本發(fā)明涉及到一種軟骨提取物的制備方法，特別涉及一種含非變性ⅱ型膠原蛋白的軟骨提取物的制備方法。

背景技術(shù)：

膠原蛋白是皮膚、骨骼和關(guān)節(jié)等組織的重要的組成部分，是多細(xì)胞動(dòng)物的細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分。目前從哺乳動(dòng)物中已經(jīng)發(fā)行27種不同類型的膠原蛋白，其中由三條相同的α鏈組成的ⅱ型膠原蛋白主要存在于軟骨組織中和眼玻璃體中，因此ⅱ型膠原蛋白被視為軟骨的一種結(jié)構(gòu)功能性元素。

目前市面在銷售膠原蛋白多為經(jīng)過(guò)水解后的膠原蛋白，其主要成分是多肽，分子量分布在200-20000da的范圍內(nèi)。雖然這些多肽也具有一定的保持皮膚水分、增強(qiáng)骨密度和增強(qiáng)免疫力等作用，但并無(wú)預(yù)防和治療因自身免疫機(jī)能變化引起的風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的功效，也不具有預(yù)防和治療退行性關(guān)節(jié)炎的作用。

非變性ⅱ型膠原蛋白是具有完整三螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白，當(dāng)人體攝入非變性ⅱ型膠原蛋白后，體內(nèi)免疫細(xì)胞尤其是淋巴細(xì)胞的免疫耐受會(huì)發(fā)生改善，免疫耐受的原因是由于攝入的ⅱ型膠原蛋白中含有抗原決定簇?？乖瓫Q定簇是抗原的一個(gè)特殊結(jié)構(gòu)單元，能夠被抗體識(shí)別和綁定，當(dāng)抗體綁定到生物大分子時(shí)，抗體不能識(shí)別整個(gè)有機(jī)體或物質(zhì)，但是能識(shí)別標(biāo)位并進(jìn)行綁定。活性抗原決定基被綁定在淋巴集結(jié)上作為一個(gè)組織存于小腸，去刺激免疫細(xì)胞、信息傳遞分子如細(xì)胞因子和參與增殖分化趨化因子并抑制細(xì)胞分泌去抑制炎癥。

目前國(guó)內(nèi)外也有一些非變性ⅱ型膠原蛋白的提取工藝，但或是未對(duì)其原料進(jìn)行除雜等預(yù)處理、或未對(duì)雜蛋白進(jìn)行處理、或是提取率低、或是保存條件受限制。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的之一是至少克服上述缺陷中的一種，提供一種新的含非變性ⅱ型膠原蛋白的軟骨提取物的制備方法。

因此，本發(fā)明提供了一種含非變性ii型膠原蛋白的軟骨提取物的制備方法，其特征在于，該方法依次包括以下步驟：脫脂、消毒、勻漿、酶解、過(guò)濾、干燥；其中，在所述酶解步驟中：將在勻漿步驟中獲得的漿狀物的ph調(diào)節(jié)為2.5～8.5，加入軟骨重量的0.001％-2％的酶，加入軟骨重量的1/20～1/500的木瓜和/或菠蘿低溫榨汁后過(guò)濾獲得的清液，酶解12～48h，酶解溫度為25-50℃。

本發(fā)明提供的制備方法獲得的軟骨提取物純度高、提取率高、易保存、易規(guī)?；a(chǎn)，且富含非變性ⅱ型膠原蛋白和硫酸軟骨素。

附圖說(shuō)明書(shū)

圖1為實(shí)施例1獲得的非變性ii型膠原蛋白的透射電鏡圖片。

圖2表示實(shí)施例1和2獲得的ii型膠原蛋白的western印跡的結(jié)果，其中左側(cè)泳道是實(shí)施例2獲得的ii型膠原蛋白，右側(cè)泳道是實(shí)施例1獲得的ii型膠原蛋白。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供了一種含非變性ii型膠原蛋白的軟骨提取物的制備方法，其特征在于，該方法依次包括以下步驟：脫脂、消毒、勻漿、酶解、過(guò)濾、干燥；其中，在所述酶解步驟中：將在勻漿步驟中獲得的漿狀物的ph調(diào)節(jié)為2.5～8.5，加入軟骨重量的0.001％-2％的酶，加入軟骨重量的1/20～1/500的木瓜和/或菠蘿低溫榨汁后過(guò)濾獲得的清液，酶解12～48h，酶解溫度為25-50℃。

本申請(qǐng)的發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)，在上述酶解條件下進(jìn)行酶解，能夠獲得較高濃度的非變性ⅱ型膠原蛋白。

在酶解步驟，所述酶可以采用本領(lǐng)域所用的任何酶，但是在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述酶優(yōu)選為胃蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、堿性蛋白酶、金屬蛋白酶中的一種或幾種；最優(yōu)選為胃蛋白酶。

在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所酶的用量為軟骨重量的0.5-2％，木瓜和/或菠蘿低溫榨汁后過(guò)濾獲得的清液的用量為軟骨重量的1/20-1/50，酶解時(shí)間為12～20h，酶解溫度25～40℃。

在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，加入的清液是木瓜和菠蘿低溫榨汁后過(guò)濾獲得的混合清液，其中，木瓜和菠蘿的重量比為1-10：1，優(yōu)選為3-6：1。在該優(yōu)選條件下，獲得的軟骨提取物中非變性ⅱ型膠原蛋白濃度更高。

在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，在干燥步驟后進(jìn)行粉碎，其中，

脫脂：用一定濃度的脫脂劑浸泡軟骨丁狀物0.2h～6h，然后用水清洗至清洗后的水的ph到5.5～8.5；

消毒：用一定濃度消毒液浸泡脫脂后的軟骨丁狀物1～3次，然后用水清洗至軟骨丁狀物無(wú)味；

勻漿：將消毒后的軟骨丁狀物進(jìn)行勻漿處理，勻漿后軟骨的粒度為50～300目；

過(guò)濾：利用5～100目篩網(wǎng)進(jìn)行過(guò)濾，去除溶液中大顆粒物質(zhì)，收集過(guò)濾液；

干燥：將過(guò)濾收集的過(guò)濾液進(jìn)行低溫干燥，干燥溫度不高于30℃，干燥后獲得軟骨提取物；

粉碎：干燥后的軟骨提取物在4℃以下進(jìn)行超微粉碎，粉碎物的目數(shù)控制在100目-500目。

在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述脫脂劑是naoh溶液、koh溶液、na2co3溶液、nacl溶液、kcl溶液中的一種或幾種。

在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述脫脂劑的濃度為0.01～3重量％，所述脫脂劑與軟骨的重量比為1～10:1

在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，消毒步驟中所使用的消毒液是次氯酸鈉和/或雙氧水，消毒過(guò)程中消毒液的濃度控制在100ppm～2000ppm，消毒時(shí)間控制在0.2h～12h。

在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，勻漿步驟在37℃以下進(jìn)行。

在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，低溫干燥方法是滾筒烘干法、低溫長(zhǎng)網(wǎng)烘干法、冷凍干燥法。

在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，在有預(yù)冷的步驟時(shí)，預(yù)冷溫度不高于-10℃，干燥后軟骨提取物的含水量控制在6％以下。

在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述制備方法在脫脂前進(jìn)行預(yù)處理，以獲得更加純凈的膠原蛋白。該預(yù)處理可以按照現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行，優(yōu)選地該預(yù)處理包括：去除軟骨原料上存在的脂肪、筋膜、殘留的肉或紅骨等非軟骨物質(zhì)，然后將其切成2mm～20mm的丁狀物。

在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用的原料軟骨可以是雞軟骨、鴨軟骨、牛軟骨或其混合物。

實(shí)施例1

(1)預(yù)處理：選取雞胸軟骨3.5kg，解凍后除去軟骨上的雞肉、筋膜和紅骨，然后利用切丁機(jī)切成3*3mm的丁狀。

(2)脫脂：用終0.01％濃度的na2co3和2％nacl的混合脫脂劑溶液7kg，常溫脫脂4h，脫脂排水后用純化水清洗至ph6.5。

(3)消毒：加濃度400ppm次氯酸鈉溶液開(kāi)始消毒，消毒2次，每次12h，消毒結(jié)束后用純化水清洗至無(wú)消毒也氣味無(wú)余氯檢出，ph控制在6.5-7.0。

(4)勻漿：將步驟(3)處理的軟骨丁狀物加入6kg純化水，用膠體磨將軟骨磨成100-200目。

(5)酶解：將步驟(4)獲得的漿液ph調(diào)節(jié)至2.5，加入70克胃蛋白酶，加入60低溫榨汁后過(guò)濾獲得的新鮮木瓜清液和10g低溫榨汁后過(guò)濾獲得的新鮮菠蘿清液，在溫度25℃進(jìn)行酶解20h。

(6)過(guò)濾：利用5目篩網(wǎng)進(jìn)行過(guò)濾，去除溶液中大顆粒物質(zhì)，收集過(guò)濾液。

(7)干燥：將步驟(6)收集的過(guò)濾液進(jìn)行真空冷凍干燥，預(yù)冷溫度不高于-40℃，干燥過(guò)程終溫度控制在30℃，凍干后獲得軟骨提取物。

(8)粉碎：冷凍干燥后的軟骨提取物在4℃以下進(jìn)行超微粉碎，粉碎物的目數(shù)控制在200目，獲得凍干品。

采用gb5009.5的方法檢測(cè)膠原蛋白含量為55.2％，采用gb/t20365檢測(cè)硫酸軟骨素含量為7.9％，采用elisa方法檢測(cè)(試劑盒供應(yīng)商為上海江萊生物科技有限公司)非變性ⅱ型膠原蛋白含量為11.3％。采用透射電鏡檢測(cè)非變性ⅱ型膠原蛋白的形態(tài)，結(jié)果如圖1所示。采用western印跡檢測(cè)ii型膠原蛋白，結(jié)果如圖2右側(cè)泳道所示。

實(shí)施例2

(1)預(yù)處理：選取新鮮鴨胸軟骨20kg，解凍后除去軟骨上的鴨肉、筋膜和紅骨，然后利用切丁機(jī)切成約2mm*2mm的丁狀.

(2)脫脂：用終濃度為0.01％的naoh和0.9％的kcl溶液200kg，常溫脫脂6h，然后用純化水清洗ph6.0。

(3)消毒：加濃度500ppm次氯酸鈉溶液(含100ppm的雙氧水)開(kāi)始消毒，消毒3次，每次6h，消毒結(jié)束后用純化水清洗至無(wú)消毒也氣味無(wú)余氯檢出，ph控制在6.5-7.0。

(4)勻漿：向步驟(3)處理的軟骨丁狀物中加入40kg的純化水，用膠體磨將軟骨磨成約100-200目。

(5)酶解：將步驟(4)獲得的漿液ph調(diào)節(jié)至8.5，加堿性蛋白酶0.2克，加入1kg低溫榨汁后過(guò)濾獲得的新鮮菠蘿清液，在溫度50℃，進(jìn)行酶解12h。

(6)過(guò)濾：利用100目篩網(wǎng)進(jìn)行過(guò)濾，去除溶液中大顆粒物質(zhì)，收集過(guò)濾液。

(7)干燥：將步驟(6)收集的過(guò)濾液冷卻成型后通過(guò)低溫長(zhǎng)網(wǎng)烘干法干燥，預(yù)冷溫度-10℃，干燥過(guò)程終溫度控制在30℃，干燥后獲得軟骨提取物。

(8)粉碎：冷凍干燥后的軟骨提取物在4℃以下進(jìn)行超微粉碎，粉碎物的目數(shù)控制在180目左右，得到一定干重的凍干品。

采用gb5009.5的方法檢測(cè)膠原蛋白含量為45.6％，采用gb/t20365檢測(cè)硫酸軟骨素含量為4.8％，采用elisa方法檢測(cè)(試劑盒供應(yīng)商為上海江萊生物科技有限公司)非變性ⅱ型膠原蛋白含量為3.9％。采用western印跡檢測(cè)ii型膠原蛋白，結(jié)果如圖2左側(cè)泳道所示。

實(shí)施例3

(1)預(yù)處理：選取雞胸軟骨20kg，解凍后除去軟骨上的雞肉、筋膜和紅骨，然后利用切丁機(jī)切成3*3mm的丁狀。

(2)脫脂：用終0.2％naoh和0.6％nacl的溶液100kg，常溫脫脂0.2h，然后用純化水清洗ph6.0。

(3)消毒：加濃度2000ppm次氯酸鈉溶液開(kāi)始消毒，消毒1次，每次0.2h，消毒結(jié)束后用純化水清洗至無(wú)消毒也氣味無(wú)余氯檢出，ph控制在6.5-7.0。

(4)勻漿：向步驟(3)處理的軟骨丁狀物中加入50kg的純化水，用膠體磨將軟骨磨成100-200目。

(5)酶解：將步驟(4)獲得的漿液ph調(diào)節(jié)至7.0，加20g枯草桿菌蛋白酶，加入200g低溫榨汁后過(guò)濾獲得的新鮮木瓜清液和20g低溫榨汁后過(guò)濾獲得的新鮮菠蘿清液，在溫度40℃進(jìn)行酶解24h。

(6)過(guò)濾：利用50目篩網(wǎng)進(jìn)行過(guò)濾，去除溶液中大顆粒物質(zhì)，收集過(guò)濾液。

(7)干燥：將步驟(6)收集的過(guò)濾液進(jìn)行真空冷凍干燥，預(yù)冷溫度不高于-30℃，干燥過(guò)程終溫度控制在20℃，凍干后獲得軟骨提取物。

(8)粉碎：冷凍干燥后的軟骨提取物在4℃以下進(jìn)行超微粉碎，粉碎物的目數(shù)控制在200目，獲得凍干品。

采用gb5009.5的方法檢測(cè)膠原蛋白含量為53.6％，采用gb/t20365檢測(cè)硫酸軟骨素含量為9.2％，采用elisa方法檢測(cè)(試劑盒供應(yīng)商為上海江萊生物科技有限公司)非變性ⅱ型膠原蛋白含量為10.3％。

實(shí)施例4

(1)預(yù)處理：選取雞胸軟骨70kg，解凍后除去軟骨上的雞肉、筋膜和紅骨，然后利用切丁機(jī)切成3*3mm的丁狀。

(2)脫脂：用終0.15％koh和0.3％kcl的溶液140kg，常溫脫脂2h，然后用純化水清洗ph6.0。

(3)消毒：加濃度100ppm次氯酸鈉溶液(含1000ppm雙氧水)開(kāi)始消毒，消毒2次，每次0.5h，消毒結(jié)束后用純化水清洗至無(wú)消毒也氣味無(wú)余氯檢出，ph控制在6.5-7.0。

(4)勻漿：向步驟(3)處理的軟骨丁狀物中加入140kg的純化水，用膠體磨將軟骨磨成100-200目。

(5)酶解：將步驟(4)獲得的漿液ph調(diào)節(jié)至7.5，加21g金屬蛋白酶，加入700g低溫榨汁后過(guò)濾獲得的新鮮菠蘿清液在溫度40℃進(jìn)行酶16h。

(6)過(guò)濾：利用50目篩網(wǎng)進(jìn)行過(guò)濾，去除溶液中大顆粒物質(zhì)，收集過(guò)濾液。

(7)干燥：將步驟(6)收解集的過(guò)濾液進(jìn)行真空冷凍干燥，預(yù)冷溫度不高于-30℃，干燥過(guò)程終溫度控制在20℃，凍干后獲得軟骨提取物。

(8)粉碎：冷凍干燥后的軟骨提取物在4℃以下進(jìn)行超微粉碎，粉碎物的目數(shù)控制在200目，獲得凍干品。

采用gb5009.5的方法檢測(cè)膠原蛋白含量為48.3％，采用gb/t20365檢測(cè)硫酸軟骨素含量為6.8％，采用elisa方法檢測(cè)(試劑盒供應(yīng)商為上海江萊生物科技有限公司)非變性ⅱ型膠原蛋白含量為8.3％。

實(shí)施例5

1)預(yù)處理：選取雞胸軟骨30kg，解凍后除去軟骨上的雞肉、筋膜和紅骨，然后利用切丁機(jī)切成5*5mm的丁狀。

(2)脫脂：用終0.05％naoh和0.1％kcl的溶液90kg，常溫脫脂1h，然后用純化水清洗ph6.0。

(3)消毒：加濃度300ppm次氯酸鈉溶液60kg開(kāi)始消毒，消毒2次，每次8h，消毒結(jié)束后用純化水清洗至無(wú)消毒也氣味無(wú)余氯檢出，ph控制在6.5-7.0。

(4)勻漿：向步驟(3)處理的軟骨丁狀物中加入70kg的純化水，用膠體磨將軟骨磨成100-200目。

(5)酶解：將步驟(4)獲得的漿液ph調(diào)節(jié)至3.0，加150g胃蛋白酶，加入135g低溫榨汁后過(guò)濾獲得的新鮮木瓜清液和45g低溫榨汁后過(guò)濾獲得的新鮮菠蘿清液，在溫度25℃進(jìn)行酶16h。

(6)過(guò)濾：利用50目篩網(wǎng)進(jìn)行過(guò)濾，去除溶液中大顆粒物質(zhì)，收集過(guò)濾液。

(7)干燥：將步驟(6)收集的過(guò)濾液進(jìn)行真空冷凍干燥，預(yù)冷溫度不高于-30℃，干燥過(guò)程終溫度控制在25℃，凍干后獲得軟骨提取物。

(8)粉碎：冷凍干燥后的軟骨提取物在4℃以下進(jìn)行超微粉碎，粉碎物的目數(shù)控制在200目，獲得凍干品。

采用gb5009.5的方法檢測(cè)膠原蛋白含量為57.3％，采用gb/t20365檢測(cè)硫酸軟骨素含量為12.3％，采用elisa方法檢測(cè)(試劑盒供應(yīng)商為上海江萊生物科技有限公司)非變性ⅱ型膠原蛋白含量為12.6％。

實(shí)施例6

1)預(yù)處理：選取牛軟骨5kg，解凍后除去軟骨上的牛肉、筋膜和紅骨，然后利用切丁機(jī)切成5*5mm的丁狀。

(2)脫脂：用終0.3％naoh和1％nacl的溶液20kg，常溫脫脂3h，然后用純化水清洗ph6.0。

(3)消毒：加濃度500ppm次氯酸鈉溶液10kg開(kāi)始消毒，消毒3次，每次1.5h，消毒結(jié)束后用純化水清洗至無(wú)消毒也氣味無(wú)余氯檢出，ph控制在6.5-7.0。

(4)勻漿：向步驟(3)處理的軟骨丁狀物中加入10kg的純化水，用膠體磨將軟骨磨成100-200目。

(5)酶解：將步驟(4)獲得的漿液ph調(diào)節(jié)至3.0，加75g胃蛋白酶，加入25g低溫榨汁后過(guò)濾獲得的新鮮木瓜清液和25g低溫榨汁后過(guò)濾獲得的新鮮菠蘿清液，在溫度25℃進(jìn)行酶20h。

(6)過(guò)濾：利用50目篩網(wǎng)進(jìn)行過(guò)濾，去除溶液中大顆粒物質(zhì)，收集過(guò)濾液。

(7)干燥：將步驟(6)收解集的過(guò)濾液進(jìn)行真空冷凍干燥，預(yù)冷溫度不高于-30℃，干燥過(guò)程終溫度控制在30℃，凍干后獲得軟骨提取物。

(8)粉碎：冷凍干燥后的軟骨提取物在4℃以下進(jìn)行超微粉碎，粉碎物的目數(shù)控制在200目，獲得凍干品。

采用gb5009.5的方法檢測(cè)膠原蛋白含量為54.8％，采用gb/t20365檢測(cè)硫酸軟骨素含量為10.1％，采用elisa方法檢測(cè)(試劑盒供應(yīng)商為上海江萊生物科技有限公司)非變性ⅱ型膠原蛋白含量為10.3％。