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一種硝化細(xì)菌硝化效果的快速檢測方法與流程

文檔序號:12794095閱讀:1562來源:國知局
一種硝化細(xì)菌硝化效果的快速檢測方法與流程

本發(fā)明屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域,具體指一種硝化細(xì)菌硝化效果的快速檢測方法。



背景技術(shù):

硝化細(xì)菌是一種環(huán)境生態(tài)微生物,它在促進(jìn)水域生態(tài)系統(tǒng)的氮循環(huán)和保持健康的水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境發(fā)揮著巨大的作用。近年來,隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模日益擴(kuò)大和集約化程度不斷提高,水質(zhì)污染的問題也隨之日益加重。在養(yǎng)殖水域形成的眾多污染物中,亞硝酸鹽尤其突出,也最為有害,它對養(yǎng)殖動物有顯著毒性。如水體中的亞硝酸鹽含量較高,預(yù)示水質(zhì)狀況惡化,會引起養(yǎng)殖動物中毒,許多疾病癥狀由此發(fā)生,嚴(yán)重者會導(dǎo)致死亡。一般的水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)律是,在養(yǎng)殖的中后期,隨著水體中殘餌和排泄物增加和逐漸積累,并伴隨著藻體突發(fā)死亡等因素,水體的亞硝態(tài)氮往往不能向硝態(tài)氮正常轉(zhuǎn)化,硝化通道受阻,使得水體亞硝酸鹽含量急劇升高。在居高不下的情況下,很容易使魚蝦等水產(chǎn)品在生長后期在將臨近收獲的時候發(fā)生亞硝酸鹽中毒,從而造成巨大損失。所以解決好亞硝酸鹽中毒問題,是水產(chǎn)養(yǎng)殖取得成功的一個關(guān)鍵。

目前,對于處理亞硝酸鹽中毒的具體措施,雖然有物理方法或化學(xué)方法或生物學(xué)方法等多種多樣,但比較安全也比較有效的措施,還是采用專業(yè)生態(tài)微生物硝化細(xì)菌,這是國內(nèi)外水產(chǎn)養(yǎng)殖的共識,也是目前解決亞硝酸鹽中毒采用的主要辦法。硝化細(xì)菌的作用機(jī)理,主要是通過生物氧化通常稱為硝化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化途徑,在一定溫度環(huán)境和反應(yīng)時間條件下,可將養(yǎng)殖水體中有毒的亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為無毒的硝酸鹽,具體的生物化學(xué)反應(yīng)步驟如圖1所示。

在現(xiàn)有技術(shù)中,對于水體亞硝酸鹽實(shí)際含量水平,可按國標(biāo)gb/t7493-1987水質(zhì)亞硝基態(tài)氮的分光光度法進(jìn)行測定,也可采用國內(nèi)外生產(chǎn)的各種形式和規(guī)格的水質(zhì)測定儀進(jìn)行測定,但這些測定方法都不是直接測定硝化細(xì)菌硝化效果的方法。對所有水產(chǎn)養(yǎng)殖企業(yè)來說,如采用了硝化細(xì)菌來降低亞硝酸鹽含量,最迫切需要知道的是,當(dāng)產(chǎn)品在投入養(yǎng)殖水體后是不是有效、效果高低如何、能不能把水體中的亞硝酸鹽降下來。因此希望能找到預(yù)測硝化效果的快速方法的同時,又能夠檢測出市場上各種硝化細(xì)菌產(chǎn)品的真正效果,一直是本領(lǐng)域技術(shù)人員有待解決的技術(shù)難題。



技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題,公開了一種硝化細(xì)菌硝化效果的快速檢測方法,該方法采用多個有蓋的塑料瓶或玻璃瓶作為硝化反應(yīng)容器,建立亞硝酸鹽底物溶液的不同梯度,分別加入1g或1ml單位硝化細(xì)菌,組成硝化反應(yīng)液,形成硝化反應(yīng)體系。然后在保證一定溫度和反應(yīng)時間的條件下,進(jìn)行一系列的硝化反應(yīng)。最后采用格利斯比色試劑比色,應(yīng)用該比色系統(tǒng)對反應(yīng)物亞硝酸鹽顯玫瑰紅色,而對反應(yīng)產(chǎn)物硝酸鹽顯無色這一特征反應(yīng),通過比色就可直接觀察到亞硝酸鹽的轉(zhuǎn)化結(jié)果,并通過硝化反應(yīng)所轉(zhuǎn)化形成的無色體積,來具體量化硝化細(xì)菌在降低亞硝酸鹽濃度的作用效果。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的,一種硝化細(xì)菌硝化效果的快速檢測方法,具體步驟如下:

步驟一,準(zhǔn)備亞硝酸鹽溶液;

步驟二,配置亞硝酸鹽硝化反應(yīng)體系;

步驟三,硝化反應(yīng);

步驟四,制備比色試劑;

步驟五,比色檢測;

步驟六,比色結(jié)果和硝化效果評估。

進(jìn)一步,所述的亞硝酸鹽溶液,具體指配置的亞硝基態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)工作液,或取含亞硝酸鹽的水產(chǎn)養(yǎng)殖水。

進(jìn)一步,所述的步驟二具體為:

2.1,采用有蓋的容器作為硝化反應(yīng)容器,將步驟一中一定濃度的亞硝酸鹽溶液,在瓶中配置成不同體積梯度的反應(yīng)底物溶液,反應(yīng)容器包括塑料瓶或玻璃瓶;

2.2,再向各個不同體積梯度的反應(yīng)底物溶液反應(yīng)瓶中分別加入1g或1ml單位硝化細(xì)菌,形成不同體積梯度的硝化反應(yīng)體系。可以根據(jù)需要選擇反應(yīng)底物量與菌種的比例確定檢測范圍;進(jìn)一步,所述的步驟三具體為:

3.1,將上述硝化反應(yīng)瓶蓋緊,充分振搖,使硝化細(xì)菌溶出分散,與底物混合均勻;

3.2,把硝化反應(yīng)瓶放入25℃~35℃的恒溫箱,維持16~22小時進(jìn)行硝化反應(yīng)。

進(jìn)一步,所述的步驟四具體為:

4.1,制備格利斯試劑?。悍Q取分析純對氨基苯磺酸0.5g溶于150ml30%冰醋酸,避光保存;

4.2,制備格利斯試劑ⅱ:稱取分析純α-萘胺0.5g加入50ml蒸餾水中,煮沸至刻度,然后緩緩加入30%冰醋酸溶液15ml,使α-萘胺完全溶解,過濾,0℃~10℃冰箱保存。

進(jìn)一步,所述的步驟五具體為:

5.1,將各個硝化反應(yīng)瓶中的硝化反應(yīng)液以及不加硝化細(xì)菌作為對照的硝化反應(yīng)底物溶液,分別加到各比色管25ml刻度處,按體積梯度從小到大排列;

5.2,對每個比色管各加入0.5ml格利斯試劑ⅰ,后再加入0.5ml格利斯試劑ⅱ,搖勻,靜置,在比色后5~8分鐘觀察結(jié)果;

進(jìn)一步,所述的步驟六具體為:,

6.1,第一種情況:若步驟5中所有硝化反應(yīng)液的比色管都顯示玫瑰紅色,且色度與對應(yīng)的對照管沒有差異,顯示硝化反應(yīng)不產(chǎn)生硝化效果,可認(rèn)為此硝化細(xì)菌無效,亞硝酸鹽的去除率為0%;

6.2,第二種情況:若步驟5中有的硝化反應(yīng)液的比色管沒有紅色生成,顯示為無色,即表明這個硝化反應(yīng)瓶中反應(yīng)液所含的亞硝酸鹽已經(jīng)完全轉(zhuǎn)化為硝酸鹽,亞硝酸鹽的去除率為100%;若在多個顯示為無色的體積梯度硝化反應(yīng)瓶中,取梯度中最大的無色體積表示硝化效果;

6.3,第三種情況:若步驟5中有的體積梯度硝化反應(yīng)瓶對應(yīng)的比色管還顯紅色,但與對照管的色度相比有明顯差異,只需對色度最淡、最接近無色的硝化反應(yīng)瓶溶液,采用與對照稀釋液對比檢測的方法確定硝化效果。具體操作過程如下:分別吸取作為對照液的亞硝酸鹽底物溶液2.5ml或5ml或10ml或15ml或20ml到各比色管,各加水到25ml刻度稀釋,然后再與硝化反應(yīng)液的比色管同時比色對比,找到色度相同或最接近的兩者,則可按如下公式計算出此硝化反應(yīng)比色管對應(yīng)的硝化反應(yīng)瓶中亞硝酸鹽去除率(%):

然后再按如下公式計算出它的等同無色體積(ml)來表示它的硝化效果:

等同無色體積(ml)=反應(yīng)液體積(ml)×亞硝酸鹽去除率(%)。

比較上述兩種硝化效果表示,取其中最大無色體積或等同無色體積(ml計)表示此硝化細(xì)菌最高硝化效果,即當(dāng)最大無色體積大于等同無色體積時,以最大無色體積表示此硝化細(xì)菌最高硝化效果;當(dāng)?shù)韧瑹o色體積大于最大無色體積時,則取等同無色體積表示此硝化細(xì)菌最高硝化效果。

本方法在上述中提到的硝化細(xì)菌最高硝化效果的含義,具體是指1毫升或1克單位硝化細(xì)菌,作用于一定濃度的亞硝酸鹽底物溶液,通過硝化反應(yīng)后,因硝化細(xì)菌具有轉(zhuǎn)化溶液中亞硝酸鹽為硝酸鹽的功能,當(dāng)采用格利斯試劑比色,基于其對亞硝酸鹽顯示紅色,而對硝酸鹽顯示無色的特有反應(yīng),把硝化反應(yīng)液比色后顯示的無色作為硝化效果的特征標(biāo)志,并取不同體積梯度硝化反應(yīng)產(chǎn)生的最大無色體積或等同無色體積作為代來量化硝化細(xì)菌的最高硝化效果。

根據(jù)硝化細(xì)菌在硝化反應(yīng)中所形成的最大無色(或等同無色)體積作為硝化效果的數(shù)據(jù),可把硝化細(xì)菌產(chǎn)生的硝化效果劃分為無效(無色或等同無色體積為0ml)、有效(無色或等同無色體積在0ml以上,500ml以下)、顯效(無色或等同無色體積在500ml以上,1000ml以下)和高效(無色或等同無色體積在1000ml盡快以上)四種效果等級。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)的有益效果在于:

1)本發(fā)明的快速檢測方法,可廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域。亞硝酸鹽中毒是水產(chǎn)養(yǎng)殖中經(jīng)常發(fā)生的嚴(yán)重問題,尤其是養(yǎng)蝦業(yè)。目前解決這個問題的最有效措施主要是及時向中毒養(yǎng)殖水域投放有效硝化細(xì)菌,盡早地使養(yǎng)殖水的亞硝酸鹽濃度降下來,盡快產(chǎn)生解毒效果。但是目前大多數(shù)水產(chǎn)養(yǎng)殖企業(yè)還不能鑒別硝化細(xì)菌產(chǎn)品的真?zhèn)魏蜏y定硝化細(xì)菌硝化效果的高低。本發(fā)明的快速檢測方法不但可對硝化細(xì)菌有無硝化效果作出定性判斷,還可通過對不同體積梯度硝化反應(yīng)液的比色結(jié)果可以定量硝化細(xì)菌硝化效果的高低水平,可以事先預(yù)測投放硝化細(xì)菌產(chǎn)生的硝化效果,確定降低亞硝酸鹽含量的最佳投菌量,使降毒取得成效。本發(fā)明的快速檢測方法,操作簡單、直觀、實(shí)用,獲得結(jié)果快速,可在養(yǎng)殖現(xiàn)場對硝化細(xì)菌的硝化效果進(jìn)行直接檢測,并可估測養(yǎng)殖水的亞硝酸鹽含量,它對水產(chǎn)養(yǎng)殖水質(zhì)的監(jiān)控和解決水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中出現(xiàn)的問題有指導(dǎo)意義。

2)本發(fā)明的快速檢測方法,也成為了硝化細(xì)菌菌種篩選和發(fā)酵工藝條件優(yōu)化不可缺少的研究工具。硝化細(xì)菌的硝化效果可以綜合反映硝化細(xì)菌產(chǎn)品的有效菌的數(shù)量和菌種活性兩方面的情況,是最重要的質(zhì)量指標(biāo),利用硝化效果的快速檢測方法可以及時了解研究結(jié)果,它可應(yīng)用于硝化細(xì)菌選育研究的全過程。

附圖說明

圖1為本發(fā)明一種硝化細(xì)菌硝化效果的快速檢測方法的背景技術(shù)中生化反應(yīng)過程;

圖2為本發(fā)明一種硝化細(xì)菌硝化效果的快速檢測方法的實(shí)施例中溫度對硝化效果的影響圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供一種硝化細(xì)菌硝化效果的快速檢測方法,為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及效果更加清楚,明確,以及參照附圖并舉實(shí)例對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)指出此處所描述的具體實(shí)施僅用以解釋本發(fā)明,并不用于限定本發(fā)明。

本發(fā)明的具體檢測方法如下:

1)首先,配置亞硝酸鈉溶液:精確稱取1g分析純亞硝酸鈉nano2,于100ml容量瓶中,加潔凈水到刻度,完全溶解后,可得到2020ppm亞硝基態(tài)氮no2-n標(biāo)準(zhǔn)母液。然后,精確量取1ml標(biāo)準(zhǔn)母液用潔凈水稀釋至1000ml,得到濃度為2.02ppm亞硝態(tài)氮no2-n標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2)配置亞硝酸鹽硝化反應(yīng)體系

使用600ml的礦泉水空瓶若干個,加入2.02ppm亞硝基態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)工作液,每瓶分別裝入100ml、200ml、300ml、400ml、500ml和600ml,形成不同體積梯度的硝化反應(yīng)底物溶液,然后分別加入1ml或1g單位硝化細(xì)菌,組成硝化反應(yīng)液,形成不同梯度硝化反應(yīng)體系。這里,反應(yīng)底物量對菌種的比例,最大比達(dá)到了600,如加菌種為0.5ml或0.5g,最大比可達(dá)到1200,提高了一倍,因此本法的檢測范圍可根據(jù)需要隨意擴(kuò)大或縮小。

3)硝化反應(yīng)

將步驟2中各不同體積梯度的硝化反應(yīng)瓶加蓋震搖,使硝化細(xì)菌溶出分散,與底物溶液混合均勻,然后放入25℃~35℃的恒溫箱,維持恒溫硝化反應(yīng)16~22小時。

4)制備比色試劑

a:格利斯試劑?。悍Q取分析純對氨基苯磺酸0.5g溶于150ml30%冰醋酸,保存于具磨口的棕色瓶中。

b:格利斯試劑ⅱ:稱取分析純α-萘胺0.5g加入50ml蒸餾水中,煮沸至刻度,然后緩緩加入30%冰醋酸溶液15ml,使α-萘胺完全溶解,過濾到具磨口棕色瓶中于0℃~10℃冰箱保存。

5)比色檢測

比色檢測原理:在弱酸性條件下,當(dāng)亞硝酸鹽溶液中的亞硝態(tài)氮與格利斯試劑ⅰ中的對氨基苯磺酸相遇,將產(chǎn)生重氮鹽,形成的重氮鹽再與格利斯試劑ⅱ中的α-萘胺相偶聯(lián),就會產(chǎn)生從淡紅色至玫瑰紅,再至橙棕色的顯色反應(yīng),其中顯玫瑰紅的色度在比色后一定時間內(nèi),與亞硝酸鹽中亞硝態(tài)氮no2-n的含量成正比。本比色的檢驗(yàn)條件對硝酸鹽溶液不顯色,為無色。

比色方法的操作:將上述各瓶硝化反應(yīng)液以及不加硝化細(xì)菌作為對照的硝化反應(yīng)底物溶液,分別加到比色管至25ml刻度,比色時先向每支比色管加入0.5ml格利斯試劑ⅰ,然后加入0.5ml格利斯試劑ⅱ,搖勻,在比色開始后5-8分鐘時間內(nèi)觀察。

比色結(jié)果和硝化效果評估,比色的結(jié)果有下列三種情況:

第一種情況:若加入硝化細(xì)菌的硝化反應(yīng)液瓶對應(yīng)的比色管都顯示玫瑰紅色,且色度與作為對照的硝化反應(yīng)溶液比色管沒有差異,顯示硝化反應(yīng)不產(chǎn)生硝化效果,可確定此硝化細(xì)菌無效,亞硝酸鹽的去除率為0%;

第二種情況:若加入硝化細(xì)菌的硝化反應(yīng)液瓶對應(yīng)的比色管都沒有紅色生成,顯示為無色,即表明此管對應(yīng)瓶中的反應(yīng)液所含的亞硝酸鹽已經(jīng)完全轉(zhuǎn)化為硝酸鹽,亞硝酸鹽的去除率為100%;若在多個顯示為無色的梯度硝化反應(yīng)瓶中,取梯度中最大的無色體積表示硝化效果;

第三種情況:若有的體積梯度硝化反應(yīng)瓶對應(yīng)的比色管還顯紅色,但與對照管的色度相比有明顯差異,僅需對色度最淡、最接近無色的硝化反應(yīng)瓶溶液,采用與對照稀釋液對比檢測的方法確定硝化效果。具體操作過程如下:分別吸取亞硝酸鹽溶液2.5ml或5ml或10ml或15ml或20ml到各比色管,各加水到25ml刻度稀釋,然后把各稀釋后的對照比色管與需要測定硝化反應(yīng)液的比色管同時比色對比,找到色度相同或最接近的兩者,此時即按公式計算出此硝化反應(yīng)比色管對應(yīng)的反應(yīng)瓶中亞硝酸鹽去除率(%),然后再計算出它的等同無色體積(ml)來表示它的硝化效果,計算公式如下:

等同無色體積(ml)=反應(yīng)液體積(ml)x亞硝酸鹽去除率(%)。

取上述中最大無色體積或等同無色體積(ml計)表示此硝化細(xì)菌最高硝化效果

實(shí)施例1

對現(xiàn)場養(yǎng)殖水亞硝基態(tài)氮no2-n含量估測:

首先按制備濃度為2ppm的亞硝基態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)工作液,然后用純凈水逐步進(jìn)行了50%的稀釋,得到2ppm、1ppm、0.5ppm、0.25ppm和0.125ppm5個不同濃度的亞硝基態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)液,比色后可以得到不同亞硝基態(tài)氮濃度的比色管圖譜。

同時,當(dāng)取待檢測的養(yǎng)殖水與上述5個配置的標(biāo)準(zhǔn)工作液同時比色,根據(jù)顯色的對比,可以得知養(yǎng)殖水的濃度在0.5ppm和0.25ppm之間。為進(jìn)一步確定濃度范圍,再把0.5ppm的標(biāo)準(zhǔn)工作液用水稀釋成0.3ppm和0.4ppm的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液,再與養(yǎng)殖水同時比色比較,養(yǎng)殖水比色管的色度十分接近0.4ppm稀釋標(biāo)準(zhǔn)比色管,因而可確定此養(yǎng)殖水的亞硝基態(tài)氮的濃度是0.4ppm。

實(shí)施例2

硝化細(xì)菌對于亞硝基態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)工作液硝化效果的快速檢測試驗(yàn):

使用礦泉水空瓶6個,每瓶分別加入100、200、300、400、500和600ml的2.02ppm的亞硝基態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)工作液,然后向每瓶加入1ml的硝化細(xì)菌,充分混勻,組成硝化反應(yīng)體系,隨即放進(jìn)恒溫箱,調(diào)25℃,靜置,維持22小時,進(jìn)行硝化反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行比色檢測和硝化效果評估,結(jié)果顯示500ml以前各瓶硝化反應(yīng)液在比色后都顯示無色,唯600ml反應(yīng)瓶比色后呈微紅色,此瓶經(jīng)采用標(biāo)準(zhǔn)工作液稀釋管比色法比對檢測,計算確定此瓶的亞硝酸鹽去除率為90%,由此計算它的等同無色體積為600ml×90%=540ml,為本例硝化細(xì)菌硝化反應(yīng)梯度中達(dá)到的最大等同無色體積,硝化效果評定為顯效。

實(shí)施例3

硝化細(xì)菌對待檢測養(yǎng)殖水的硝化效果快速檢測試驗(yàn)

取養(yǎng)殖水,水質(zhì)測定儀測定其亞硝基態(tài)氮為2.95ppm,用硝化細(xì)菌對此養(yǎng)殖水進(jìn)行降亞硝酸鹽效果試驗(yàn):使用礦泉水空瓶6個,分別加入養(yǎng)殖水100ml、200ml、300ml、400ml、500ml和600ml,然后向每瓶加入1g硝化細(xì)菌,充分混勻,組成不同體積梯度硝化反應(yīng)體系。然后放進(jìn)恒溫箱,調(diào)35℃恒溫,靜置,進(jìn)行硝化反應(yīng)達(dá)16小時。比色檢驗(yàn)的結(jié)果顯示:100ml、200ml和300ml的硝化反應(yīng)瓶反應(yīng)液均為無色,400ml的硝化反應(yīng)瓶的反應(yīng)液顯粉紅色,500ml和600ml的硝化反應(yīng)瓶反應(yīng)液顯較深紅色,色度接近對照液,對它不須作進(jìn)一步檢測。僅對400ml采用養(yǎng)殖水稀釋管顯色比對,此瓶反應(yīng)液的亞硝酸鹽的去除率為60%,它的等同無色體積是400mlx60%=240ml,它不是本例最大無色(或等同無色)體積,而是取梯度中300ml反應(yīng)液所顯示的無色結(jié)果為本例的最大無色體積,它的硝化效果評定為有效。

實(shí)施例4

水體溫度對硝化效果影響的試驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)以亞硝酸鈉配成2.02ppm的亞硝基態(tài)氮溶液,取體積分別為100~600ml溶液作為硝化反應(yīng)底物溶液,然后,分別加入1ml硝化細(xì)菌,置于8℃、15℃、20℃、23℃、30℃、35℃,進(jìn)行20h硝化反應(yīng)。通過比色無色顯示獲得了各設(shè)置溫度下最大無色體積,計算每ml硝化菌原露菌種液每小時硝化反應(yīng)可轉(zhuǎn)化亞硝基態(tài)氮的量,以μg/ml·h為單位表示硝化活性。如圖2所示,實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是:10℃以下硝化活性很低,到8℃時每ml菌種每小時只能轉(zhuǎn)化4μg;上升到15℃可轉(zhuǎn)化12μg,較8℃提高3倍;20℃可轉(zhuǎn)化36μg;23℃可轉(zhuǎn)化59μg;在25℃~35℃期間,硝化活性繼續(xù)上升可轉(zhuǎn)化達(dá)到最高值61μg。

結(jié)果表明,水體溫度對硝化細(xì)菌的硝化活性有顯著影響,以25℃~35℃為硝化反應(yīng)的最佳溫度范圍。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式,應(yīng)當(dāng)指出,對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說,在不脫離本發(fā)明原理的前提下,還可以做出若干改進(jìn),這些改進(jìn)也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

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