本發(fā)明涉及食品加工技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種薯類活性肽及其制備方法。
背景技術(shù)：
我國是薯類種植和生產(chǎn)大國，年產(chǎn)量居世界首位。薯類是列于稻谷、玉米、小麥之后的第四大主要糧食作物。在我國工業(yè)上，薯類主要被用于生產(chǎn)淀粉，在此過程中會(huì)產(chǎn)生大量薯漿。以甘薯為例，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國每年約有900萬噸甘薯用于加工淀粉，由此可產(chǎn)生薯漿約2000萬噸，其中約含甘薯蛋白12萬噸，按我國人均日消耗75克蛋白計(jì)，能滿足430多萬人對(duì)蛋白質(zhì)的年需求，然而薯漿往往被當(dāng)作廢液直接排放，造成了嚴(yán)重環(huán)境污染和巨大資源浪費(fèi)。與大多數(shù)其它植物蛋白相比，薯類蛋白必需氨基酸含量較高，具有可接受的營養(yǎng)價(jià)值，是植物源活性肽的潛在來源。
高靜壓處理技術(shù)在過去二十年經(jīng)歷了巨大的增長(zhǎng)，在食品工業(yè)中的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用成為現(xiàn)實(shí)，如食品保鮮和新型食品、質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味的創(chuàng)造等。高靜壓技術(shù)作用于蛋白溶液時(shí)可以使蛋白鏈變得更加伸展，進(jìn)而暴露更多的酶切位點(diǎn)而有利于酶解反應(yīng)的進(jìn)行，還可能產(chǎn)生一些新的具有特殊生理活性的功能性肽。食物源生物活性肽具有分子量低、活性高、易吸收等特點(diǎn)，被認(rèn)為是安全和健康的。更重要的是，食物源生物活性肽還呈現(xiàn)良好的營養(yǎng)和功能特性。
因此，開發(fā)一種薯類活性肽并建立其制備方法，對(duì)于促進(jìn)我國薯類加工業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，保障我國糧食安全和改善居民膳食營養(yǎng)具有重要意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種薯類活性肽及其制備方法。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種薯類活性肽及其制備方法，包括如下步驟：
(1)采用超聲波協(xié)同高壓均質(zhì)方法對(duì)薯類蛋白進(jìn)行處理；
(2)高靜壓下酶解薯類蛋白，再經(jīng)滅酶、離心、除鹽、干燥后，即得薯類活性肽。
本發(fā)明所述的薯類活性肽的制備方法中，所述薯類為馬鈴薯、甘薯、木薯，優(yōu)選為馬鈴薯和甘薯。所述薯類蛋白的制備方法如下：以薯類為原料，清洗、去皮后切塊，按料液比1:1加入0.2％-0.5％檸檬酸水溶液(含vc濃度為0.01％-0.1％)后打漿，過濾除渣、離心去除淀粉、超濾濃縮后凍干，即得薯類蛋白。
本發(fā)明所述的薯類活性肽的制備方法中，超聲波功率為50-400w，優(yōu)選為200w；所述超聲波時(shí)間為1-10min，優(yōu)選5min。
本發(fā)明所述的活性肽的制備方法中，步驟(1)高壓均質(zhì)壓力為10-150mpa，優(yōu)選為120mpa；所述高壓均質(zhì)時(shí)間為0.5-10min，優(yōu)選1min。
步驟(1)中，對(duì)薯類蛋白進(jìn)行均質(zhì)處理前，將薯類蛋白按g：ml＝1：20-100的比例溶解于ph值7-9的tris-hcl緩沖液中。
本發(fā)明所述的活性肽的制備方法的步驟(2)中，酶解采用堿性蛋白酶alcalase，酶解時(shí)將堿性蛋白酶alcalase與薯類蛋白按g：ml＝1：10-50的比例混合。在50-60℃酶解30-240min，優(yōu)選酶解溫度為57℃。
本發(fā)明所述的活性肽的制備方法步驟(2)中，高靜壓加壓壓力為100-600mpa，優(yōu)選300mpa；高靜壓加壓時(shí)間為30-240min，優(yōu)選120min。
作為本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式之一，本發(fā)明所述的活性肽的制備方法，包括如下步驟：
將薯類蛋白按g：ml＝1：20-100的比例溶解于ph值7-9的tris-hcl緩沖液中，采用50-400w超聲波處理薯類蛋白1-10min，然后于10-150mpa下高壓均質(zhì)處理薯類蛋白0.5-10min，將堿性蛋白酶alcalase與薯類蛋白按g：ml＝1：10-50的比例混合，封裝后置后100-600mpa高靜壓下，于50-60℃酶解30-240min，取出后于90-100℃滅酶10min，于7000-10000g下離心60min，除鹽、干燥后，即得薯類活性肽。
本發(fā)明還提供一種由上述方法制備的薯類活性肽。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明上述方法制得的薯類活性肽在制備食品或化妝品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
1)本發(fā)明所制備的活性肽抗氧化活性高、分子量低，易被人體吸收利用。
2)本發(fā)明提供的活性肽必需氨基酸含量豐富，且具有保健功效；
3)本發(fā)明提供的活性肽，克服現(xiàn)有蛋白肽活性低、穩(wěn)定性差的缺陷，可廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域中，有利于改善居民膳食營養(yǎng)與健康。
4)本發(fā)明提供的活性肽的制備方法操作簡(jiǎn)單，易于工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
本發(fā)明中涉及到的百分號(hào)“％”，若未特別說明，是指質(zhì)量百分比；但溶液的百分比，除另有規(guī)定外，是指100ml溶液中含有溶質(zhì)的克數(shù)。
實(shí)施例1薯類活性肽的制備(1)
以甘薯為原料，清洗、去皮后切塊，按料液比1:1加入0.2％檸檬酸水溶液(含vc濃度為0.1％)后打漿，過濾除渣、離心去除淀粉、超濾濃縮后凍干得到甘薯蛋白。將甘薯蛋白按g：ml＝1：30的比例溶解于ph值8.3的tris-hcl緩沖液中，采用200w超聲波處理甘薯蛋白5min，然后于120mpa下高壓均質(zhì)處理甘薯蛋白1min，將堿性蛋白酶alcalase與甘薯蛋白按g：ml＝1：25的比例混合，封裝后置后300mpa高靜壓下，于57℃酶解120min，取出后于100℃滅酶10min，于10000g下離心60min，除鹽、干燥后，即得甘薯肽。
實(shí)施例2薯類活性肽的制備(2)
以甘薯為原料，清洗、去皮后切塊，按料液比1:1加入0.3％檸檬酸水溶液(含vc濃度為0.05％)后打漿，過濾除渣、離心去除淀粉、超濾濃縮后凍干得到甘薯蛋白。將甘薯蛋白按g：ml＝1：25的比例溶解于ph值8.0的tris-hcl緩沖液中，采用400w超聲波處理甘薯蛋白3min，然后于100mpa下高壓均質(zhì)處理甘薯蛋白2min，將堿性蛋白酶alcalase與甘薯蛋白按g：ml＝1：25的比例混合，封裝后置后300mpa高靜壓下，于57℃酶解120min，取出后于100℃滅酶10min，于10000g下離心60min，除鹽、干燥后，即得甘薯肽。
實(shí)施例3薯類活性肽的制備(3)
以甘薯為原料，清洗、去皮后切塊，按料液比1:1加入0.25％檸檬酸水溶液(含vc濃度為0.02％)后打漿，過濾除渣、離心去除淀粉、超濾濃縮后凍干得到甘薯蛋白。將甘薯蛋白按g：ml＝1：35的比例溶解于ph值8.2的tris-hcl緩沖液中，采用100w超聲波處理甘薯蛋白8min，然后于150mpa下高壓均質(zhì)處理甘薯蛋白0.5min，將堿性蛋白酶alcalase與甘薯蛋白按g：ml＝1：25的比例混合，封裝后置后300mpa高靜壓下，于57℃酶解120min，取出后于100℃滅酶10min，于10000g下離心60min，除鹽、干燥后，即得甘薯肽。
實(shí)施例4薯類活性肽的制備(4)
以甘薯為原料，清洗、去皮后切塊，按料液比1:1加入0.45％檸檬酸水溶液(含vc濃度為0.05％)后打漿，過濾除渣、離心去除淀粉、超濾濃縮后凍干得到甘薯蛋白。將甘薯蛋白按g：ml＝1：30的比例溶解于ph值8.3的tris-hcl緩沖液中，采用200w超聲波處理甘薯蛋白5min，然后于120mpa下高壓均質(zhì)處理甘薯蛋白1min，將堿性蛋白酶alcalase與甘薯蛋白按g：ml＝1：30的比例混合，封裝后置后200mpa高靜壓下，于56℃酶解150min，取出后于90℃滅酶10min，于10000g下離心60min，除鹽、干燥后，即得甘薯肽。
實(shí)施例5薯類活性肽的制備(5)
以甘薯為原料，清洗、去皮后切塊，按料液比1:1加入0.3％檸檬酸水溶液(含vc濃度為0.03％)后打漿，過濾除渣、離心去除淀粉、超濾濃縮后凍干得到甘薯蛋白。將甘薯蛋白按g：ml＝1：30的比例溶解于ph值8.3的tris-hcl緩沖液中，采用200w超聲波處理甘薯蛋白5min，然后于120mpa下高壓均質(zhì)處理甘薯蛋白1min，將堿性蛋白酶alcalase與甘薯蛋白按g：ml＝1：35的比例混合，封裝后置后100mpa高靜壓下，于55℃酶解240min，取出后于90℃滅酶10min，于9000g下離心60min，除鹽、干燥后，即得甘薯肽。
實(shí)施例6薯類活性肽的制備(6)
以甘薯為原料，清洗、去皮后切塊，按料液比1:1加入0.25％檸檬酸水溶液(含vc濃度為0.01％)后打漿，過濾除渣、離心去除淀粉、超濾濃縮后凍干得到甘薯蛋白。將甘薯蛋白按g：ml＝1：30的比例溶解于ph值8.3的tris-hcl緩沖液中，采用200w超聲波處理甘薯蛋白5min，然后于10mpa下高壓均質(zhì)處理甘薯蛋白1min，將堿性蛋白酶alcalase與甘薯蛋白按g：ml＝1：40的比例混合，封裝后置后100mpa高靜壓下，于57℃酶解240min，取出后于90℃滅酶10min，于8000g下離心60min，除鹽、干燥后，即得甘薯肽。
對(duì)比例1
以甘薯為原料，清洗、去皮后切塊，按料液比1:1加入0.2％檸檬酸水溶液(含vc濃度為0.1％)后打漿，過濾除渣、離心去除淀粉、超濾濃縮后凍干得到甘薯蛋白。將甘薯蛋白按g：ml＝1：30的比例溶解于ph值8.3的tris-hcl緩沖液中，將堿性蛋白酶alcalase與甘薯蛋白按g：ml＝1：25的比例混合，封裝后置后300mpa高靜壓下，于57℃酶解120min，取出后于100℃滅酶10min，于10000g下離心60min，除鹽、干燥后，即得甘薯肽。
對(duì)比例2
以甘薯為原料，清洗、去皮后切塊，按料液比1:1加入0.2％檸檬酸水溶液(含vc濃度為0.1％)后打漿，過濾除渣、離心去除淀粉、超濾濃縮后凍干得到甘薯蛋白。將甘薯蛋白按g：ml＝1：30的比例溶解于ph值8.3的tris-hcl緩沖液中，采用200w超聲波處理甘薯蛋白5min，將堿性蛋白酶alcalase與甘薯蛋白按g：ml＝1：30的比例混合，于56℃酶解150min，取出后于90℃滅酶10min，于10000g下離心60min，除鹽、干燥后，即得甘薯肽。
對(duì)比例3
以甘薯為原料，清洗、去皮后切塊，按料液比1:1加入0.2％檸檬酸水溶液(含vc濃度為0.1％)后打漿，過濾除渣、離心去除淀粉、超濾濃縮后凍干得到甘薯蛋白。將甘薯蛋白按g：ml＝1：30的比例溶解于ph值8.3的tris-hcl緩沖液中，于120mpa下高壓均質(zhì)處理甘薯蛋白1min，將堿性蛋白酶alcalase與甘薯蛋白按g：ml＝1：35的比例混合，于55℃酶解240min，取出后于90℃滅酶10min，于9000g下離心60min，除鹽、干燥后，即得甘薯肽。
對(duì)比例4
以甘薯為原料，清洗、去皮后切塊，按料液比1:1加入0.2％檸檬酸水溶液(含vc濃度為0.1％)后打漿，過濾除渣、離心去除淀粉、超濾濃縮后凍干得到甘薯蛋白。將甘薯蛋白按g：ml＝1：30的比例溶解于ph值7.5的tris-hcl緩沖液中，將堿性蛋白酶alcalase與甘薯蛋白按g：ml＝1：25的比例混合，于50℃酶解60min，取出后于100℃滅酶10min，于10000g下離心60min，除鹽、干燥后，即得甘薯肽。
實(shí)驗(yàn)例1
對(duì)實(shí)施例及對(duì)比例中活性肽的水解度、羥基自由基清除活性、fe2+螯合力、總抗氧化能力、氨基酸組成等進(jìn)行分析：
(1)水解度
采用鄰苯二甲醛法進(jìn)行。水解度的計(jì)算公式如下：
h＝(serinenh2-β)/αmmol/g蛋白
其中，h相當(dāng)于水解肽鍵的氨基基團(tuán)的數(shù)量，表示為絲氨酸的氨基毫摩數(shù)。α和β分別為1.00和0.40。
水解度(％)＝h/htot×100
其中，htot為單位蛋白當(dāng)量的肽鍵總數(shù)。對(duì)于大多數(shù)蛋白質(zhì)分子來說，htot約為8g/kg蛋白。結(jié)果見表1。
(2)羥基自由基清除活性
采用α-脫氧核糖氧化法。將活性肽溶于蒸餾水中，配成濃度為1mg/ml的溶液。將0.1ml10mmfeso4·7h2o、0.9ml0.1m的磷酸緩沖液(ph7.4)、0.5ml10mmα-脫氧核糖、0.1ml10mmedta和0.2ml樣品溶液在試管中充分混勻。添加0.2ml10mmh2o2后啟動(dòng)反應(yīng)，置于37℃浴中反應(yīng)1h。反應(yīng)結(jié)束，添加1.0ml冰溫的2.8％tca終止反應(yīng)，隨后加入1ml1％tba(50mmnaoh)混勻，沸水浴20min顯色，冷卻后于532nm測(cè)吸光值?！h清除率(％)計(jì)算如下：
羥基自由基清除率(％)＝【(a0－a1)/a0】×100
其中：a0為空白對(duì)照的吸光值；a1為樣品反應(yīng)后的吸光值。結(jié)果見表1。
(3)fe2+螯合力
將活性肽溶于蒸餾水中，配成濃度為1mg/ml的溶液。反應(yīng)混合物包括45μl2mmfecl2、450μl樣品和1815μl蒸餾水。劇烈震蕩混合物，然后于室溫下放置30min。30min后，加入90μl5mm4,4'-[3-(2-吡啶基)-1,2,4-三嗪-5,6-二基]二苯磺酸一鈉鹽(ferrozine)混勻。在562nm下測(cè)定fe2+-ferrozine復(fù)合物的吸光值。用蒸餾水作空白。fe2+螯合能力(％)計(jì)算如下：
fe2+螯合力(％)＝【(a0－a1)/a0】×100
其中：a0為空白對(duì)照的吸光值；a1為樣品反應(yīng)后的吸光值。結(jié)果見表1。
(4)總抗氧化能力
采用氧自由基吸收能力法(orac)測(cè)定活性肽對(duì)過氧自由基的清除活性。所有溶液均用75mmol/l，ph＝7.4磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行配置和稀釋。96微孔板中加入20μl待測(cè)樣品(濃度為1mg/ml)、20μl磷酸鹽緩沖溶液、20μl63nmol/l的熒光素鈉溶液，37℃保溫10min后，立即加入140μl18.28mmol/l的aaph溶液，置于多功能酶標(biāo)儀中，在激發(fā)波長(zhǎng)485nm和發(fā)射波長(zhǎng)535nm下測(cè)定熒光值，時(shí)間間隔設(shè)為2.0min，測(cè)定次數(shù)為60次，測(cè)定溫度為37℃。同時(shí)測(cè)定各反應(yīng)溶液在無aaph作用時(shí)的熒光值(即用等量的磷酸鹽緩沖溶液代替aaph溶液)以水溶性維生素e作為標(biāo)準(zhǔn)品，樣品溶液的氧自由基吸收能力表示為μg水溶性維生素e當(dāng)量(troloxequivalent,te)/ml樣品溶液。結(jié)果見表1。
(5)氨基酸組成分析
利用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定活性肽的氨基酸組成，具體為：稱取75mg甘薯肽，用10ml6mhcl于110℃下酶解24h。水解完畢后，將混合液倒入50ml容量瓶中，用超純水定容，取1ml水解液氮吹至干。將干燥樣品溶解于ph值為2.2的檸檬酸鈉緩沖液中，調(diào)節(jié)氨基酸濃度為50-250nmol/ml，然后上樣至日立l-8800氨基酸分析儀進(jìn)行氨基酸測(cè)定。結(jié)果見表1。
表1活性肽的抗氧化活性及氨基酸組成分析
從表1可以看出，所有實(shí)施例和對(duì)比例制備的薯類活性肽均具有一定的抗氧化活性，必需氨基酸占總必需氨基酸比例均大于40％，必需氨基酸與非必需氨基酸比值均高于60％，明顯高于fao/who推薦的參考模式。
與對(duì)比例1相比，實(shí)施例1、2和3活性肽的水解度、羥基自由基清除活性、fe2+螯合力和總抗氧化能力顯著提高；實(shí)施例4和實(shí)施例5活性肽的水解度、羥基自由基清除活性、fe2+螯合力和總抗氧化能力顯著高于對(duì)比例2與對(duì)比例3活性肽。
與實(shí)施例5活性肽相比，實(shí)施例6活性肽的水解度、羥基自由基清除活性、fe2+螯合力和總抗氧化能力略低；而對(duì)比例4活性肽的水解度、羥基自由基清除活性、fe2+螯合力和總抗氧化能力在上述所有活性肽中最低。
實(shí)驗(yàn)例2
對(duì)各實(shí)施例及對(duì)比例中活性肽的分子量分布進(jìn)行分析：
取一定量活性肽溶于含0.5m氯化鈉的50mm磷酸鹽溶液(ph7.0)，經(jīng)過0.22μm膜過濾后，采用配置有superdexpeptide10/300gl柱子(10×300mm)的lc-20ahplc(日本島津公司，京都，日本)進(jìn)行分子量分布測(cè)定。洗脫液含0.5m氯化鈉的50mm磷酸鹽溶液(ph7.0)，流速為0.5ml/min。在215nm處測(cè)定吸光值。分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線采用細(xì)胞色素c(12384da)、抑肽酶(6512da)、維生素b12(1855da)和甘氨酸(75da)進(jìn)行。結(jié)果見表2。
表2活性肽的分子量分布(％)
從表2可以看出，與對(duì)比例1相比，實(shí)施例1、2和3活性肽中<3kda肽組分的含量顯著提高；實(shí)施例4和實(shí)施例5活性肽中<3kda肽組分的含量顯著高于對(duì)比例2與對(duì)比例3活性肽。與實(shí)施例5活性肽相比，實(shí)施例6活性肽中<3kda肽組分的含量略低；而對(duì)比例4活性肽中<3kda肽組分的含量在上述所有活性肽中最低。
雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。