本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種分子標(biāo)記，具體地，涉及一種與谷子生育期基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。本發(fā)明還涉及該分子標(biāo)記的引物、該分子標(biāo)記在谷子生育期基因定位或谷子遺傳育種中的用途、一種谷子生育期基因定位方法、以及一種谷子育種方法。
背景技術(shù)：
：谷子起源于中國，是傳統(tǒng)的優(yōu)勢作物、主食作物和抗旱耐瘠作物。谷子抗旱耐瘠、水份利用效率高、適應(yīng)性廣，不僅在目前旱作生態(tài)農(nóng)業(yè)中有重要作用，而且針對日益嚴(yán)重的水資源短缺，谷子還是重要的戰(zhàn)略儲備作物。谷子去殼后的小米營養(yǎng)豐富且各種成分平衡，是具有營養(yǎng)保健作用的糧食作物，對人體有重要作用的食用粗纖維是大米的5倍，是近年來興起的世界性雜糧熱的主要作物。同時谷子秸稈粗蛋白含量在8％左右，飼草谷子秸稈粗蛋白含量在15％以上，是禾本科中最優(yōu)質(zhì)的飼草，在畜牧業(yè)發(fā)展中有重要作用。因此，加速谷子育種進程尤為重要。由于谷子屬于小粟類作物，在遺傳理論研究方面落后于玉米、小麥、谷子等禾谷類作物。如何應(yīng)用先進科學(xué)的研究手段指導(dǎo)谷子育種是一個嚴(yán)峻的問題。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)，為谷子的遺傳研 究及育種開辟了新的思路和方法。開發(fā)與重要性狀基因緊密連鎖的分子標(biāo)記并進行分子標(biāo)記輔助選擇育種，能顯著提高我國谷子育種水平。谷子生育期與品種及產(chǎn)量密切相關(guān)。但目前還沒有文獻(xiàn)報道谷子生育期相關(guān)基因的定位研究。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明人依據(jù)全基因組序列，經(jīng)過大量的實驗和不懈的努力，提供了一種與谷子(setariaitalical.beauv.)生育期基因緊密連鎖的分子標(biāo)記svhd4，并由此提供了下述發(fā)明：本發(fā)明的一個方面涉及一種與谷子生育期基因緊密連鎖的分子標(biāo)記svhd4，其核苷酸序列如seqidno：1所示。183bp：gttggccggcttggggctctggccgaagccgaggagatccaccgcgaacaacctgctgttgagggtggaggactcgcggaacaccgtctcagcccagaaggacgacgacgacgtgaagccgtgcacgaagatggcattctcggcgctgatctcctcgctatctgttcctgcttcatctgcaaa(seqidno：1)在本發(fā)明中，術(shù)語“與谷子生育期基因緊密連鎖的分子標(biāo)記”是指這樣的分子標(biāo)記，在遺傳連鎖圖譜中，該分子標(biāo)記與谷子抗除草劑基因的遺傳連鎖距離小于2cm或者小于3cm。本發(fā)明的還一方面涉及本發(fā)明的分子標(biāo)記的引物，其核苷酸序列如seqidno：2和seqidno：3所示：正向引物：cgccttctgctcggacggca(seqidno：2)反向引物：agccccaggtggtccgact(seqidno：3)本發(fā)明的分子標(biāo)記也可以為含有seqidno：1所示核苷酸序列的dna片段；該dna片段的長度為適當(dāng)長度，但并不特別限定，例如，小于10,000bp、小于5,000bp、小于2,000bp、小于1,500bp、小于1,200bp、小于1,000bp、或者小于800bp。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述分子標(biāo)記(含有seqidno：1所示核苷酸序列的dna片段)為谷子基因組中seqidno：1所示核苷酸序列的dna片段，即所包含的seqidno：1的5’端和/或3’端以外的核苷酸序列也是谷子基因組中的序列，優(yōu)選地，為谷子基因組中seqidno：1的5’端和/或3’端的上下游序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，只要擴增或者檢測谷子基因組dna中的該分子標(biāo)記，必然能夠在長生育期谷子中檢測或擴增得到含有seqidno：1所示的序列，或者在短生育期谷子中不能檢測或擴增得到含有seqidno：1所示的序列。seqidno：1的5’端和/或3’端的上下游序列的長度為適當(dāng)長度，并不特別限定，例如，滿足分子標(biāo)記的長度小于10,000bp、小于5,000bp、小于2,000bp、小于1,500bp、小于1,200bp、小于1,000bp、或者小于800bp。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述分子標(biāo)記(含有seqidno：1所示核苷酸序列的dna片段)所包含的seqidno：1的5’端和/或3’端可操作地連接有人工序列和/或控制序列，例如啟動子、增強子、終止子、酶切位點、引物序列等等。其中，術(shù)語 “可操作地”在本發(fā)明中定義為一種如下構(gòu)象，在該構(gòu)象中，控制序列例如啟動子被適當(dāng)?shù)刂糜趕eqidno：1的一個位置上，以致該控制序列指導(dǎo)seqidno：1編碼的多肽的產(chǎn)生。本發(fā)明的另一方面涉及一種重組載體，其含有本發(fā)明的分子標(biāo)記。所述重組載體可以是插入有本發(fā)明的分子標(biāo)記的表達(dá)載體或者克隆載體。本發(fā)明的還一方面涉及一種重組細(xì)胞，其含有該重組載體。本發(fā)明的還一方面涉及本發(fā)明的分子標(biāo)記的制備方法，包括下述步驟：使用長生育期谷子的基因組dna作為模板，以上述引物進行pcr擴增，得到的擴增產(chǎn)物即含有所述分子標(biāo)記；優(yōu)選地，還包括將pcr擴增產(chǎn)物進行純化的步驟。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述長生育期谷子為wd-2(晚熟，長生育期，116天)。對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，可以理解，也可以dna化學(xué)合成的方法得到本發(fā)明的分子標(biāo)記。本發(fā)明的還一方面涉及所述分子標(biāo)記的檢測方法，包括下述步驟：(1)根據(jù)本發(fā)明的分子標(biāo)記的核苷酸序列設(shè)計引物；(2)以被檢測谷子的基因組dna作為模板進行擴增；(3)判斷擴增產(chǎn)物中是否存在該分子標(biāo)記。例如，可以以被檢測谷子的基因組dna為模板，以上述引物(seqidno：2和seqidno：3)進行pcr擴增，得到擴增產(chǎn)物?？梢詫⒌玫降臄U增產(chǎn)物進行測序或者凝膠電泳。本發(fā)明的還一方面涉及本發(fā)明的分子標(biāo)記在谷子生育期基因定位或檢測中的用途。本發(fā)明的還一方面涉及一種谷子生育期基因定位的方法，包括使用本發(fā)明的分子標(biāo)記的步驟。本發(fā)明的還一方面涉及本發(fā)明的分子標(biāo)記在谷子輔助育種中的用途。本發(fā)明的還一方面涉及一種谷子輔助育種方法，包括檢測本發(fā)明的分子標(biāo)記的步驟。本發(fā)明的分子標(biāo)記可用于今后的分子標(biāo)記輔助育種中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，比如通過檢測是否存在本發(fā)明的分子標(biāo)記來篩選長生育期或短生育期的谷子。所述檢測可以是pcr檢測的方法，具體地，可以使用上述的本發(fā)明的分子標(biāo)記引物。所述檢測還可以通過測序方法進行。該谷子輔助育種方法具有簡便、快速、高通量的優(yōu)點。發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供了與谷子生育期基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，并將谷子基因組dna與谷子生育期基因聯(lián)系起來，更有利于谷子分子標(biāo)記輔助育種體系的建立；所述分子標(biāo)記與生育期基因的遺傳緊密連鎖距離為1.3cm。本發(fā)明的分子標(biāo)記可以簡便、快速、高通量地應(yīng)用于谷子輔助育種。附圖說明圖1：分子標(biāo)記引物(seqidno：2和seqidno：3)對215個重組自交系ril株系(f6代)單株擴增的部分結(jié)果。其中：泳道1－5為ril株系中長生育期單株的pcr擴增產(chǎn)物；泳道7－11為ril株系中短生育期單株的pcr擴增產(chǎn)物。泳道6為marker，其分子量包括：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、以及100bp。結(jié)果顯示：ril株系中長生育期單株擴增產(chǎn)物條帶為698bp，ril株系中短生育期單株擴增產(chǎn)物條帶為515bp。具體實施方式下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器、材料未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實施例1：谷子ril群體的構(gòu)建父本：寧夏早谷，早熟(短生育期，104天)。母本：烏當(dāng)2號(wd-2)，晚熟(長生育期，116天)。父本和母本雜交得到f1，f1代通過單粒傳法得到215個重組自交系ril株系(f6代)。寧夏早谷和wd-2可以從深圳華大農(nóng)業(yè)與循環(huán)經(jīng)濟科技有限公司購得。實施例2：基因組dna的提取針對實施例1中獲得的谷子ril群體，用ctab法分別提取父母本及ril群體單株的基因組dna，具體方法如下：(1)稱取1.0g新鮮葉片，剪碎放入研缽，用液氮研磨后加入3ml1.5×ctab，研磨成勻漿轉(zhuǎn)入15ml的離心管中，然后往研缽中加入1ml1.5×ctab沖洗再轉(zhuǎn)入離心管中?；靹蚝笥?5℃水浴30min，期間不時緩慢搖勻。其中1.5×ctab配方如下(1l)：ctab15g1mol/l的tris.cl(ph為8.0)75ml0.5mol/l的edta30mlnacl61.4g加去離子水定容至1l，使用前加入終濃度為0.2％(2ml)的巰基乙醇。(2)待冷卻至室溫，加入等體積氯仿/異戊醇(24：1)，輕輕混勻，至下層液變?yōu)樯罹G色。(3)4200rpm離心10min，將上層水相移到新的15ml離心管，加2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，混合靜止5min。于-20℃放置30min沉淀dna。(4)4200rpm離心10min，棄掉上清，加入1ml75％乙醇洗滌沉淀1次，倒置離心管干燥dna，加入200μlte溶解dna。(5)用0.8％的瓊脂糖凝膠檢測基因組dna。(6)將得到的父母本及ril群體單株的基因組dna存于 -20℃?zhèn)溆?。實施?：基因定位和分子標(biāo)記開發(fā)(1)遺傳圖譜構(gòu)建針對實施例2中獲得的ril個體的基因組dna，基于rad-seq的基因分型技術(shù)(http://www.bioon.com.cn/server/show_product.asp？id＝12291)對ril群體的個體進行基因分型，獲得ril群體的基因型數(shù)據(jù)。用mapmaker3.0軟件(constructinggeneticmapswithmapmaker/exp3.0，slincoln,mdaly,elander-cambridge,ma:whiteheadinstitute,1992，通過參照將其全文并入本文)進行遺傳連鎖圖譜繪制，得到遺傳連鎖圖。(2)基因定位針對實施例1中獲得的ril群體，將ril群體的個體表型，與父本型性狀相似的記為a，與母本型性狀相似的記為b，性狀居于父本和母本之間的記為h。得到全部個體的表型數(shù)據(jù)，將個體的表型數(shù)據(jù)與之前得到的基因型數(shù)據(jù)進行比較，從而將谷子生育期基因定位在遺傳連鎖圖譜上。結(jié)果顯示，谷子生育期基因定位在2號染色體39053453bp至39098769bp區(qū)間內(nèi)，長度約為45316bp。(3)分子標(biāo)記開發(fā)將父本和母本分別進行全基因組重測序(10x)，然后根據(jù)rad-seq的測序結(jié)果，利用soap軟件比對測序reads，然后用 soapsv尋找父母本基因組片段差異較大的分子標(biāo)記，便于用凝膠電泳區(qū)分鑒別。結(jié)果，選擇靠近谷子生育期基因所在區(qū)段的標(biāo)記svhd4(seqidno：1所示的核酸序列)作為候選。svhd4的核苷酸序列如下(183bp)：gttggccggcttggggctctggccgaagccgaggagatccaccgcgaacaacctgctgttgagggtggaggactcgcggaacaccgtctcagcccagaaggacgacgacgacgtgaagccgtgcacgaagatggcattctcggcgctgatctcctcgctatctgttcctgcttcatctgcaaa(seqidno：1)。實施例4：分子標(biāo)記的生育期相關(guān)性驗證對實施例3中確定的谷子生育期相關(guān)分子標(biāo)記svhd4(seqidno：1所示的核酸序列)進行驗證，具體如下：針對上述分子標(biāo)記設(shè)計引物，引物序列如下所示：正向引物：5’-cgccttctgctcggacggca-3’(seqidno：2)；反向引物：5’-agccccaggtggtccgact-3’(seqidno：3)。利用上述引物，通過pcr擴增和瓊脂糖凝膠電泳檢測來驗證該標(biāo)記的多態(tài)性和擴增穩(wěn)定性。具體地，以實施例2中提取的父本、母本、ril群體單株的基因組dna為模板，利用上述擴增引物進行pcr擴增，其中，pcr反應(yīng)體系如下：無菌水20.2μl10*buffer(含mg2+)2.5μldntps(25mm)0.15μltaq酶(5u/μl)0.15μl正向引物(10μm)0.5μl反向引物(10μm)0.5μl模板1.0μl總體積25μlpcr反應(yīng)程序如下：94℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸40秒，運行35個循環(huán)；最后72℃延伸3分鐘。pcr擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后于4℃下保存。接著，將各pcr擴增產(chǎn)物取部分進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖1。如圖1所示，長生育期的單株均擴增出698bp的條帶，短生育期的單株均擴增出515bp的條帶。由此，證明該分子標(biāo)記svhd4(seqidno：1所示的核酸序列)在父母本之間具有多態(tài)性，該分子標(biāo)記與谷子生育期性狀緊密連鎖。然后，利用3730測序儀對各擴增產(chǎn)物進行測序，結(jié)果顯示，母本及ril群體中長生育期單株擴增產(chǎn)物為698bp，其序列如seqidno：4所示：cgccttctgctcggacggcaggaagtacggctgcaaccaacggaggcggtcaac tgacggatcagcaattacttctcatctcccaattcagagctaactctgcttgggtagttgggttcattggaattggaatgaaggcactctgctacttactggcgcgacaagtgtgatcgatttcactcgggttgggtgcttggcagccagcgcgagggcgatgacgcagcccatggagtgggcaaccaggtggaaggagctcaagttgtggtgctcaacgaggcttctctcgatcgcctcgacgtggtctttcagtctgtacttgcagttggccggcttggggctctggccgaagccgaggagatccaccgcgaacaacctgctgttgagggtggaggactcgcggaacaccgtctcagcccagaaggacgacgacgacgtgaagccgtgcacgaagatggcattctcggcgctgatctcctcgctatctgttcctgcttcatctgcaaacctacaagcgttactgttccttaattgaacggcgaaaaagggaacggaaaagagacagaattgcgcgtcgaggttgcagacaaaaccgcatgctaacctttggcctccggctctttcacggcgacgtgcagccggccgccgccgccccgccacgcgacgcacgacttgcacccgcagtcggaccacctggggct(seqidno：4)；上述下劃線序列即為本發(fā)明的分子標(biāo)記seqidno：1。父本及ril群體中短生育期單株擴增產(chǎn)物為515bp，其序列如seqidno：5所示：cgccttctgctcggacggcaggaagtacggctgcaaccaacggaggcggtcaactgacggatcagcaattacttctcatctcccaattcagagctaactctgcttgggtagttgggttcattggaattggaatgaaggcactctgctacttactggcgcgacaagtgtgatcgatttcactcgggttgggtgcttggcagccagcgcgagggcgatgacgcagcccatggagtgggcaaccaggtggaaggagctcaagttgtggtgctcaacgaggcttctctcgatcgcctcgacgtggtctttcagtctgtacttgcacctacaagcgttactgttccttaattgaacggcgaaaaagggaacggaaaagagacagaattgcgcg tcgaggttgcagacaaaaccgcatgctaacctttggcctccggctctttcacggcgacgtgcagccggccgccgccgccccgccacgcgacgcacgacttgcacccgcagtcggaccacctggggct(seqidno：5)母本及ril群體中長生育期單株與父本及ril群體中短生育期單株擴增條帶相比增加了一些序列，該序列即為分子標(biāo)記svhd4(seqidno：1所示的核酸序列)。此外，利用上述擴增引物(seqidno：2和seqidno：3)擴增含有該生育期位點的其它谷子群體或品種，長生育期的單株均擴增出698bp的條帶，短生育期的單株均擴增出515bp的條帶。由此證明該分子標(biāo)記使用于含有該生育期位點的其它谷子群體或品種。盡管本發(fā)明的具體實施方式已經(jīng)得到詳細(xì)的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解。根據(jù)已經(jīng)公開的所有教導(dǎo)，可以對那些細(xì)節(jié)進行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。當(dāng)前第1頁12