本發(fā)明屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種白蛤多肽及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著社會(huì)人口老齡化加劇，與衰老相關(guān)的神經(jīng)變性病在世界范圍內(nèi)發(fā)病也呈逐年上升趨勢(shì)，患病人數(shù)逐年增多，其臨床表現(xiàn)主要分為兩種：運(yùn)動(dòng)功能障礙和記憶與認(rèn)知功能障礙。組織病理學(xué)研究表明神經(jīng)元緩慢漸進(jìn)性凋亡，大多在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)存在蛋白質(zhì)的異常聚集，形成包涵體，提示它們可能具有相類似的發(fā)病機(jī)制。因此，積極尋找具有緩解細(xì)胞凋亡老化、抑制神經(jīng)毒性蛋白異常聚集作用的生物活性物質(zhì)，將為衰老相關(guān)神經(jīng)變性疾病的防治提供一定的物質(zhì)基礎(chǔ)。

我國(guó)海洋面積遼闊，海產(chǎn)品類資源豐富。其中，魚貝類等水產(chǎn)食品不僅是人類蛋白質(zhì)的重要來(lái)源，而且也顯現(xiàn)出多種保健和疾病防治功能，對(duì)促進(jìn)人類健康有很重要作用。貝類性平、味甘、咸，具有滋陰補(bǔ)腎、調(diào)中的功效。《本草從新》記載著貝肉下氣調(diào)中、利五臟、療消渴的功效。其中，白蛤，學(xué)名為四角蛤蜊(mactraveneriformis,reeue)，俗稱白蜆子、泥蜆子、布鴿頭，屬瓣鰓綱、真瓣鰓目、蛤蜊科。白蛤是我國(guó)沿海常見(jiàn)的底棲經(jīng)濟(jì)貝類，其肉細(xì)味美、營(yíng)養(yǎng)豐富。中醫(yī)認(rèn)為其肉性味咸寒，有滋陰、利水、化痰、軟堅(jiān)功能，可用于治療水腫、痰積、癖塊、癖瘤、崩漏、痔瘡等。每百克白蛤的鮮肉中含蛋白質(zhì)10.8克，其中包含了9種人體必需氨基酸，且比例適中，屬完全蛋白質(zhì)。然而，國(guó)內(nèi)外有關(guān)白蛤的研究大多集中在對(duì)其生長(zhǎng)環(huán)境、養(yǎng)殖繁育、食品加工、種屬鑒定上，也有部分對(duì)其小分子提取物和多糖類物質(zhì)在降血糖、抗凝血等方面的研究，而有關(guān)白蛤多肽在生物活性方面的研究報(bào)道則較少，具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種具有抗氧化和神經(jīng)保護(hù)功能的白蛤多肽及其制備方法與應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案。

一種白蛤多肽的制備方法，取白蛤軟體加水勻漿后加入木瓜蛋白酶水解，超濾后收集截留分子量小于10kda的組分。

其中，所述白蛤軟體為新鮮的白蛤去殼后和內(nèi)臟后用水清洗3～4次得到。

在一些實(shí)施方案中，所述勻漿時(shí)水的加入量為白蛤軟體的體積的2倍。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述白蛤多肽的制備方法中，所述木瓜蛋白酶水解前還包括將勻漿后得到的肉糜干燥后加水重溶的步驟。

其中，所述肉糜干燥后的重溶時(shí)水的加入量為干燥的肉糜的體積的20倍。

本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以按照公知的干燥的方法對(duì)白蛤軟體勻漿后得到的肉糜進(jìn)行干燥。優(yōu)選采用冷凍干燥。

在一些實(shí)施方案中，所述木瓜蛋白酶水解具體為調(diào)節(jié)ph至6.0，加入木瓜蛋白酶50～80℃水解4～10小時(shí)，滅酶。

在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述木瓜蛋白酶水解溫度為60℃以下，所述水解時(shí)間6h。

進(jìn)一步的，作為優(yōu)選，所述木瓜蛋白酶每毫升的酶活力為30000u。

作為優(yōu)選，所述木瓜蛋白酶水解時(shí)木瓜蛋白酶的加入量為所述木瓜蛋白酶與底物的體積比為1:400。

本發(fā)明所述制備方法超濾后收集截留分子量小于10kda的組分。其中，所述超濾經(jīng)0.45μm水系微孔膜過(guò)濾，收集到的濾液再經(jīng)10kda的超濾膜截留。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述白蛤多肽的制備方法中，所述超濾前還包括酶解液干燥后加水重溶的步驟。

其中，所述酶解液干燥后的重溶優(yōu)選為配制成濃度為20mg/ml的溶液。

本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以按照公知的干燥的方法對(duì)木瓜蛋白酶酶解液進(jìn)行干燥。優(yōu)選采用冷凍干燥。

本發(fā)明還提供了上述制備方法制得的白蛤多肽。

百草枯，學(xué)名甲基紫精，是一種強(qiáng)氧化劑，可誘導(dǎo)體內(nèi)活性氧自由基(ros)的大量產(chǎn)生，而常被用作秀麗線蟲氧化損傷造模的化學(xué)試劑。本實(shí)施例中以80mm的百草枯溶液誘導(dǎo)秀麗線蟲急劇死亡，來(lái)建立秀麗線蟲的百草枯急性氧化損傷模型，用于評(píng)估本發(fā)明所述白蛤多肽的體內(nèi)抗氧化能力的強(qiáng)弱。本發(fā)明將所述白蛤多肽加入到成蟲初期的野生型秀麗線蟲中培養(yǎng)，加入百草枯對(duì)秀麗線蟲進(jìn)行氧化脅迫造模，定時(shí)統(tǒng)計(jì)秀麗線蟲存活的比率，檢測(cè)所述白蛤多肽對(duì)百草枯誘導(dǎo)的氧化脅迫的影響，結(jié)果顯示本發(fā)明所述白蛤多肽可以顯著提高秀麗線蟲在急性氧化脅迫條件下的存活率。表明本發(fā)明所述白蛤多肽具有較好的體內(nèi)抗氧化能力。

無(wú)熒光的dcfh-da探針可被體內(nèi)的ros氧化為呈現(xiàn)綠色熒光的產(chǎn)物dcf，通過(guò)檢測(cè)某一時(shí)間點(diǎn)dcf的熒光強(qiáng)度可以間接反映樣本中ros的相對(duì)含量。本發(fā)明將所述白蛤多肽加入到成蟲初期的野生型秀麗線蟲中培養(yǎng)一定時(shí)間后，勻漿、離心收集上清液，加入dcfh-da探針進(jìn)行熒光強(qiáng)度檢測(cè)，檢測(cè)所述白蛤多肽對(duì)秀麗線蟲體內(nèi)ros水平的影響，結(jié)果顯示，經(jīng)本發(fā)明所述白蛤多肽飼喂后，秀麗線蟲體內(nèi)ros水平較對(duì)照組有一定程度的下降。表明本發(fā)明所述白蛤多肽能夠促進(jìn)體內(nèi)ros的清除而發(fā)揮抗氧化能力。

超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，sod)是生物體內(nèi)一種重要的抗氧化酶，能催化超氧化物陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)，生成過(guò)氧化氫(h2o2)和氧氣(o2)，減少相關(guān)自由基對(duì)機(jī)體的氧化損傷。本發(fā)明將所述白蛤多肽加入到成蟲初期的野生型秀麗線蟲中培養(yǎng)一定時(shí)間后，勻漿、離心收集上清液，測(cè)定秀麗線蟲勻漿上清液中總蛋白含量和sod活力。結(jié)果顯示，本發(fā)明所述白蛤多肽能顯著地提高秀麗線蟲體內(nèi)抗氧化酶sod的活力，從而增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力。

本發(fā)明還選擇了以哺乳細(xì)胞為模型，評(píng)估白蛤多肽的抗氧化能力。本發(fā)明利用h2o2對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞sh-sy5y進(jìn)行氧化損傷造模，然后將所述白蛤多肽按100、500、1000μg/ml的濃度加入細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，mtt比色法計(jì)算細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示，本發(fā)明所述白蛤多肽可顯著地緩解雙氧水對(duì)sh-sy5y細(xì)胞產(chǎn)生的損傷，具有較好的抗氧化作用。

因此，本發(fā)明提供了所述白蛤多肽在制備抗氧化的藥物中的應(yīng)用。

在較高溫度誘導(dǎo)下，cl2355轉(zhuǎn)基因型的秀麗線蟲可泛神經(jīng)表達(dá)人aβ1-42毒性蛋白(與阿爾茲海默病的發(fā)病機(jī)制相關(guān))，引起毒性蛋白的聚集，從而導(dǎo)致其化學(xué)感知神經(jīng)元受到損傷，顯現(xiàn)出對(duì)化學(xué)引誘劑的敏感性(即趨化性)下降的表型。本發(fā)明用所述白蛤多肽處理cl2355秀麗線蟲，通過(guò)檢測(cè)線蟲上述表型的緩解狀況，可評(píng)估白蛤多肽對(duì)毒性蛋白的聚集的影響。結(jié)果顯示本發(fā)明所述白蛤多肽可以緩解aβ聚集引起的神經(jīng)毒性。

ha759轉(zhuǎn)基因秀麗線蟲可在其頭部ash、asi和尾部pha、phb四類神經(jīng)元中表達(dá)htnq150(人源亨廷頓蛋白中含150個(gè)殘基的多聚谷氨酰胺片段polyq)，在線蟲生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程中，polyq聚集產(chǎn)生神經(jīng)毒性，損傷ash神經(jīng)元，導(dǎo)致其對(duì)高滲環(huán)境感知能力和回避行為喪失，因此檢測(cè)該模型的對(duì)高滲條件的避化行為可作為評(píng)估ash神經(jīng)元功能的一種手段。本發(fā)明用所述白蛤多肽處理ha759秀麗線蟲，通過(guò)檢測(cè)線蟲對(duì)不利的高滲條件的回避行為，評(píng)估白蛤多肽對(duì)ash神經(jīng)元功能的影響。結(jié)果顯示經(jīng)白蛤多肽給藥處理后，秀麗線蟲ha759對(duì)不利的高滲條件的回避行為有改善。表明本發(fā)明所述白蛤多肽可以緩解polyq聚集引起的神經(jīng)毒性。

因此，本發(fā)明提供了所述白蛤多肽在制備神經(jīng)保護(hù)的藥物中的應(yīng)用。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可將本發(fā)明所述白蛤多肽直接或間接加入制備不同劑型時(shí)所需的藥學(xué)上可接受的各種常用輔料，如填充劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、粘合劑等，以常規(guī)藥物制劑方法，制成常用制劑如片劑、膠囊劑、注射液、口服液、顆粒劑、丸劑、散劑和滴丸劑等。其中，填充劑如淀粉，乳糖，蔗糖，葡萄糖，甘露醇和硅酸；崩解劑如瓊脂，碳酸鈣，土豆淀粉或木薯淀粉，海藻酸，某些硅酸鹽和碳酸鈉，低取代羥丙基纖維素；潤(rùn)滑劑如滑石粉，硬脂酸鈣，硬脂酸鎂，固體聚乙二醇，月桂硫酸鈉；粘合劑如羧甲基纖維素，藻酸鹽，明膠，聚乙烯吡咯酮，蔗糖和阿拉伯膠。

本發(fā)明所述白蛤多肽還可以制備成抗氧化和神經(jīng)保護(hù)的保健品。

由上述技術(shù)方案可知，本發(fā)明提供了一種白蛤多肽及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明所述白蛤多肽的制備方法為取白蛤軟體加水勻漿后加入木瓜蛋白酶水解，超濾后收集截留分子量小于10kda的組分。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明所述制備方法制得的白蛤多肽具有很好的抗氧化和神經(jīng)保護(hù)作用，可以用于制備成 抗氧化和神經(jīng)保護(hù)藥物或者抗氧化和神經(jīng)保護(hù)保健品，應(yīng)用范圍廣泛，具有良好的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效應(yīng)。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。

圖1示實(shí)施例2抗百草枯誘導(dǎo)的氧化脅迫實(shí)驗(yàn)中實(shí)施例1制備的白蛤多肽對(duì)秀麗線蟲存活率影響的生存曲線；

圖2示實(shí)施例3活性氧(ros)水平的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中飼喂不同濃度實(shí)施例1制備的白蛤多肽后秀麗線蟲體內(nèi)dcf熒光密度圖；

圖3示實(shí)施例4sod酶活的測(cè)定實(shí)驗(yàn)中飼喂不同濃度實(shí)施例1制備的白蛤多肽后對(duì)秀麗線蟲體內(nèi)sod活力的影響圖；

圖4示實(shí)施例5哺乳動(dòng)物細(xì)胞模型上的抗氧化能力實(shí)驗(yàn)中不同濃度實(shí)施例1制備的白蛤多肽對(duì)h2o2誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞sh-sy5y氧化損傷模型的作用效果圖；

圖5示實(shí)施例6趨化試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)中不同濃度實(shí)施例1制備的白蛤多肽處理cl2355秀麗線蟲對(duì)其趨化能力的影響圖；

圖6示實(shí)施例7避化試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)中不同濃度實(shí)施例1制備的白蛤多肽處理ha759秀麗線蟲對(duì)其回避能力的影響圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)闡述。

實(shí)施例1、白蛤多肽的制備

新鮮的白蛤進(jìn)行去殼取肉處理，用水先后清洗3～4次，洗凈泥沙后，取其軟體組織加入2倍體積的三級(jí)水進(jìn)行勻漿，得到肉糜經(jīng)冷凍干燥后稱重。 稱取一定量的白蛤蛋白，加20倍體積的三級(jí)水進(jìn)行重溶，在60℃的水浴溫度下，加1mhcl溶液將體系的ph值調(diào)至6.0，再以酶母液(30000u/ml)與底物間1:400的體積比加入木瓜蛋白酶，酶解反應(yīng)6h后，100℃煮沸10min滅酶活，酶解液經(jīng)真空冷凍干燥后得到白蛤蛋白酶解物。

將上述白蛤蛋白酶解物配制成20mg/ml的溶液，先經(jīng)0.45μm水系微孔膜過(guò)濾，收集到的濾液再經(jīng)10kda的超濾膜截留，得到的濾出組分真空冷凍干燥，即為mw<10kda的白蛤多肽。

實(shí)施例2、抗百草枯誘導(dǎo)的氧化脅迫實(shí)驗(yàn)

經(jīng)同步化后的野生型秀麗線蟲(n2)培養(yǎng)至l4期，加入終濃度為75μg/ml的5-fudr以抑制其產(chǎn)卵，生長(zhǎng)至成蟲初期，將秀麗線蟲以10～15條/孔的量與作為食物的大腸桿菌e.colina22一起加至96孔板中，各組分別喂以0.5mg/ml、1mg/ml和2mg/ml的實(shí)施例1制備的白蛤多肽，對(duì)照組加入等體積的smedium，置于20℃培養(yǎng)24h后，加入終濃度為80mm的百草枯進(jìn)行氧化脅迫造模，之后每隔12h統(tǒng)計(jì)各濃度下秀麗線蟲的存活情況，直至其全部死亡。統(tǒng)計(jì)過(guò)程中將身體僵直不動(dòng)、對(duì)輕微震動(dòng)無(wú)反應(yīng)的線蟲記為死亡狀態(tài)。各組線蟲的樣本量為100～150條，結(jié)果用kaplan-meier法進(jìn)行分析。結(jié)果如圖1所示。

結(jié)果顯示，經(jīng)0.5，1，2mg/ml的實(shí)施例1制備的白蛤多肽飼喂后的實(shí)驗(yàn)組，相對(duì)于未給藥的對(duì)照組，秀麗線蟲在急性氧化脅迫條件下的存活率顯著提高，并呈現(xiàn)出劑量依賴性。表明本發(fā)明所述白蛤多肽具有較好的體內(nèi)抗氧化能力。

實(shí)施例3、活性氧(ros)水平的檢測(cè)

經(jīng)同步化后的n2秀麗線蟲培養(yǎng)至l4期，以4000條/孔的量與5-fudr、e.colina22、1mg/ml和2mg/ml的實(shí)施例1制備的白蛤多肽加至24孔培養(yǎng)板中，每孔終體積1ml，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，收集各組線蟲，并在冰浴條件下勻漿，將勻漿液4℃、10000g條件下離心5分鐘，收集上清液，加入終濃度為50μm的dcfh-da探針溶液孵育2h后，利用熒光酶標(biāo)儀在485nm激發(fā)波長(zhǎng)和538nm發(fā)射波長(zhǎng)下檢測(cè)熒光強(qiáng)度。結(jié)果如圖2所示。

結(jié)果顯示，經(jīng)1mg/ml和2mg/ml的實(shí)施例1制備的白蛤多肽飼喂后，秀麗線蟲體內(nèi)ros水平較對(duì)照組均有一定程度的下降。表明本發(fā)明所述白蛤多肽能夠促進(jìn)體內(nèi)ros的清除而發(fā)揮抗氧化能力。

實(shí)施例4、sod酶活的測(cè)定

按照實(shí)施例3所述方法分別進(jìn)行秀麗線蟲的培養(yǎng)、給藥及組織勻漿，勻漿液離心后收集上清液，利用bca法測(cè)定總蛋白含量，利用氧化歧化酶(sod)活力檢測(cè)試劑盒測(cè)定秀麗線蟲勻漿上清液中sod活力。結(jié)果如圖3所示。

結(jié)果顯示，經(jīng)1mg/ml和2mg/ml的實(shí)施例1制備的白蛤多肽飼喂后，均能顯著地提高秀麗線蟲體內(nèi)抗氧化酶sod的活力，從而增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力。

實(shí)施例5、哺乳動(dòng)物細(xì)胞模型上的抗氧化能力

利用150μm的h2o2對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞sh-sy5y進(jìn)行氧化損傷造模，調(diào)整細(xì)胞密度至1×10⁵個(gè)/ml，按照100μl/孔加至96孔板，于37℃下孵育24h后吸棄舊培養(yǎng)基，再加入90μl細(xì)胞培養(yǎng)基，分別加入10μl終濃度為100、500、1000μg/ml的白蛤多肽，在37℃孵育24h后，加入5mg/ml的mtt溶液，繼續(xù)在37℃孵育4h后，吸棄上清，以100μl/孔加入dmso，在搖床上振搖10min以充分溶解甲臜結(jié)晶，于570nm處測(cè)定吸光值，計(jì)算細(xì)胞存活率，結(jié)果如圖4所示。

其中，細(xì)胞存活率計(jì)算公式如下：

式中，asample和acontrol分別表示給藥組和對(duì)照組的吸光值。

結(jié)果顯示，當(dāng)給藥濃度達(dá)到500μg/ml以上時(shí)，白蛤多肽可顯著地緩解雙氧水對(duì)sh-sy5y細(xì)胞產(chǎn)生的損傷，具有較好的抗氧化作用。

實(shí)施例6、趨化試驗(yàn)

分別將1mg/ml和2mg/ml的白蛤多肽和菌液混勻后涂板，再將cl2355秀麗線蟲的卵轉(zhuǎn)移至涂有藥物和菌液混合物的板上，16℃培養(yǎng)箱中孵育36h 后，升溫至23℃繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)36h，分別收集每板上的秀麗線蟲進(jìn)行趨化實(shí)驗(yàn)，以無(wú)水乙醇配制的0.5％苯甲醛作為化學(xué)誘導(dǎo)劑滴加在趨化板的一側(cè)(a區(qū)域)，無(wú)水乙醇滴在板子另一側(cè)的相同位置(b區(qū)域)作為對(duì)照，將秀麗線蟲轉(zhuǎn)移至趨化板中線處，蓋上蓋子，放回23℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育，使得各組線蟲自由爬行1h后，55℃高溫急速殺死線蟲以固定其位置，分別統(tǒng)計(jì)板a、b區(qū)域的線蟲數(shù)a0、b0，以及板上的總蟲數(shù)n0，并計(jì)算趨化指數(shù)(chemotaxisindex；ci)。結(jié)果如圖5所示。

其中，趨化指數(shù)ci的計(jì)算公式如下：

結(jié)果顯示，1mg/ml和2mg/ml的白蛤多肽均有一定的緩解aβ聚集毒性的作用，且與對(duì)照相比，2mg/ml的白蛤多肽具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異性。表明本發(fā)明所述白蛤多肽可以緩解aβ聚集引起的神經(jīng)毒性。

實(shí)施例7、避化試驗(yàn)

將同步化后的l1期ha759幼蟲、大腸桿菌na22、實(shí)施例1制備的白蛤多肽加至24孔板中，給藥終濃度分別為0.25mg/ml、0.5mg/ml，每孔1000～1500條蟲，將板置于15℃搖床中培養(yǎng)3天后，收集各組蟲液，離心棄上清，經(jīng)m9緩沖液反復(fù)吹洗3次。用30μl8m甘油在制備好的固體培養(yǎng)板中央劃一條中線，將其分為n和t兩個(gè)半圓區(qū)域。在t區(qū)平皿的邊緣處滴加微量1％的雙乙酰用作引誘劑，在n區(qū)等距處10μl蟲液，液滴干后將避化板放回23℃培養(yǎng)箱中自由爬行90min后，于55℃高溫急速殺死線蟲并固定其位置，分別統(tǒng)計(jì)板n、t區(qū)域的線蟲數(shù)n0、t0，并計(jì)算回避指數(shù)(avoidanceindex；ai)。

其中，回避指數(shù)ai的計(jì)算公式如下：

結(jié)果顯示，經(jīng)0.25mg/ml和0.5mg/ml的白蛤多肽給藥處理后，秀麗線蟲ha759對(duì)不利的高滲條件的回避行為有一定的改善，說(shuō)明其對(duì)體內(nèi)polyq聚集引起的神經(jīng)毒性有一定的緩解作用。且與對(duì)照相比，這種神經(jīng)保護(hù)作用 在0.5mg/ml時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異性。表明本發(fā)明所述白蛤多肽可以緩解polyq聚集引起的神經(jīng)毒性。