本發(fā)明涉及一種抗菌素的制備方法，特別涉及一種免疫誘導(dǎo)生物技術(shù)制備廣譜抗菌素的方法。

背景技術(shù)：

抗菌肽(antibacterialpeptides)又稱肽抗生素(peptideantibiotics)或抗微生物(antimicrobialpeptide)，是生物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的一類抵抗外界生物感染源的活性多肽，在昆蟲、植物、動(dòng)物及人體內(nèi)廣泛存在。它除有非特異性的抗細(xì)菌、真菌、病毒、抗感染、抗疾病的作用外，還有抗細(xì)胞變異、抗腫瘤細(xì)胞的作用，且不損害人體正常細(xì)胞，尤其對多重耐藥菌株仍有效?？咕膶Ω锾m氏陽性和陰性細(xì)菌約40余種、綠膿桿菌和副傷寒菌等耐藥性菌株均有較強(qiáng)的殺滅作用?？咕氖钱?dāng)今生物藥物研發(fā)的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。

已有學(xué)者對由青枯病病原菌引起的番茄和辣椒青枯病(bacterialwilt)、由枯萎鐮刀菌引起的香蕉枯萎病(fusariumwilt)等世界性細(xì)菌毀滅性土傳病害進(jìn)行了研究、試驗(yàn)，證明利用抗菌肽，通過拌土、施灌、植株浸根、拌種等方法可對以上病害進(jìn)行有效地防治，尤其在我國兩廣和福建等溫暖潮濕的環(huán)境中，發(fā)病率可減少80％以上。通過生物抗菌肽的廣泛應(yīng)用，可有效地防止、減輕農(nóng)業(yè)病蟲害，減少農(nóng)藥的施用量，降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)投入，確保農(nóng)產(chǎn)品食用安全，實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)增產(chǎn)增收，從而起到事半功倍、綠色環(huán)保的作用。

相關(guān)研究證明：家蠶具有超強(qiáng)的免疫蛋白合成能力，一條蠶，在不到一個(gè)月的生長期中，利用22～25g的桑葉可合成并分泌0.5～1.5g的絲蛋白?，F(xiàn)已有家蠶抗菌肽的相關(guān)研究，如中國專利zl200910116463.3公開了一種誘導(dǎo)家蠶產(chǎn)生抗菌肽的方法，所述該方法是采用病毒或細(xì)菌注射，或者可以采用使家蠶饑餓的方法；采用病毒或細(xì)菌注射時(shí)，給家蠶注射微量的細(xì)菌或病毒，采用使家蠶饑餓的方法時(shí)，對家蠶不喂桑葉，讓其饑餓48小時(shí)，再正常飼養(yǎng)24小時(shí)，該專利所述誘導(dǎo)方法簡單易行，能有效誘導(dǎo)出較多的抗菌肽，使抗菌肽提取效率大為提高；中國專利zl200910193620.0則公開了一種家蠶抗菌肽bmcece及其cdna序列與應(yīng)用，該發(fā)明的家蠶抗菌肽對革蘭 氏陽性菌(蘇云金芽孢桿菌)、以及革蘭氏陰性菌(大腸桿菌、綠膿桿菌、靈菌敗血病菌或青枯菌)均具有抗菌活性、抗菌譜廣，家蠶抗菌肽bmcece可用于人、畜、禽的藥物研發(fā)、預(yù)防和治療由蘇云金芽孢桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、靈菌敗血病菌或青枯菌感染引起人、畜、禽的致病，還可以用于生物產(chǎn)品添加劑的制備，防止由蘇云金芽孢桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、靈菌敗血病菌或青枯菌引起的生物產(chǎn)品的腐敗變質(zhì)。

但目前未見采用免疫誘導(dǎo)生物技術(shù)，利用五齡蠶中部絲腺高量合成絲膠蛋白抗菌肽、在后部絲腺合成絲素蛋白抗菌肽，進(jìn)而通過固相或液相生物技術(shù)合成、擴(kuò)增，制備用于農(nóng)業(yè)抗菌生產(chǎn)的廣譜抗菌素。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種免疫誘導(dǎo)生物技術(shù)制備廣譜抗菌素的方法。

為了解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：一種免疫誘導(dǎo)生物技術(shù)制備廣譜抗菌素的方法，以天然五齡蠶為原材料，通過天然五齡蠶中部絲腺高量合成絲膠蛋白抗菌肽，在后部絲腺合成絲素蛋白抗菌肽，以生物高活性劑對絲蛋白抗菌基因進(jìn)行調(diào)控，以固相或液相生物技術(shù)合成、擴(kuò)增，制得廣譜抗菌素，所述的調(diào)控及固相或液相生物技術(shù)合成、擴(kuò)增的具體步驟為：在天然五齡蠶生長到第三天，在天然五齡蠶中部絲腺1/2處合成絲膠蛋白或天然五齡蠶后部絲腺合成絲素蛋白時(shí)，進(jìn)行免疫誘導(dǎo)，然后在免疫高峰期，將天然五齡蠶蠶體經(jīng)冷凍干燥至水分含量為70％～75％或?qū)⑻烊晃妪g蠶蠶體直接碾磨粉碎后，投入50kg反應(yīng)釜中，并加入占天然五齡蠶蠶體質(zhì)量1/1000的生物高活性劑，在常溫下發(fā)酵6-8天，凍干后，即得到廣譜抗菌素。

本發(fā)明所述的免疫誘導(dǎo)生物技術(shù)制備廣譜抗菌素的方法為下列方法中的一種：

(1)天然五齡蠶生長到第三天，在天然五齡蠶體中部絲腺1/2處合成絲膠蛋白時(shí)，用接種器接種枯草桿菌，進(jìn)行免疫誘導(dǎo)，在免疫高峰期，將天然五齡蠶蠶體冷凍干燥至水分含量為70％～75％，然后將經(jīng)冷凍干燥的天然五齡蠶蠶體投入50kg反應(yīng)釜中，并加入占天然五齡蠶蠶體質(zhì)量1/1000的生物高活性劑，在常溫下發(fā)酵6-8天，凍干后，即得到廣譜抗菌素；

(2)天然五齡蠶生長到第三天，在天然五齡蠶體中部絲腺1/2處合成絲膠蛋白時(shí)，用接種器接種枯草桿菌，進(jìn)行免疫誘導(dǎo)，在免疫高峰期，將天然五齡蠶蠶體直接碾磨粉碎并將粉碎后得到的液體投入50kg反應(yīng)釜中，加入占天然五齡蠶蠶體質(zhì)量1/1000的生物高活性劑，在常溫下發(fā)酵6-8天，凍干后，即得到廣譜抗菌素；

(3)天然五齡蠶生長到第三天，在天然五齡蠶體尾部絲腺處合成絲素蛋白時(shí)，用接種器接種枯草桿菌，進(jìn)行免疫誘導(dǎo)，在免疫高峰期，將天然五齡蠶蠶體冷凍干燥至水分含量70％～75％，將經(jīng)冷凍干燥的天然五齡蠶蠶體投入50kg反應(yīng)釜中，并加入占天然五齡蠶蠶體質(zhì)量1/1000的生物高活性劑，在常溫下發(fā)酵6-8天，凍干后，即得到廣譜抗菌素；

(4)天然五齡蠶生長到第三天，在天然五齡蠶體尾部絲腺處合成絲素蛋白時(shí)，用接種器接種枯草桿菌，進(jìn)行免疫誘導(dǎo)，在免疫高峰期，將天然五齡蠶蠶體直接碾磨粉碎并將粉碎后得到的液體投入50kg反應(yīng)釜中，加入占天然五齡蠶蠶體質(zhì)量1/1000的生物高活性劑，在常溫下發(fā)酵6-8天，凍干后，即得到廣譜抗菌素。

所述免疫誘導(dǎo)方法為：用接種器將枯草桿菌接種到天然五齡蠶蠶體中部絲腺1/2處或接種到天然五齡蠶蠶體尾部絲腺處，接種后3～5日天然五齡蠶蠶體達(dá)到免疫高峰期。

所述生物高活性劑為：生物分裂素，為湛江師范學(xué)院自主知識產(chǎn)權(quán)研究成果生產(chǎn)。

所述凍干的條件為：2-4小時(shí)內(nèi)，將溫度由常溫降到預(yù)凍溫度-20℃，保持-20℃1.5-3小時(shí)，再由-20℃升溫至-5～-8℃，維持2～4小時(shí)，然后用真空泵抽干。

所述廣譜抗菌素為用于農(nóng)業(yè)抗菌生產(chǎn)的生物有機(jī)產(chǎn)品或抗菌生物添加劑。

所述廣譜抗菌素為固體抗菌有機(jī)肥料或液體抗菌有機(jī)肥料。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)的有益效果是：本發(fā)明所述免疫誘導(dǎo)生物技術(shù)合成制備廣譜抗菌素的方法，其生物技術(shù)合成路線簡便易學(xué)，生產(chǎn)成本低廉，產(chǎn)率可控度高，防病害能力高達(dá)95％，且便于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)；采用本發(fā)明方法制備得到的在農(nóng)用時(shí)拌土，栽前浸根，對革蘭氏陽性菌(蘇云金芽孢桿菌)、以及革蘭氏陰性菌(大腸桿菌、綠膿桿菌、靈菌敗血病菌或青枯菌)或是由蘇云金芽孢桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、靈菌敗血病菌或青枯菌、枯草桿菌、青枯病等病原菌、枯萎鐮刀菌引起的感染，具有較強(qiáng)的抗菌作用及高效、廣譜的抗菌優(yōu)勢。

具體實(shí)施方式

下面通過實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，這些實(shí)施例僅用來說明本發(fā)明，并不限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1采用本發(fā)明所述方法，按下列步驟制備一種用于農(nóng)業(yè)抗菌生產(chǎn)的廣譜抗菌素：

(1)抗體菌種：枯草桿菌；生物高活性劑：來源于湛江師范學(xué)院自主知識產(chǎn)權(quán)研究成果生產(chǎn)的生物分裂素；

(2)制備步驟：

①天然五齡蠶生長到第三天，在天然五齡蠶體中部絲腺1/2處合成絲膠蛋白時(shí)，用接種器將枯草桿菌接種到天然五齡蠶蠶體中部絲腺1/2處，免疫誘導(dǎo)，接種后3日天然五齡蠶蠶體達(dá)到免疫高峰期；

②在免疫高峰期，將處于免疫高峰期的天然五齡蠶蠶體冷凍干燥至水分含量為70％，然后將經(jīng)冷凍干燥的天然五齡蠶蠶體投入50kg反應(yīng)釜中，并加入占天然五齡蠶蠶體質(zhì)量1/1000的生物分裂素，在常溫下發(fā)酵7天；

③發(fā)酵結(jié)束，采用下列凍干條件將發(fā)酵后的產(chǎn)物凍干：2小時(shí)常溫降到預(yù)凍溫度-20℃，保持-20℃2.5小時(shí)，再由-20℃升溫至-6℃，維持2小時(shí)，然后用真空泵抽干；

④凍干后即制得用于農(nóng)業(yè)抗菌生產(chǎn)有機(jī)生物農(nóng)藥。

實(shí)施例2采用本發(fā)明所述方法，按下列步驟制備一種用于農(nóng)業(yè)抗菌生產(chǎn)的廣譜抗菌素：

(1)抗體菌種：枯草桿菌；生物高活性劑：來源于湛江師范學(xué)院自主知識產(chǎn)權(quán)研究成果生產(chǎn)的生物分裂素；

(2)制備步驟：

①天然五齡蠶生長到第三天，在天然五齡蠶體中部絲腺1/2處合成絲膠蛋白時(shí)，用接種器將枯草桿菌接種到天然五齡蠶蠶體中部絲腺1/2處，免疫誘導(dǎo)，接種后4日天然五齡蠶蠶體達(dá)到免疫高峰期；

②在免疫高峰期，將處于免疫高峰期的天然五齡蠶蠶體直接碾磨粉碎并將粉碎后得到的液體投入50kg反應(yīng)釜中，加入占天然五齡蠶蠶體質(zhì)量1/1000的生物分裂素，在常溫下發(fā)酵6天；

③發(fā)酵結(jié)束，采用下列凍干條件將發(fā)酵后的產(chǎn)物凍干：2.5小時(shí)常溫降到預(yù)凍溫度-20℃，保持-20℃1.5小時(shí)，再由-20℃升溫至-7℃，維持2.5小時(shí)，然后用真空泵抽干；

④凍干后即制得液態(tài)的用于農(nóng)業(yè)抗菌生產(chǎn)的抗菌生物添加劑。

實(shí)施例3采用本發(fā)明所述方法，按下列步驟制備一種用于農(nóng)業(yè)抗菌生產(chǎn)的廣譜抗 菌素：

(1)目標(biāo)抗體菌種：枯草桿菌；生物高活性劑：來源于湛江師范學(xué)院自主知識產(chǎn)權(quán)研究成果生產(chǎn)的生物分裂素；

(2)制備步驟：

①天然五齡蠶生長到第三天，在天然五齡蠶體尾部絲腺處合成絲素蛋白時(shí)，用接種器將枯草桿菌接種到天然五齡蠶蠶體尾部絲腺處，免疫誘導(dǎo)，接種后5日天然五齡蠶蠶體達(dá)到免疫高峰期；

②在免疫高峰期，將處于免疫高峰期的天然五齡蠶蠶體冷凍干燥至水分含量為75％，然后將經(jīng)冷凍干燥的天然五齡蠶蠶體投入50kg反應(yīng)釜中，并加入占天然五齡蠶蠶體質(zhì)量1/1000的生物分裂素，在常溫下發(fā)酵8天；

③發(fā)酵結(jié)束，采用下列凍干條件將發(fā)酵后的產(chǎn)物凍干：4小時(shí)常溫降到預(yù)凍溫度-20℃，保持-20℃2小時(shí)，再由-20℃升溫至-5℃，維持4小時(shí)，然后用真空泵抽干；

④凍干后產(chǎn)品即為固體抗菌有機(jī)肥料成品，分裝后用于農(nóng)業(yè)抗菌生產(chǎn)。

實(shí)施例4采用本發(fā)明所述方法，按下列步驟制備一種用于農(nóng)業(yè)抗菌生產(chǎn)的廣譜抗菌素：

(1)抗體菌種：枯草桿菌；生物高活性劑：來源于湛江師范學(xué)院自主知識產(chǎn)權(quán)研究成果生產(chǎn)的生物分裂素；

(2)制備步驟：

①天然五齡蠶生長到第三天，在天然五齡蠶體尾部絲腺處合成絲素蛋白時(shí)，用接種器將枯草桿菌接種到天然五齡蠶蠶體尾部絲腺處，免疫誘導(dǎo)，接種后3日天然五齡蠶蠶體達(dá)到免疫高峰期；

②在免疫高峰期，將處于免疫高峰期的天然五齡蠶蠶體直接碾磨粉碎并將粉碎后得到的液體投入50kg反應(yīng)釜中，加入占天然五齡蠶蠶體質(zhì)量1/1000的生物分裂素，在常溫下發(fā)酵7天；

③發(fā)酵結(jié)束，采用下列凍干條件將發(fā)酵后的產(chǎn)物凍干：3小時(shí)常溫降到預(yù)凍溫度-20℃，保持-20℃3小時(shí)，再由-20℃升溫至-8℃，維持3小時(shí)，然后用真空泵抽干；

④凍干后產(chǎn)品即為液體抗菌有機(jī)肥料成品，分裝后用于農(nóng)業(yè)抗菌生產(chǎn)。