本發(fā)明涉及水產(chǎn)食品加工技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種具有ACE抑制和抗氧化功能的甲魚蛋白肽及其制備方法。
背景技術(shù)：
高血壓是對人類健康危害極大的一種疾病，潛伏期長。高血壓的早期階段，一般沒有明顯不適癥，直至發(fā)生臨床跡象心臟病發(fā)作、腦血管破裂而導(dǎo)致死亡。
血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(Angiotensin I converting enzyme，ACE)為腎素-血管緊張素系統(tǒng)的關(guān)鍵酶。血管緊張素原在腎素的作用下轉(zhuǎn)化為血管緊張素I，血管緊張素I在ACE的作用下轉(zhuǎn)化為血管緊張素II，刺激血管收縮，造成血壓上升。抑制ACE的活性對降低血壓有著積極的作用，因而開發(fā)有效的ACE抑制劑引起人們的極大關(guān)注。雖然來源于食物的ACE抑制肽比人工合成的ACE抑制劑作用弱，但是它有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，不會(huì)產(chǎn)生降壓過度的問題，安全性高，無副作用，除降壓功能外，往往同時(shí)具有免疫促進(jìn)、易消化吸收等功能。由于藥物療法存在副作用，天然食物中的降血壓功能因子的開發(fā)利用將成為今后高血壓非藥物治療的重要部分。
現(xiàn)有技術(shù)中關(guān)于ACE抑制肽開發(fā)的報(bào)道，主要是通過酶解的方法從水產(chǎn)動(dòng)物體或牛乳乳清蛋白源獲得ACE抑制肽，酶解過程通常都需要通過添加酸或堿來調(diào)節(jié)體系的pH值，這無疑影響了獲得的ACE抑制肽產(chǎn)品的功能特性，且增加了操作的繁瑣程度；還有的ACE抑制肽的制備方法在酶解后還有脫苦脫味的步驟，以改善水產(chǎn)動(dòng)物的腥味等不適口的味道，這些方法均不同程度地增加了操作步驟和生產(chǎn)成本，制約了產(chǎn)業(yè)化規(guī)?；疉CE抑制肽的生產(chǎn)及蛋白肽的得率。另一方面，現(xiàn)有技術(shù)從水生生物中獲得的具有ACE抑制功能的肽往往僅具有ACE抑制功能，未發(fā)現(xiàn)有其他的生物活性功能，即產(chǎn)品性能單一。
目前國內(nèi)外專利中未見利用甲魚肉資源制備血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的專利文獻(xiàn)報(bào)道。本發(fā)明針對目前甲魚蛋白產(chǎn)品開發(fā)的現(xiàn)狀，利用甲魚肉為原料，通過對甲魚肉的超聲波等預(yù)處理，在不添加任何酸和堿條件下，利用多種蛋白酶復(fù)合酶解，通過膜分離和凝膠分離技術(shù)，開發(fā)了同時(shí)具有特定降壓和抗氧化功能的甲魚蛋白肽，建立一套簡單高效的多功能的甲魚蛋白肽的制備方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是在于提供一種具有ACE抑制和抗氧化功能的甲魚蛋白肽。
本發(fā)明的另一目的在于提供上述甲魚蛋白肽的制備方法。
本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供上述甲魚蛋白肽的應(yīng)用。
為了實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明提供了一種具有ACE抑制和抗氧化功能的甲魚蛋白肽及其制備方法，包括以下步驟:
(1)超聲處理去脂的甲魚肉漿液；
(2)加入復(fù)合蛋白酶進(jìn)行二步法酶解，酶解過程無需添加酸或堿調(diào)節(jié)pH值；
(3)對酶解液離心并取上清液通過二步超濾法處理；
(4)濾液過柱層析分離，收集洗脫峰，即得。
步驟(1)所述的甲魚肉漿液通過以下方式獲得：新鮮甲魚放血宰殺，取甲魚肉，用符合飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的清潔水清洗,魚肉清洗后在95℃水中保溫5-10分鐘，然后在甲魚肉中加入2.0～4.0倍的水，用打漿機(jī)將甲魚肉打成漿，通過6000～8000g離心10～15min，去上層脂肪，得到去脂的甲魚魚肉漿液。
其中，步驟(1)超聲處理方法為將去脂的甲魚肉漿液溫度調(diào)至55-65℃，25-30kH的超聲頻率處理15-25min。
本發(fā)明通過大量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，甲魚肉漿液溫度調(diào)至55-65℃進(jìn)行超聲處理，效果最好，能夠較好地改變甲魚肉蛋白的組織結(jié)構(gòu)，使下面酶解步驟縮短酶解時(shí)間和較少的用酶量，就能夠獲得優(yōu)質(zhì)的蛋白肽。
在上述方法的步驟(2)二步法酶解中，第一步酶解加入的復(fù)合蛋白酶為堿性蛋白酶和菠蘿蛋白酶，二者質(zhì)量比為1-2:1，且加入的復(fù)合蛋白酶質(zhì)量為甲魚肉質(zhì)量的0.1％-0.3％。
優(yōu)選地，第一步酶解條件為55-65℃酶解1-2h。
在上述方法的步驟(2)二步法酶解中，第二步酶解加入的復(fù)合蛋白酶為木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶，二者質(zhì)量比為1:1-2，且加入的復(fù)合蛋白酶質(zhì)量為甲魚肉質(zhì)量的0.1％-0.3％。
優(yōu)選地，第二步酶解條件為50-60℃酶解1-2h。
第二步酶解結(jié)束之后于90-95℃下保溫3-5min，冷卻至室溫。
上述方法中，步驟(3)的兩步超濾法為先用孔徑大于5000D的膜超濾，再用孔徑為3000D的膜超濾，得到分子量小于3000D的蛋白肽。
在本發(fā)明的實(shí)施例中，兩步超濾法為利用孔徑為10000道爾頓的陶瓷膜超濾，先將分子量小于10000的蛋白和多肽分離出來，再用孔徑為3000道爾頓的膜將分子量小于3000道爾頓的蛋白肽分離出來。
本發(fā)明甲魚蛋白肽的制備方法步驟(4)，是取分子量為小于3000的蛋白肽液，再經(jīng)過凝膠分離，收集洗脫峰；通過濃縮、冷凍干燥，得到分子量為小于3000D的具有較好血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制和抗氧化功能的甲魚肉蛋白肽。
在本發(fā)明的實(shí)施例中，是取分子量為小于3000的蛋白肽液，經(jīng)過Sephadex G-25凝膠分離，洗脫液為去離子水，流速為1.8-2.8mL/min，洗脫峰在280nm下進(jìn)行檢測，收集第2個(gè)洗脫峰；通過濃縮、冷凍干燥，得到分子量為小于3000具有較好血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制和抗氧化功能的甲魚肉蛋白肽。
上述制備方法制備得到的甲魚蛋白肽屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明上述方法制備得到的甲魚蛋白肽具有優(yōu)異的ACE抑制和抗氧化功能。
進(jìn)而，本發(fā)明提供了該甲魚蛋白肽在制備降血壓或抗氧化藥物中的應(yīng)用。含有本發(fā)明方法制得的甲魚蛋白肽的食品、保健品或藥物也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：
(1)本發(fā)明開發(fā)的甲魚肉蛋白肽制備方法簡單，整個(gè)加工過程中沒有添加酸或堿進(jìn)行pH的調(diào)整，產(chǎn)品保持較好的功能特性，較易實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
(2)開發(fā)的蛋白肽具有較好的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)活性抑制的功能，其IC 50值為小于0.4mg/mL，1.2mg/mL樣品濃度的ACE抑制率達(dá)到90％以上，同時(shí)具有較好的抗氧化功能。能廣泛應(yīng)用于特需食品和營養(yǎng)食品的制造。
(3)本發(fā)明利用特定頻率超聲波技術(shù)處理一定溫度(55-65℃)的甲魚肉蛋白漿，可以明顯改善甲魚肉蛋白的結(jié)構(gòu)，縮短酶解時(shí)間，提高甲魚肉蛋白肽的功能和產(chǎn)品的得率。
(4)本發(fā)明方法制備得到的甲魚蛋白肽食用安全，本發(fā)明采用多種食品級復(fù)合蛋白酶(堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶)，經(jīng)在溫和條件下，經(jīng)過適度酶解獲得特定分子量的甲魚肉蛋白肽，不加任何添加劑，為100％甲魚肉蛋白肽，產(chǎn)品具有良好的風(fēng)味，較高的得率。
(5)本發(fā)明開發(fā)甲魚蛋白肽中分子量小于1000D的肽的比例為90％以上，易于機(jī)體消化和吸收。
具體實(shí)施方式
除非另有定義，下文中所使用的所有專業(yè)術(shù)語與本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義相同。本文中所使用的專業(yè)術(shù)語只是為了描述具體實(shí)施例的目的，并不是旨在限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
除有特別說明，本發(fā)明中用到的各種試劑、原料均為可以從市場上購買的商品或者可以通過公知的方法制得的產(chǎn)品。
實(shí)施例1具有ACE抑制和抗氧化功能的甲魚肉蛋白肽的制備方法
(1)取甲魚肉100克，用符合飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的清潔水清洗，魚肉清洗后在95℃水中保溫10分鐘，然后在甲魚肉中加入2.0倍的水200克，用打漿機(jī)將甲魚肉打成漿，通過6000g離心10min，去上層脂肪，得到去脂的甲魚魚肉漿液。
(2)將去脂甲魚肉漿液的溫度調(diào)整到55℃，于超聲波發(fā)生器中經(jīng)超聲波頻率為30kH處理15分鐘，改變甲魚肉蛋白的組織結(jié)構(gòu)。
(3)按照甲魚肉重量0.3％的重量百分比比例向經(jīng)過超聲波處理的甲魚肉漿液體中加入復(fù)合蛋白酶進(jìn)行分步酶解，第一步加復(fù)合蛋白酶一(堿性蛋白酶和菠蘿蛋白酶組成，它們之間的質(zhì)量比為1：1)0.2％，在60℃條件下進(jìn)行酶解2h；然后進(jìn)行第二步利用復(fù)合蛋白酶二(木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶組成，它們之間的質(zhì)量比為1：2)0.1％，在55℃條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)1.5h；在95℃下保溫3分鐘，冷卻至室溫，在4000g條件下離心15min，收集上清液。
(4)將步驟(3)所得的上清液通過二步超濾方法進(jìn)行處理，利用孔徑為10000道爾頓的陶瓷膜超濾，先取將分子量小于10000的蛋白和多肽分離出來，再用孔徑為3000道爾頓的膜將分子量小于3000道爾頓的蛋白肽分離出來。
(5)取分子量為小于3000的蛋白液，再經(jīng)過Sephadex G-25凝膠分離，洗脫液為去離子水，流速為2.0mL/min，洗脫峰在280nm下進(jìn)行檢測，收集第2個(gè)洗脫峰；通過濃縮、冷凍干燥，得到分子量為小于3000D的甲魚肉蛋白肽。
實(shí)施例2具有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制和抗氧化功能的甲魚肉蛋白肽的制備方法
(1)取甲魚肉500克，用符合飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的清潔水清洗,魚肉清洗后在90℃水中保溫8分鐘，然后在甲魚肉中加入3.0倍的水，用打漿機(jī)將甲魚肉打成漿，通過7000g離心10min，去上層脂肪，得到去脂的甲魚魚肉漿液。
(2)將去脂甲魚肉漿液的溫度調(diào)整到60℃，于超聲波發(fā)生器中經(jīng)超聲波(頻率為25kH)處理25分鐘，改變甲魚肉蛋白的組織結(jié)構(gòu)。
(3)按照甲魚肉重量0.2％的重量百分比比例向經(jīng)過超聲波處理的甲魚肉漿液體中加入復(fù)合蛋白酶進(jìn)行分步酶解，第一步添加蛋白酶一(堿性蛋白酶和菠蘿蛋白酶組成，它們之間的質(zhì)量比為1：1)0.1％，在65℃條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)2h；然后進(jìn)行第二步添加復(fù)合蛋白酶二(木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶組成，它們之間的質(zhì)量比為1：1)0.1％，在60℃條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)2h；在90℃下保溫3～5分鐘，冷卻至室溫，在3500g條件下離心15min，收集上清液。
(4)將步驟(3)所得的上清液通過二步超濾方法進(jìn)行處理，利用孔徑為10000道爾頓的陶瓷膜超濾，先取將分子量小于10000的蛋白和多肽分離出來，再用孔徑為3000道爾頓的膜將分子量小于3000道爾頓的蛋白肽分離出來。
(5)取分子量為小于3000的蛋白液，再經(jīng)過Sephadex G-25凝膠分離，洗脫液為去離子水，流速為2.0mL/min，洗脫峰在280nm下進(jìn)行檢測，收集第2個(gè)洗脫峰；通過濃縮、冷凍干燥，得到分子量為小于3000D的甲魚肉蛋白肽。
實(shí)施例3具有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制和抗氧化功能的甲魚肉蛋白肽的制備方法
(1)取甲魚肉1000克，用符合飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的清潔水清洗,魚肉清洗后在95℃水中保溫10分鐘，然后在甲魚肉中加入2.5倍的水2500克，用打漿機(jī)將甲魚肉打成漿，通過7000g離心12min，去上層脂肪，得到去脂的甲魚魚肉漿液。
(2)將去脂甲魚肉漿液的溫度調(diào)整到65℃，于超聲波發(fā)生器中經(jīng)超聲波頻率為30kH處理15分鐘，改變甲魚肉蛋白的組織結(jié)構(gòu)。
(3)按照甲魚肉重量0.4％的重量百分比比例向經(jīng)過超聲波處理的甲魚肉漿液體中加入復(fù)合蛋白酶進(jìn)行分步酶解，第一步加復(fù)合蛋白酶一(堿性蛋白酶和菠蘿蛋白酶組成，它們之間的質(zhì)量比為2：1)0.2％，在60℃條件下進(jìn)行酶解1.5h；然后第二步加入甲魚肉重量0.2％復(fù)合蛋白酶二(木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶組成，它們之間的質(zhì)量比為1：1)，在55℃條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)1.5h；在92℃下保溫3分鐘，冷卻至室溫，在4000g條件下離心13min，收集上清液。
(4)將步驟(3)所得的上清液通過二步超濾方法進(jìn)行處理，利用孔徑為10000道爾頓的陶瓷膜超濾，先取將分子量小于10000的蛋白和多肽分離出來，再用孔徑為3000道爾頓的膜將分子量小于3000道爾頓的蛋白肽分離出來。
(5)取分子量為小于3000的蛋白液，再經(jīng)過Sephadex G-25凝膠分離，洗脫液為去離子水，流速為2.5mL/min，洗脫峰在280nm下進(jìn)行檢測，收集第2個(gè)洗脫峰；通過濃縮、冷凍干燥，得到分子量為小于3000D的甲魚肉蛋白肽。
實(shí)施例4甲魚肉蛋白肽血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制能力的測定試驗(yàn)
試驗(yàn)樣品：實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3制備的甲魚肉蛋白肽ACE抑制能力按照如下方法進(jìn)行：
ACE抑制率的方法。用高效液相色譜可以在228nm下定量檢測釋放出的Hip量，從而計(jì)算出多肽的ACE抑制率。
1)試劑的配置
pH8.3的磷酸鹽緩沖溶液：用超純水配制，其中含磷酸鹽50mmol/L，NaCl 300mmol/L，調(diào)整pH到8.3；
ACE酶液：將2mL的磷酸鹽緩沖液加入1U的ACE中，使其濃度變?yōu)?.5U/mL。
HHL溶液：使用磷酸緩沖液溶解HHL，使其終濃度為5mmol/L。
樣品溶液：稱取適量樣品，用磷酸鹽緩沖液所需濃度的溶液。
2)ACE抑制率測定的色譜條件
檢測波長：228nm；流速:1mL/min；流動(dòng)相A:超純水(含0.1％三氟乙酸)，流動(dòng)相B:甲醇(含0.1％三氟乙酸)；進(jìn)樣量:10μL，手動(dòng)進(jìn)樣；
3)測定ACE抑制活性的方法
取120μL HHL底物溶液，加入20μL的樣品混合均勻，在37℃恒溫水浴中保溫10min。然后加入10μL ACE酶液在37℃恒溫水浴中反應(yīng)30min，再加入150μL 1mol/L的HCl終止反應(yīng)，得到反應(yīng)液。該反應(yīng)液利用HPLC進(jìn)行分析，同時(shí)設(shè)置空白對照組。ACE抑制活性計(jì)算公式如下：
ACE抑制活性％＝(M-N)/M×100,
式中，M為對照組中馬尿酸的峰面積，N為添加的樣品組中馬尿酸的峰面積。
4)半抑制濃度的測定
按照ACE抑制肽體外檢測方法測定其抑制活性，以濃度為橫坐標(biāo)，ACE抑制率為縱坐標(biāo)繪成圓滑的曲線，從曲線中計(jì)算出IC50值。結(jié)果見表1。
實(shí)施例5本發(fā)明甲魚肉蛋白抗氧化活性的測定試驗(yàn)
試驗(yàn)樣品：實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3制備的甲魚肉蛋白抗氧化活性肽。
按照如下方法進(jìn)行：
(1)清除DPPH自由基能力：取1mg/mL的抗氧化活性肽1.5mL，加入99.5％乙醇1.5mL和0.02％DPPH乙醇溶液0.675mL混合，振蕩混勻，室溫下避光水浴30min，然后在517nm下檢測體系吸光值。吸光值越低，體系的清除DPPH自由基能力越強(qiáng)。空白對照即是將樣品溶液1.5mL換成去離子水1.5mL。
DPPH自由基清除能力％＝((空白吸光值-樣品吸光值)/空白吸光值)×100。結(jié)果見表1。
(2)還原力測定：取1mg/mL的抗氧化活性肽1mL，加入0.2M磷酸緩沖液(pH 6.6)2.5mL和1％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的鐵氰化鉀溶液2.5mL，混勻，然后在50℃水浴加熱20min。取出迅速冷卻，加入10％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))三氯乙酸(TCA)溶液2.5mL，混合均勻，然后在3000g下離心10min。取上清液2.5mL，加入去離子水2.5mL和1％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))三氯化鐵溶液0.5mL，充分混勻，在室溫下反應(yīng)10min，用700nm波長測定吸光度。還原力即可用700nm波長處吸光值表示。結(jié)果見表1。
(3)氧化自由基吸收能力(ORAC)：不同濃度的抗氧化活性肽溶液20μL與75mM磷酸鹽緩沖液80μL(pH 7.4)及200nM的熒光試劑50μL充分混合，然后在37℃溫育15min，再加入80mM的AAPH溶液50μL。用酶標(biāo)儀每分鐘讀取熒光值共進(jìn)行100min。熒光的激發(fā)波長和發(fā)射波長分別是485nm和538nm。用磷酸緩沖溶液代替樣品作為空白。以Trolox作為標(biāo)準(zhǔn)對照，使用的濃度為0，2，4，8，12，16μM，繪制熒光淬滅曲線，并計(jì)算熒光淬滅曲線下的積分面積(AUC)。AUC的計(jì)算公式如下：
其中：f0是0min時(shí)熒光值，fi是第i min時(shí)的熒光值。
ORAC值用樣品曲線的斜率與Trolox曲線的斜率之比，ORAC值得單位表示為μM Trolox/mg肽。
表1本發(fā)明三個(gè)實(shí)施例制得的甲魚蛋白肽的分子量及血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制和抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果
結(jié)果(見表1)本發(fā)明甲魚蛋白肽具有很好的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制能力ACE抑制活性(IC50值)低于0.35mg/mL，顯著低于同類復(fù)合蛋白肽的IC50值，1.2mg/mL樣品ACE抑制率達(dá)到90％以上，具有很好的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制能力。同時(shí)發(fā)明甲魚蛋白肽具有具有較好的抗氧化能力，在1mgg/mL的條件下，其清除DPPH自由基能力達(dá)到89％以上，還原力達(dá)到0.87以上，其ORAC為16以上，也是一種較好的抗氧化肽。
以上的實(shí)施例僅僅是對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行描述，并非對本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計(jì)精神的前提下，本領(lǐng)域普通工程技術(shù)人員對本發(fā)明的技術(shù)方案做出的各種變型和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明的權(quán)利要求書確定的保護(hù)范圍內(nèi)。