專利名稱：與谷子抽穗期基因緊密連鎖的分子標(biāo)記SIsv0832的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及ー種分子標(biāo)記，特別是涉及一種與谷子抽穗期基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。本發(fā)明還涉及擴(kuò)增該分子標(biāo)記的引物、該分子標(biāo)記和引物在谷子抽穗期基因定位或谷子遺傳育種中的用途。
背景技術(shù)：
我國(guó)是谷子(Setaria italica L. Beauv.)的原產(chǎn)國(guó)，是世界上谷子的集中種植國(guó)，谷子在我國(guó)的國(guó)民經(jīng)濟(jì)和社會(huì)生產(chǎn)中占有重要的地位，對(duì)旱作生態(tài)農(nóng)業(yè)建設(shè)有重要意義。因此，加速谷子的育種進(jìn)程尤為重要。由于谷子只是區(qū)域重要性作物，因此當(dāng)前有關(guān)谷子的研究手段和方法相對(duì)較落后，如何應(yīng)用先進(jìn)科學(xué)的研究手段搞好谷子育種是ー個(gè)嚴(yán)峻的問題。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)，為谷子的遺傳研究及育種開辟了新的思路和手段。開發(fā)具有我國(guó)特色的重要性狀基因的分子標(biāo)記并進(jìn)行輔助選擇育種研究，將對(duì)提高我國(guó)谷子育種水平起到促進(jìn)作用。抽穗期決定著品種的種植地區(qū)和適應(yīng)的耕作制度，是農(nóng)作物育種的重要目標(biāo)性狀。抽穗期屬于數(shù)量性狀，其遺傳基礎(chǔ)較為復(fù)雜，一般認(rèn)為抽穗期是由主效基因和微效基因共同控制，其遺傳基礎(chǔ)的研究對(duì)指導(dǎo)育種實(shí)踐、品種改良及推廣均具有重要意義(黃成，姜樹坤，劉夢(mèng)紅等.水稻抽穗期的QTL剖祈.華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2009)。目前在抽穗期上研究比較多的是水稻，但對(duì)于谷子抽穗期的研究基本沒有文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種與谷子抽穗期基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。本發(fā)明的另ー目的是提供ー種可用于PCR擴(kuò)增與谷子抽穗期基因緊密連鎖的分子標(biāo)記的引物對(duì)，以及由該引物對(duì)擴(kuò)增獲得的分子標(biāo)記。本發(fā)明的再一目的是提供上述分子標(biāo)記在谷子抽穗期基因定位、檢測(cè)以及谷子輔助育種中的用途以及上述分子標(biāo)記的檢測(cè)方法。本發(fā)明的目的還包括提供ー種包括上述分子標(biāo)記的載體，以及含有該載體的重組細(xì)胞；提供ー種包括使用上述分子標(biāo)記的谷子抽穗期基因的定位方法，和使用所述分子標(biāo)記的谷子輔助育種方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案本發(fā)明公開了ー種與谷子抽穗期基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記含有Seq ID No. I所示序列；優(yōu)選的所述分子標(biāo)記具有SeqID No. I所示序列。本發(fā)明還公開了ー種擴(kuò)增與谷子抽穗期基因緊密連鎖的分子標(biāo)記的引物對(duì)，所述引物對(duì)的引物I含有Seq ID No. 2所示序列，引物2含有Seq ID No. 3所示序列；優(yōu)選的所述引物I具有Seq ID No. 2所不序列，引物2具有Seq ID No. 3所不序列；Seq ID No. 2 :5，-CCCTCTATGGTTTCATTTCC-3’ ；Seq ID No. 3 :5，-CATCGCACTAGCTCTGGCAT-3，。、
本發(fā)明還公開了一種與谷子抽穗期基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記是由上述的引物對(duì)以抽穗期為晚期的谷子基因組DNA為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的。優(yōu)選的由上述引物對(duì)擴(kuò)增得到的分子標(biāo)記含有Seq ID No. I所示序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述分子標(biāo)記(含有Seq ID No. I所示核苷酸序列的DNA片段)為谷子基因組中Seq ID No. I所示核苷酸序列的DNA片段，即所包含的SeqID No. I的5’端和/或3’端以外的核苷酸序列也是谷子基因組中的序列，優(yōu)選的，為谷子基因組中Seq ID No. I的5’端和/或3’端的上下游序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，只要擴(kuò)增或者檢測(cè)抽穗期為晚期的谷子基因組DNA中的該分子標(biāo)記，必然能夠檢測(cè)或擴(kuò)增得到含有Seq ID No. I所示的序列。Seq IDNo. I的5’端和/或3’端的上下游序列的長(zhǎng)度 為適當(dāng)長(zhǎng)度，并不特別限定，例如，滿足分子標(biāo)記的長(zhǎng)度小于10，OOObp、小于5，OOObp、小于2，OOObp、小于 I, 500bp、小于 I, 200bp、小于 I, OOObp、或者小于 800bp。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述分子標(biāo)記(含有Seq ID No. I所示核苷酸序列的DNA片段)所包含的Seq ID No. I的5’端和/或3’端可操作地連接有人工序列和/或控制序列，例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子、酶切位點(diǎn)、引物序列等等。其中，術(shù)語“可操作地”在本發(fā)明中定義為一種如下構(gòu)象，在該構(gòu)象中，控制序列例如啟動(dòng)子被適當(dāng)?shù)刂糜赟eq IDNo. I的一個(gè)位置上，以致該控制序列指導(dǎo)Seq ID No. I編碼的多肽的產(chǎn)生。本發(fā)明還公開了一種載體，其含有本發(fā)明的分子標(biāo)記。所述載體可以是插入有本發(fā)明的分子標(biāo)記的表達(dá)載體或者克隆載體。獲得上述載體后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，根據(jù)不同的需要，將載體轉(zhuǎn)化到合適的細(xì)胞中，得到含有該載體的重組細(xì)胞。因此，本發(fā)明還公開了一種含有所述重組載體的重組細(xì)胞。本發(fā)明還公開了本發(fā)明的分子標(biāo)記的制備方法，包括下述步驟使用抽穗期為晚期的谷子的基因組DNA作為模板，以上述引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的602bp擴(kuò)增產(chǎn)物即含有所述分子標(biāo)記；優(yōu)選地，還包括將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化的步驟。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，可以理解，也可以DNA化學(xué)合成的方法得到本發(fā)明的分子標(biāo)記。本發(fā)明還公開了所述分子標(biāo)記的檢測(cè)方法，包括步驟根據(jù)上述分子標(biāo)記的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，以被檢測(cè)谷子基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，并判斷擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在該分子標(biāo)記。優(yōu)選的，所述引物為上述分別含有Seq ID No. 2和Seq ID No. 3的引物對(duì)。例如，可以以被檢測(cè)谷子的基因組DNA為模板，以上述引物(SeqID No. 2和Seq IDNo. 3)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物?？梢詫⒌玫降臄U(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序或者凝膠電泳。本發(fā)明還公開了所述的分子標(biāo)記在谷子抽穗期基因定位或檢測(cè)中的用途。本發(fā)明還公開了一種谷子抽穗期基因定位的方法，所述方法包括使用本發(fā)明的分子標(biāo)記的步驟。本發(fā)明還公開了所述的分子標(biāo)記在谷子輔助育種中的用途。本發(fā)明還公開了一種谷子輔助育種方法，所述方法包括檢測(cè)本發(fā)明的分子標(biāo)記或分子標(biāo)記引物對(duì)的步驟。本發(fā)明的分子標(biāo)記可用于今后的分子標(biāo)記輔助育種中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，比如通過檢測(cè)是否存在本發(fā)明的分子標(biāo)記來篩選谷子是否含有控制抽穗期為晚期的抽穂期基因(例如，可以參考，DNA分子標(biāo)記在小麥抗病育種中的用途，隴東學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2006年4月第16卷第I期，P65-69)。所述檢測(cè)可以是PCR檢測(cè)的方法，具體地，可以使用上述的本發(fā)明的分子標(biāo)記的引物對(duì)。所述檢測(cè)還可以通過測(cè)序方法進(jìn)行。該谷子輔助育種方法具有簡(jiǎn)便、快速、高通量的優(yōu)點(diǎn)。在本發(fā)明中，具體地，所述谷子可以為張谷I號(hào)、谷子A2不育系、張雜谷3號(hào)、或張雜谷3號(hào)自交產(chǎn)生的F2代。其中，張谷I號(hào)、張雜谷3號(hào)或張雜谷3號(hào)自交產(chǎn)生的部分F2代抽穗期為晚期；谷子A2不育系、張雜谷3號(hào)自交產(chǎn)生的部分F2代抽穗期為早期。由于采用以上技術(shù)方案，使本發(fā)明具備的有益效果在于本發(fā)明提供了與谷子抽穗期基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記將基因組DNA序列與谷子抽穗期基因聯(lián)系起來，有利于谷子分子標(biāo)記輔助育種體系的建立；所述分子標(biāo)記與谷子抽穗期基因的遺傳緊密連鎖距離為3. 5cM。本發(fā)明的分子標(biāo)記及分子標(biāo)記擴(kuò)增引物可以簡(jiǎn)便、快速、高通量地應(yīng)用于谷子育種實(shí)踐和資源及品種鑒定。


圖I :分子標(biāo)記引物(Seq ID No. 2和Seq ID No. 3)對(duì)F2代480個(gè)單株擴(kuò)增的部·分結(jié)果。其中泳道1-12為F2代中12株谷子抽穗期為晚期的單株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道13_24為F2代中12株抽穗期為早期的單株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。泳道M為marker，其為IOObpDNALadder ;其分子量包括:、1500bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp 以及 IOObp0
具體實(shí)施例方式本發(fā)明公開了一種引物對(duì)以及與谷子抽穗期基因緊密連鎖的分子標(biāo)記SIsv0832。利用本發(fā)明的引物對(duì)，以谷子基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，可以得到與谷子抽穗期基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記在本發(fā)明中命名為分子標(biāo)記SIsv0832。需要指出的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，除了通過上述PCR擴(kuò)增獲得本發(fā)明的分子標(biāo)記外，還可以通過化學(xué)合成獲得本發(fā)明的分子標(biāo)記。本發(fā)明的引物對(duì)分別含有序列表Seq ID No. 2和Seq ID No. 3所示序列，Seq ID No. 2 :5，-CCCTCTATGGTTTCATTTCC-3，；Seq ID No. 3 :5，-CATCGCACTAGCTCTGGCAT-3，。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，在上述Seq ID No. 2和Seq ID No. 3所示序列中，可在其5 ’端或3’端分別增加I 10個(gè)堿基，所增加的堿基類型可根據(jù)谷子基因組DNA上與Seq IDNo. 2和Seq ID No. 3相匹配區(qū)域的堿基類型并依據(jù)堿基配對(duì)原則來確定，由此得到的引物對(duì)與Seq IDNo. 2和Seq ID No. 3的擴(kuò)增產(chǎn)物基本相同(上游和下游引物之間的DNA序列相同)。因此，上述在Seq ID No. 2和Seq ID No. 3的5’端或3’端分別增加I 10個(gè)堿基并能擴(kuò)增得到基本相同DNA片段的引物對(duì)，均包括在本發(fā)明的引物對(duì)中。在本發(fā)明具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明的引物對(duì)優(yōu)選為Seq ID No. 2和Seq ID No. 3所示序列?！愎茸臃N子從萌發(fā)到抽穗需要70天左右，在本發(fā)明中，所述抽穗期晚期是指抽穗比一般谷子晚10天左右，抽穗期早期是指抽穗比一般谷子早10天左右。本發(fā)明將父本抽穗期晚期和母本抽穗期早期的純合子雜交，獲得Fl代(張雜谷3號(hào))，再以Fl代自交產(chǎn)生F2代群體，共480個(gè)單株。優(yōu)選的采用SV分子標(biāo)記開發(fā)方法，首先對(duì)父本進(jìn)行de novo測(cè)序(60X contigN50 22K, scaffold N50 320K ;Total size :400Mb)，母本重測(cè)序(10X);然后根據(jù)父母本測(cè)序數(shù)據(jù)，利用華大自主開發(fā)的SOAP軟件比較父母本之間的序列差異，分別在父本差異序列的5’端和3’端外側(cè)約50bp位置，隨機(jī)選取20bp左右的長(zhǎng)度設(shè)計(jì)差異序列擴(kuò)增的引物，根據(jù)不同的差異序列設(shè)計(jì)了 1105對(duì)引物。以父母本及Fl的DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，從1105對(duì)引物中篩選出616對(duì)具有多態(tài)性和有效性的引物。采用開發(fā)出的616對(duì)引物，對(duì)F2群體的480個(gè)個(gè)體進(jìn)行PCR檢測(cè)，并進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，用Map Maker3. O軟件進(jìn)行遺傳圖譜繪制，得到本發(fā)明所述的與抽穗期基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，及其擴(kuò)增引物。采用篩選出的引物對(duì)擴(kuò)增得到的父本序列，即本發(fā)明中的分子標(biāo)記SIsv0832。對(duì)F2個(gè)體進(jìn)行性狀分析，井根據(jù)基因性狀數(shù)據(jù)和表型性狀數(shù)據(jù)將谷子抽穗期基因定位在遺傳圖譜上。下面通過具體實(shí)施例并結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)ー步詳細(xì)說明。以下實(shí)施例僅僅對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說明，不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例I :谷子F2代分離群體的構(gòu)建父本抗拿捕凈，株型高，旗葉長(zhǎng)而窄，剛毛紅色，穎殼紅色，可育，葉色偏緑，花粉黃白色，抽穗期為晚期。父本為張谷I號(hào)種子。母本不抗拿捕凈，株型矮，旗葉短而寬，剛毛綠色，穎殼綠色，部分不育，葉色偏黃，花粉棕色，抽穗期為早期。母本為谷子A2不育系種子。F2群體構(gòu)建父本和母本雜交得到Fl代(Fl抽穗期為晚期)，F(xiàn)l自交得到F2。其中Fl是張雜谷3號(hào)種子。共得F2代單株480株，上述張谷I號(hào)種子、谷子A2不育系種子及張雜谷3號(hào)種子可參見中國(guó)專利申請(qǐng)《與谷子抗除草劑基因緊密連鎖的分子標(biāo)記SIsv0372》，
發(fā)明者倪雪梅, 全志武, 夏秋菊, 張耕耘 申請(qǐng)人:深圳華大基因科技有限公司