示包括所述的要素、整數(shù)或步驟，或要素、整數(shù)或步驟的組，但不排除任何其它的要素、整數(shù)或步驟，或要素、整數(shù)或步驟的組。對(duì)已經(jīng)在本說明書內(nèi)包含的文件、行為、材料、裝置、條款(article)等的討論，目的僅在于提供本發(fā)明的上下文背景。不能認(rèn)為因?yàn)槿我饣蛉康倪@些事項(xiàng)先于本發(fā)明的開發(fā)而存在，其就形成現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)的部分或作為與本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域內(nèi)的常識(shí)。為了可以更清楚地理解本發(fā)明，優(yōu)選的實(shí)施方式將參考如下附圖和實(shí)施例力口以描述。圖1顯示本發(fā)明的核酸擴(kuò)增方法的示意圖2顯示使用本發(fā)明方法擴(kuò)增靶序列的結(jié)果的瓊脂糖凝膠分析；圖3顯示使用本發(fā)明方法擴(kuò)增靶序列的結(jié)果的瓊脂糖凝膠分析；圖4顯示等溫DNA擴(kuò)增方法與常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)直接比較的瓊脂糖凝膠分析；圖5顯示擴(kuò)增來自人基因組DNA的12SrDNA基因；圖6顯示等溫?cái)U(kuò)增多種人乳頭瘤病毒(HPV)DNA的結(jié)果；圖7顯示測(cè)試NO變性對(duì)反應(yīng)影響的等溫?cái)U(kuò)增人乳頭瘤病毒(HPV)DNA的結(jié)果；圖8顯示在引物中使用多種非常規(guī)》成基安置(placement)的等溫?cái)U(kuò)增；圖9顯示使用含有核糖核苷酸的寡核苷酸引物與RNA酶H和Klenowexo-組合的等溫?cái)U(kuò)增的結(jié)果；圖IO顯示使用含有8-脫氧鳥噤呤的寡核苷酸引物與RNA酶H和Klenowexo-組合的等溫?cái)U(kuò)增的結(jié)果。具體實(shí)施例方式材料和方法非常規(guī)減基非常規(guī)堿基在本文中定義為除腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鳥嘌呤(G)和胞嘧啶(C)之外的能夠插入DNA主鏈內(nèi)的化學(xué)實(shí)體。非常規(guī)堿基的實(shí)例包括，但不限于脫氧次黃苷、8-脫氧鳥噪呤或羥基尿嘧啶、5-曱基-dC、5-溴-dU、具有胞嘧啶的肌苷(lnosinew他C)、核糖核苷酸和尿嘧啶。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)非常規(guī)J威基脫氧次黃苷可用于本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出非常規(guī)堿基實(shí)際上不需要具有核苷酸的結(jié)構(gòu)以在本發(fā)明中發(fā)揮功能。引物可以使用任何可商業(yè)獲得的DNA合成裝置或自制(inhouse)DNA合成儀合成引物。非常規(guī)堿基可以使用標(biāo)準(zhǔn)亞膦酰胺(phosphoamidite)合成技術(shù)引入至引物的任何位置內(nèi)。酶幾種模式可用于實(shí)施本發(fā)明。I.含有由內(nèi)切核酸酶V識(shí)別的非常規(guī)堿基即脫氧次黃苦的寡核苷酸。II.含有由酶FPg識(shí)別的非常規(guī)堿基即8-脫氧鳥。票呤或羥基尿嘧啶的寡核苷酸。III.含有由酶hOGGl識(shí)別的非常規(guī)堿基即8-脫氧鳥嘌呤或羥基尿嘧啶的寡核苦酸。IV.含有由RNA酶H識(shí)別的非常規(guī)堿基即核糖核苷酸的寡核苷酸。V.含有由尿嘧啶DNA糖基化酶或USER酶識(shí)別的非常規(guī)堿基即尿嘧啶的寡核芬酸。VI.含有由酶McrBC識(shí)別的非常規(guī)堿基即5-曱基胞嘧啶的寡核苷酸。能夠進(jìn)行鏈置換的酶包括Klenowexo-、BstDNA聚合酶大片段(largefragment)、Ventexo-、DeepVentexo-、M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶、9°NmDNA聚合酶和PW29DNA聚合酶.DNA聚合酶可以是具有鏈置換能力的任何合適的聚合酶。所述DNA聚合酶的實(shí)例包括，但不限于Klenowexo-(NewEnglandBiolabs(NEB)目錄號(hào)M0212S)、BstDNA聚合酶大片段(NEB目錄號(hào)M0275S)、Ventexo-(NEB目錄號(hào)M0257S)、DeepVentexo-(NEB目錄號(hào)M0259S)、M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶(NEB目錄號(hào)M0253S)、9°NmDNA聚合酶(NEB目錄號(hào)M0260S)和Phi29DNA聚合酶(NEB目錄號(hào)M0269S)ThermoPhiTM(Prokariaehf)。優(yōu)選地，DNA聚合酶是Klenowexo-。擴(kuò)增混合物在引物內(nèi)的非常My5烕基是N=脫氧次黃苦。能夠進(jìn)行鏈置換的DNA聚合酶是內(nèi)切核酸酶V,識(shí)別雙鏈DNA內(nèi)的非常規(guī)堿基的酶是KlenowExo-，50ng引物，500uMdNTP，1mMMgCl2，反應(yīng)容器內(nèi)的9ulx1Stoffel緩沖液(PerkinElmer-AppliedBioSystems,FosterCity,USA)擴(kuò)增才艮據(jù)本發(fā)明的擴(kuò)增以如下方式發(fā)生(見圖1):第一引物與DNA(A)的一條鏈結(jié)合，DNA聚合酶延長(zhǎng)第一引物，形成具有含非常規(guī)堿基(B)的第一條新合成鏈的雙鏈分子，切割酶在延長(zhǎng)的DNA(C)的非常規(guī)堿基處或其附近產(chǎn)生切口或切除堿基，能夠進(jìn)行鏈置換的鏈置換酶或DNA聚合酶置換新合成的第一鏈(D),第二引物與已置換的新合成的第一鏈(E)結(jié)合，DNA聚合酶延長(zhǎng)第二引物，形成具有含非常規(guī)堿基(F)的新合成第二鏈的雙鏈分子，切割酶在延長(zhǎng)的DNA(G)的非常規(guī)-威基處或其附近產(chǎn)生切口或切除石咸基，能夠進(jìn)行鏈置換的鏈置換酶或DNA聚合酶置換新合成的第二鏈(H),第一引物與已置換的新合成的第一鏈(I)結(jié)合，并且該過程繼續(xù)形成重復(fù)的新合成的DNA鏈(J)。聚合酶應(yīng)當(dāng)以5'-3'方向拷貝第一引物，如果該情況未發(fā)生，則反應(yīng)將在第三輪擴(kuò)增后因?yàn)榍锌谖稽c(diǎn)丟失而停止，防止進(jìn)一步擴(kuò)增。以上反應(yīng)隨后將繼續(xù)循環(huán)切割、延長(zhǎng)和置換的重復(fù)輪次。引物通常由聚合酶再生以允許連續(xù)輪次的擴(kuò)增。結(jié)果等溫?cái)U(kuò)增的特異性為證實(shí)本發(fā)明的特異性，擴(kuò)增反應(yīng)在兩種人工DNA(靶和非靶)分子上實(shí)施。靶5'AGGGAATTTTTTTTCGCGATGTTTCGGCGCGTTAGTTCGTTGCGTATATTTCGTTGCGGTTTTTTTTTTGGTTTTTTCGGTTAGTTGCGCGGCGATTTCGGGGATTTTAG3'(SEQIDNO1)非靶5'AGGGAATTTTTTTTTGTGATGTTTTGGTGTGTTAGTTTGTTGTGTATATTTTGTTGTGGTTTTTTTTTTGGTTTTTTTGGTTAGTTGTGTGGTGATTTTGGGGATTTTAG3'(SEQIDNO2)兩種寡核苷酸的差異是在全部非靶寡核苷酸中的全部CpG雙聯(lián)體由TpG雙聯(lián)體替換。等溫?cái)U(kuò)增使用針對(duì)靶DNA序列檢測(cè)的如下引物對(duì)加以實(shí)施引物#15'AGGGAATTTTTTTTCGCNATGTTTCGGCGCGTTAGTTCGT3'(SEQIDN03)引物#25'CTAAAATCCCCGAAATCGCCGCNCAACTAACCGAAAAAAC3'(SEQIDNO4)非常規(guī)堿基是N二脫氧次黃苷。使用標(biāo)準(zhǔn)亞膦酰胺化學(xué)合成引物。擴(kuò)增在如下條件下實(shí)施在9μL的xlStoffel緩沖液(PerkinElmer-AppliedBioSystems,FosterCity,美國(guó))內(nèi)的50ng以上各寡核苷酸引物、500μMdNTP、1mMMgCl2、0.5U內(nèi)切核酸酶V、2UKlenowExo-。8個(gè)皮摩爾的靶寡核苷酸和非靶寡核苷酸都進(jìn)行102至10—4稀釋。隨后將lμl稀釋的DNA添加至以上反應(yīng)混合物內(nèi)并在42℃溫育2小時(shí)。l0μL擴(kuò)增的產(chǎn)物與10μl水混合，并且將擴(kuò)增產(chǎn)物在E-Gel484%瓊脂糖(HR)凝膠(Invitrogen目錄號(hào)G8O8O-O4)上解析以及使用Powerbase頂運(yùn)行凝膠。標(biāo)記是E-Gel低分子量范圍定量DNA梯(Invitrogen目錄號(hào)12373-031)。使用KodakUVIdocEDAS290系統(tǒng)在紫外光照射下使凝膠視覺化。圖2顯示使用亞硫酸氫鹽曱基化的合成性靶序列和亞硫酸氫鹽非曱基化的合成性非靶序列，在42℃溫育2小時(shí)后所產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物的4%瓊脂糖凝膠分析。該結(jié)果證實(shí)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的特異性。合成兩種合成性寡核苷酸(110bp)(見下文)。使用含有單個(gè)內(nèi)部次黃苷(I)堿基的寡核苷酸實(shí)施等溫?cái)U(kuò)增，其中設(shè)計(jì)所述的寡核香酸旨在對(duì)亞硫酸氬鹽曱基化的合成性靶DNA序列的擴(kuò)增呈特異性。正如可以看出，反應(yīng)對(duì)靶DNA分子的擴(kuò)增呈特異性。甚至當(dāng)存在過量的非耙DNA時(shí)，看不到來自非靶DNA的條帶。反應(yīng)對(duì)曱基化序列的檢測(cè)是特異性的，并且甚至當(dāng)模板高度豐富時(shí)，仍未擴(kuò)增非曱基化序列。因此甚至在相對(duì)低的溫度(42°C)上，有可能區(qū)分具有相對(duì)相似性的兩種序列。等溫?cái)U(kuò)增的效率為測(cè)定擴(kuò)增的效率，通過本發(fā)明的方法擴(kuò)增連續(xù)稀釋的靶DNA。圖3顯示在42。C溫育4小時(shí)后所產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物的4%瓊脂糖凝膠分析。箭頭指示正確的擴(kuò)增產(chǎn)物。在圖3A中的雙聯(lián)體是含有完整引物序列和鏈置換產(chǎn)物的全長(zhǎng)擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)果，其中所述的鏈置換產(chǎn)物含有次黃苷插入物的引物序列5'。引物對(duì)A含有如下寡核苦酸引物引物#15'AGGNAATTTTTTTTCGCNATGTTTCGGCGCGTTAGTTCGT3'(SEQIDN05)引物#25'CTAAAATCCCCGAAATCGCCGCNCAACTAACCGAAAAAAC3'(SEQIDNO4)非常規(guī)堿基是N=脫氧次黃苷。引物對(duì)B含有相同的引物，但是反應(yīng)補(bǔ)加1mMDTT。引物#25'CTAAAATCCCCGAAATCGCCNCGCAACTAACCGAAAAAAC3'(SEQIDNO6)非常規(guī)堿基是N=脫氧次黃苷。使用標(biāo)準(zhǔn)亞膦酰胺化學(xué)合成引物。擴(kuò)增在如下條件下實(shí)施在9pl的xlStoffel緩沖液(PerkinElmer-AppliedBioSystems,FosterCity，美國(guó))內(nèi)的50ng以上各寡核苷酸引物、500dNTP、1mMMgCl2、0.5U內(nèi)切核酸酶V、2UKlenowExo隱。靶DNA是110bp的合成性寡核苷酸<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage18</formula><formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage19</formula>(SEQIDNO1)8皮摩爾的靶DNA從l(T3至10々進(jìn)行連續(xù)稀釋。隨后將1^1稀釋的DNA添加至以上反應(yīng)混合物內(nèi)并在42°C溫育4小時(shí)。l0ul擴(kuò)增的產(chǎn)物與10W水混合，并且將擴(kuò)增產(chǎn)物在E-Gel484%瓊脂糖(HR)凝膠(Invitrogen目錄號(hào)G8080-04)上解析以及使用Powerbasetm逸行凝膠。標(biāo)記是E-Gel低分子量范圍定量DNA梯(Invitrogen目錄號(hào)12373-031)。使用KodakUVIdocEDAS290系統(tǒng)在紫外光照射下使凝月交視覺化。正如可從圖3中看出，該方法能夠在使用模板DNA的105稀釋物時(shí)從靶DNA序列中擴(kuò)增DNA。此外，如可從圖3B中看出，與圖3A相比，擴(kuò)增通過添加DTT至1mM終濃度得以改善。這表示有可能從正確雜交的相同寡核苷酸中獲得多個(gè)置換事件，這不同于其中從每個(gè)正確的引發(fā)事件內(nèi)僅可以產(chǎn)生一個(gè)新拷貝的常規(guī)PCR。這表明在理論上，本發(fā)明的等溫技術(shù)在擴(kuò)增DNA序列方面甚至可能比PCR更敏感，因?yàn)榭梢詮拿總€(gè)正確的引發(fā)事件中產(chǎn)生靶的多重拷貝。PCR擴(kuò)增的比較為了與市場(chǎng)上的擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)比較本發(fā)明的效率，使用相同的引物和靶DNA實(shí)施PCR。使用如下引物實(shí)施PCR引凈勿#15'AGGGAATTTTTTTTCGCNATGTTTCGGCGCGTTAGTTCGT3'(SEQIDNO3)引物#25'CTAAAATCCCCGAAATCGCCGCNCAACTAACCGAAAAAAC3'(SEQIDNO4)非常規(guī)堿基是N^脫氧次黃苷。PCR反應(yīng)混合物在總反應(yīng)體積25[il內(nèi)使用100ng以上各引物于x1Promega主混合物中制備。PCR產(chǎn)物的樣品在ThermoHybaidPX2熱循環(huán)儀內(nèi)，在如下條件下擴(kuò)增在95。C下30秒、在50。C下45秒、在68。C下45秒的25個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。耙DNA是110bp的合成性寡核苷酸<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage20</formula>8皮摩爾的靶DNA進(jìn)行10-2至l0-8的連續(xù)稀釋。隨后將l)μl稀釋的DNA添加至以上反應(yīng)混合物內(nèi)。l0μl的PCR衍生產(chǎn)物與10μl水混合，并且將PCR產(chǎn)物在4%瓊脂糖凝膠(Invitrogen目錄號(hào)G6000-04)上解析以及使用Powerbase頂運(yùn)行凝月交。標(biāo)記是E-Gel低分子量范圍定量DNA梯(Invitrogen目錄號(hào)12373-031)。使用KodakUVIdocEDAS290系統(tǒng)在紫外光照射下使凝膠視覺化。圖4顯示等溫DNA擴(kuò)增方法與常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的直接比較。使用PCR，僅可能在使用模板DNA的106稀釋物時(shí)看到擴(kuò)增的條帶。利用25個(gè)擴(kuò)增循環(huán)通常足以成功擴(kuò)增多重拷貝的靶，如12S核糖體DNA序列?？梢詮慕Y(jié)果中看出等溫DNA擴(kuò)增方法是用于DNA擴(kuò)增的快速、敏感而特異的方法。該方法不需要昂貴的熱循環(huán)設(shè)備，因此可以在任何常規(guī)實(shí)驗(yàn)室或甚至在夕卜科手術(shù)室(doctorssurgery)內(nèi)實(shí)施。雙鏈DNA的直接姿擴(kuò)增圖5顯示來自人基因組DNA的12SrDNA基因的擴(kuò)增。擴(kuò)增在如下條件下實(shí)施50ng的每種寡核苷酸引物Fl5'AACAAAACTGCTCNCCAGAACACTACNAGCCACAGCTTAA-3'(SEQIDNO7)和Rl5'TGGTGAGGTTGATCNGGGTTTATCNATTACAGAACAGGCT-3'(SEQIDN08),在9μl的x0.5Stoffe緩沖液(PerkinElmer-AppliedBioSystems,FosterCity,USA)內(nèi)的500pMdNTP、1mMMgCl2和濃度150ng、15ng、1.5ng和0.15ng的1(il人基因組DNA(Promega目錄號(hào)G147A)。反應(yīng)混合物在95。C加熱2分鐘，隨后在冰上驟冷(snap-chilled)。反應(yīng)混合物隨后補(bǔ)足在10的x0.5Stoffel緩沖液(PerkinElmer-AppliedBioSystems,FosterCity,USA)內(nèi)的0.5U內(nèi)切核酸酶V、2UKlenowExo-和1mMDTT。2010ul擴(kuò)增的產(chǎn)物與10(J水混合，并且將擴(kuò)增產(chǎn)物在E-Gel484%瓊脂糖(HR)凝膠(Invitrogen目錄號(hào)G8080-04)上解析以及使用Powerbase頂運(yùn)行凝膠。標(biāo)記是E-Gel低分子量范圍定量DNA梯(Invitrogen目錄號(hào)12373-031)。使用KodakUVIdocEDAS290系統(tǒng)在紫外光照射下使凝膠視覺化。病毒DNA擴(kuò)增從ATCC獲得含有全長(zhǎng)人乳頭瘤病毒(HPV)病毒基因組HPVla(45021)、HPV16(45113D)和HPV18(45152D)的質(zhì)粒。如供應(yīng)者推薦提示那樣制備質(zhì)粒制品。在^f吏用Qiagen質(zhì)粒midi試劑盒(目錄號(hào)12143)純化質(zhì)粒后，對(duì)HPV-la和HPV-16，根據(jù)制造商說明書用歷m/III(NEB目錄號(hào)R0104S)或用C7al(NEB目錄號(hào)R0197S)使質(zhì)粒線性化。在無菌水中制備質(zhì)粒的10倍連續(xù)稀釋物以充當(dāng)用于等溫?cái)U(kuò)增的模板。等溫?cái)U(kuò)增使用如下針對(duì)靶HPVDNA序列檢測(cè)引物對(duì)實(shí)施HPV-la引物引物#15'GGAGGAGTTAGTGTCNCCTCAGCAACCTTATGCTGTCNTT3'(SEQIDN09)引物#25'GCACAGTGGGCACACNATGTTCAAAGATCNCAGAAGGAG3'(SEQIDNO10)HPV-16引物#15'CCAGCTGGACAAGCAGAACCNGACAGAGCCCATTAC3'(SEQIDNO11)引物#25'CCAAAGTACGAATGTCTACNTGTGTGCTTTGTACNCACAAC3'(SEQIDNO12)HPV-18引物#15'GCTGCAACCGAGCACNACAGGAACGACTCCAACGACNCAGAG31(SEQIDNO13)引物#25'ACAACATTGTGTGACNTTGTGGTTCGGCTCNTCGGGCTGG3'(SEQIDNO14)非常規(guī)堿基是N-脫氧次黃苷。使用標(biāo)準(zhǔn)亞膦酰胺化學(xué)合成引物。擴(kuò)增在如下條件下實(shí)施在9μl的x1Stoffel緩沖液(PerkinElmer-AppliedBioSystems，F(xiàn)osterCity,美國(guó))內(nèi)的50ng以上各寡核苷酸引物、500jiMdNTP、1mMMgCl2、0.5U內(nèi)切核酸酶V、2UKlenowExo-。制備純化的質(zhì)粒DNA從100ng/μl至100ng/μl的10倍連續(xù)稀釋物。質(zhì)粒稀釋物在95℃加熱2分鐘，隨后在冰上驟冷直至需要。隨后將lμl稀釋的DNA添加至以上反應(yīng)混合物內(nèi)并在42℃溫育4小時(shí)。lOμl擴(kuò)增的產(chǎn)物與10μl水混合，并且將擴(kuò)增產(chǎn)物在E-Gel484%瓊脂糖(HR)凝膠(Invitrogen目錄號(hào)G8080-04)上解析以及使用PowerbaseTM運(yùn)行凝膠。標(biāo)記(M)是E-Gel低分子量范圍定量DNA梯(Invitrogen目錄號(hào)12373-031)。使用KodakUVIdocEDAS290系統(tǒng)在紫外光照射下使凝膠視覺化。結(jié)果示于圖6。10倍連續(xù)稀釋HPV18(45152D)以確定對(duì)于使用等溫系統(tǒng)的擴(kuò)增是否需要預(yù)加熱。等溫?cái)U(kuò)增使用如下針對(duì)HPV靶DNA序列檢測(cè)引物對(duì)實(shí)施HPV-18引物#15'GCTGCAACCGAGCACNACAGGAACGACTCCAACGACNCAGAG3'(SEQIDNO13)引物#25'AAATTCCNGTTGACCTTCTATGTCACNAGCAATTAAGCGAC3'(SEQIDNO15)非常規(guī)堿基是N二脫氧次黃苷。使用標(biāo)準(zhǔn)亞膦酰胺化學(xué)合成引物。擴(kuò)增在如下條件下實(shí)施在9μl的xlStoffel緩沖液(PerkinElmer-AppliedBioSystems,FosterCity,美國(guó))內(nèi)的50ng以上各寡核苷酸引物、500|iMdNTP、1mMMgCl2、0.5U內(nèi)切核酸酶V、2UKlenowExo-。制備純化的質(zhì)粒DNA從100ng/μl至1ng/μl的10倍連續(xù)稀釋物。隨后將lμl稀釋的DNA在不進(jìn)行預(yù)變性下添加至以上反應(yīng)混合物內(nèi)并在42℃溫育4小時(shí)。lOμl擴(kuò)增的產(chǎn)物與10μl水混合，并且將擴(kuò)增產(chǎn)物在E-Gel484%瓊脂糖(HR)凝膠(Invitrogen目錄號(hào)G8080-04)上解析以及使用Powerbase頂運(yùn)行凝膠。標(biāo)記(M)是E-Gel低分子量范圍定量DNA梯(Invitrogen目錄號(hào)12373-031)。使用KodakUVIdocEDAS290系統(tǒng)在紫外光照射下使凝膠視覺化。結(jié)果示于圖7。該結(jié)果提示在某些情況下不需要在等溫?cái)U(kuò)增之前使雙鏈DNA模板初始變性。非常規(guī)堿基的安置(placement)等溫?cái)U(kuò)增使用如下針對(duì)以下輩巴序列檢測(cè)的引物對(duì)實(shí)施5’AGGGAAFTTTTTTTCGCGATGTTTCGGCGCGTTAGTTCGTTGCGTAl、ATTTCGTTGCGGTTiFTTTTTTTGGTTTTTTCGGTTAGTTGCGCGGCGAFTTCGGGGAFTTTAG3’(SEQIDNO1)野生型正向引物5'-AGGGAATTTTTTTTCGCGATGTTTCGGCGCGTTAGTTCGT(SEQIDNO16)G5'-AGGGAATTTTTTTTCGCNATGTTTCGGCGCGTTAGTTCGT(SEQIDNO3)C5'-AGGGAATTTTTTTTCGNGATGTTTCGGCGCGTTAGTTCGT(SEQIDNO17)A5'-AGGGAATTTTTTTTCGCGNTGTTTCGGCGCGTTAGTTCGT(SEQIDNO18)T5'-AGGGAATTTTTTTTCGCGANGTTTCGGCGCGTTAGTTCGT(SEQIDNO19)野生型反向引物5'-CTAAAATCCCCGAAATCGCCGCGCAACTMCCGAAAAAAC(SEQIDNO20)G5'-CTAAAATCCCCGAAATCGCCGCNCAACTAACCGAAAAAAC(SEQIDNO4)C5'-CTAAAATCCCCGAAATNGCCGCGCAACTAACCGAAAAAAC(SEQIDNO21)A5-CTAAAATCCCCGAANTCGCCGCGCAACTAACCGAAAAAAC(SEQIDNO22)T5'-CTAAAATCCCCGAAANCGCCGCGCAACTAACCGAAAAAAC(SEQIDNO23)非常規(guī)堿基是N-脫氧次黃苷。隨后比較四對(duì)引物以確定次黃苷在寡核苦酸內(nèi)安置的影響。使用標(biāo)準(zhǔn)亞膦酰胺化學(xué)合成引物。擴(kuò)增在如下條件下實(shí)施在9pi的xlStoffel緩沖液(PerkinElmer-AppliedBioSystems,FosterCity,美國(guó))內(nèi)的50ng以上各寡核苦酸引物、500(^MdNTP、lmMMgCl2、0.5U內(nèi)切核酸酶V、2UKlenowExo-。制備從10—2稀釋至10_6稀釋的靶DNA的10倍連續(xù)稀釋物。隨后將l^il稀釋的DNA添加至以上反應(yīng)混合物內(nèi)并在42°C溫育4小時(shí)。lOpl擴(kuò)增的產(chǎn)物與10μl水混合，并且將擴(kuò)增產(chǎn)物在E-Gel484%瓊脂糖(HR)凝膠(Invitrogen目錄號(hào)G8080-04)上解析以及使用PowerbaseTM運(yùn)行凝膠。標(biāo)記(M)是E-Gel低分子量范圍定量DNA梯(Invitrogen目錄號(hào)12373-031)。使用KodakUVIdocEDAS290系統(tǒng)在紫外光照射下使凝膠視覺化并且結(jié)果示于圖8。對(duì)已擴(kuò)增DNA的結(jié)果表明當(dāng)次黃香置換序列內(nèi)的G時(shí)，反應(yīng)更有效地進(jìn)行。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明對(duì)于這個(gè)DNA擴(kuò)增試驗(yàn)，次黃苷的優(yōu)選位置是在其中次黃苷替換CpG雙核苷酸內(nèi)G的Cl。使用核糖核苷酸的擴(kuò)增等溫?cái)U(kuò)增使用針對(duì)如下靶DNA序列檢測(cè)的引物對(duì)實(shí)施GGATTTTAG3'(SEQIDNO1)引物#15'AGGGAATmTnTCGrCrGrAUrGTTTCGGCGCGTTAGTrCGT3'(SEQIDNO24)引物#25'CTAAAATCCCCGAAAUrCrGrCrCGCGCAACTAACCGAAAAAAC3'(SEQIDNO25)非常規(guī)堿基是r二核糖核苷酸.使用標(biāo)準(zhǔn)亞膦酰胺化學(xué)合成引物。擴(kuò)增在如下條件下實(shí)施在9ul的xlO反應(yīng)緩沖液(或者NEB緩沖液l、幻enow緩沖液或Stoffel緩沖液)內(nèi)的50ng以上各寡核苷酸引物、500fiMdNTP、lmMMgCl2、0.1URNA酶H、2.5U幻enowExo-。制備靶DNA從10—1至l(T3的10倍連續(xù)稀釋物。隨后將1^1稀釋的DNA添加至以上反應(yīng)混合物內(nèi)并在42℃溫育4小時(shí)。10ul擴(kuò)增的產(chǎn)物與10pil水混合，并且將擴(kuò)增產(chǎn)物在E-Gel484%瓊脂糖(HR)凝膠(Invitrogen目錄號(hào)G8080-04)上解析以及使用Powerbasetm逸行凝膠。標(biāo)記(M)是E-Gel低分子量范圍定量DNA梯(Invitrogen目錄號(hào)12373-031)。使用KodakUVIdocEDAS290系統(tǒng)在紫外光照射下使凝膠-魄覺化并且結(jié)果示于圖9使用8-脫氧鳥噤呤的擴(kuò)增等溫?cái)U(kuò)增使用針對(duì)如下靶DNA序列檢測(cè)的引物對(duì)實(shí)施GGATTTTAG3'(SEQIDNO1)P#l5'AGGGAATTTTTTTTCGCNNNGATGTTTCGGCGCGTTAGTTCGT(SEQIDNO26)P#25'CTAAAATCCCCGAAATCGGCCNNNGCGCAACTAACCGAAAAAAC(SEQIDNO27)非常規(guī)堿基是NNNG二8-脫氧鳥嘌呤。引物使用標(biāo)準(zhǔn)亞膦酰胺化學(xué)合成。擴(kuò)增在如下條件下實(shí)施在9ul的x10反應(yīng)緩沖液x1Stoffel緩沖液(PerkinElmer-AppliedBioSystems，F(xiàn)osterCity，美國(guó))內(nèi)的50ng以上各寡核苷酸引物、500dNTP、lmMMgCl2、lUFpg、2.5UKlenowExo-。制備靶DNA從10_1至10_3的IO倍連續(xù)稀釋物。隨后將1^1稀釋的DNA添加至以上反應(yīng)混合物內(nèi)并在42℃溫育4小時(shí)。10ul擴(kuò)增的產(chǎn)物與10jil水混合，并且將擴(kuò)增產(chǎn)物在E-Gel484%瓊脂4唐(HR)凝膠(Invitrogen目錄號(hào)G8080-04)上解析以及使用PowerbaseTM運(yùn)行凝膠。標(biāo)記(M)是E-Gel低分子量范圍定量DNA梯(Invitrogen目錄號(hào)12373-031)。使用KodakUVIdocEDAS290系統(tǒng)在紫外光照射下使凝膠視覺化并且結(jié)果示于圖10。本領(lǐng)域技術(shù)人員明白可以對(duì)如在具體實(shí)施方案中所示的本發(fā)明作出多種變化和/或修改而不脫離廣義描述時(shí)的本發(fā)明的精神和范圍。因此無論如何將本實(shí)施方案視作是說明性而非限制性的。權(quán)利要求1.用于等溫DNA擴(kuò)增的方法，該方法包括向待擴(kuò)增的DNA提供擴(kuò)增混合物，其中所述的擴(kuò)增混合物包含與DNA的區(qū)域至少部分互補(bǔ)并含有非常規(guī)堿基的第一引物，與DNA的區(qū)域至少部分互補(bǔ)并含有非常規(guī)堿基的第二引物，DNA聚合酶，能夠進(jìn)行鏈置換的酶，識(shí)別雙鏈DNA內(nèi)的非常規(guī)堿基并在一條DNA鏈內(nèi)在非常規(guī)堿基處或其附近產(chǎn)生切口或切除堿基的酶；以及在基本上無熱循環(huán)下擴(kuò)增DNA。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述DNA在添加擴(kuò)增混合物之前、期間或之后進(jìn)行變性。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述第一引物與DNA的第一鏈的區(qū)域至少部分互補(bǔ)并且所述第二引物與DNA的第二鏈的區(qū)域至少部分互補(bǔ)。4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述第一引物和第二引物是寡核苷酸、寡核苷酸類似物、具有嵌合特征的寡核苷酸如PNA/寡核脊酸或INA/寡核苷酸。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述引物是脫氧寡核苷酸。6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述引物含有兩個(gè)以上非常規(guī)堿基。7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，當(dāng)引物與DNA結(jié)合時(shí)，該引物形成由酶識(shí)別的位點(diǎn)。8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述非常M^基是除腺噤呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鳥噤呤(G)和胞嘧啶(C)之外的能夠插入DNA主鏈內(nèi)的化學(xué)實(shí)體。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述非常規(guī)堿基選自由下列所組成的組中脫氧次黃苷、8-脫氧鳥噤呤、羥基尿嘧啶、核糖核苷酸、5-曱基胞嘧咬和尿嘧啶。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述非常規(guī)石威基是脫氧次黃苷。11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述鏈置換酶選自由下列所組成的組中解螺旋酶、AP內(nèi)切核酸酶和任何能夠進(jìn)行鏈置換的酶中的錯(cuò)配修復(fù)酶。12.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述DNA聚合酶還具有鏈置換能力。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述DNA聚合酶是外切核酸酶缺損的。14.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述能夠識(shí)別雙鏈DNA內(nèi)非常規(guī)堿基的酶選自由下列所組成的組中內(nèi)切核酸酶V(脫氧次黃苷3'內(nèi)切核酸酶)、Fpg、hOGGl、RNA酶H、McrBC和尿嘧啶DNA糖基化酶。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述酶是內(nèi)切核酸酶V。16.根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的方法，該方法還包括用于DNA擴(kuò)增所需要的添加劑。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述添加劑包括核苷酸、緩沖液或稀釋劑如鎂離子或錳離子、輔助因子和單鏈結(jié)合蛋白如T4gp32。18.根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)所述的方法，其中，擴(kuò)增在其中酶具有所需要活性的任何合適的溫度下實(shí)施。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述溫度是從約20℃至約75℃。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述溫度是約42℃。21.根據(jù)權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述DNA用修飾劑預(yù)處理，其中，所述的修飾劑在形成單鏈修飾的DNA的條件下修飾胞嘧咬堿基，但是不修飾5'-曱基-胞嘧咬堿基。22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述修飾劑選自亞硫酸氫鹽、乙酸鹽或檸檬酸鹽并且處理未造成大量的DNA片段化。23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中，所述修飾劑是亞硫酸氫鈉。24.用于等溫DNA擴(kuò)增的試劑盒，該試劑盒包含DNA聚合酶；能夠進(jìn)行鏈置換的酶；以及識(shí)別雙鏈DNA內(nèi)的非常規(guī)堿基并在一條DNA鏈內(nèi)在非常規(guī)堿基處或其附近產(chǎn)生切口或切除-咸基的酶。25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的試劑盒，該試劑盒還包含用于DNA擴(kuò)增所需要的添加劑。26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的試劑盒，該試劑盒還包含使用該試劑盒的i^明書。27.根據(jù)權(quán)利要求24至26中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中，所述DNA聚合酶和能夠進(jìn)行鏈置換的酶是相同的酶。28.用于等溫DNA擴(kuò)增的引物，其中，所述引物含有至少一個(gè)內(nèi)部的非常規(guī)堿基并且當(dāng)與DNA的區(qū)域結(jié)合時(shí)，形成由能夠在一條DNA鏈內(nèi)在非常規(guī)堿基處或其附近產(chǎn)生切口或切除堿基的酶識(shí)別的位點(diǎn)。29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的引物，其中，所述非常規(guī)堿基是除腺。票呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鳥嘌呤(G)和胞嘧啶(C)之外的能夠插入DNA主鏈內(nèi)的化學(xué)實(shí)體。30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的引物，其中，所述非常規(guī)堿基選自由下列所組成的組中脫氧次黃苷、8-脫氧鳥噤呤、羥基尿嘧啶、核糖核苷酸、5-甲基胞嘧啶和尿嘧啶。31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的引物，其中，所述非常規(guī)堿基是脫氧次黃苷。32.權(quán)利要求24至27中任一項(xiàng)所述的試劑盒的用途，用于在基本上無熱循環(huán)下的DNA擴(kuò)增。33.權(quán)利要求28至31中任一項(xiàng)所述的引物的用途，用于在基本上無熱循環(huán)下的DNA擴(kuò)增。34.具有鏈置換能力的DNA聚合酶的用途，用于在基本上無熱循環(huán)下的DNA擴(kuò)增。35.識(shí)別雙鏈DNA內(nèi)的非常規(guī)堿基并在一條DNA鏈內(nèi)在非常規(guī)堿基處或其附近產(chǎn)生切口或切除堿基的酶的用途，用于在基本上無熱循環(huán)下的DNA擴(kuò)增。36.具有鏈置換能力的DNA聚合酶以及識(shí)別雙鏈DNA內(nèi)的非常規(guī)堿基并在一條DNA鏈內(nèi)在非常規(guī)堿基處或其附近產(chǎn)生切口或切除堿基的酶的用途，用于在基本上無熱循環(huán)下的DNA擴(kuò)增。全文摘要本發(fā)明涉及用于等溫DNA擴(kuò)增的方法，該方法包括向待擴(kuò)增的DNA提供擴(kuò)增混合物，該擴(kuò)增混合物包含與DNA的區(qū)域至少部分互補(bǔ)并含有非常規(guī)堿基的第一引物、與DNA的區(qū)域至少部分互補(bǔ)并含有非常規(guī)堿基的第二引物、DNA聚合酶、能夠進(jìn)行鏈置換的酶、識(shí)別雙鏈DNA內(nèi)的非常規(guī)堿基并在一條DNA鏈內(nèi)在非常規(guī)堿基處或其附近產(chǎn)生切口或切除堿基的酶；以及在基本上無熱循環(huán)下擴(kuò)增DNA。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101203618SQ200680018325公開日2008年6月18日申請(qǐng)日期2006年5月25日優(yōu)先權(quán)日2005年5月26日發(fā)明者杰夫雷·W.·格里格,約翰·R.·梅爾基,道格拉斯·斯彭切爾·米勒申請(qǐng)人:人類遺傳標(biāo)記控股有限公司