本發(fā)明屬于微生物培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種適用于醋酸桿菌屬和葡萄糖桿菌屬的鑒別培養(yǎng)基及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

醋酸桿菌屬和葡萄糖桿菌屬廣泛存在于自然界中，是食醋、醋酸和大曲白酒工業(yè)中的重要微生物，也是葡萄酒、啤酒工業(yè)中常見的污染菌。醋酸桿菌屬和葡萄糖桿菌屬是嚴格的好氧菌，繁殖速度快，產(chǎn)酸能力和耐酸能力強，可將酒精迅速氧化為醋酸，并且分解醋酸和其它有機酸的能力弱，可在較高溫度下生長、發(fā)酵，使酒精充分轉(zhuǎn)化為醋酸。

隨著人們生活水平的提高，對發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)的要求與日俱增，醋酸桿菌屬和葡萄糖桿菌屬微生物是決定食醋、大曲白酒產(chǎn)量與質(zhì)量的主要菌種，良好菌種的分離、篩選與選育，是提高原料利用率、提高質(zhì)量、增進感官接受性的基礎(chǔ)，也是菌種固定化、先進生產(chǎn)工藝應(yīng)用的基礎(chǔ)。另外，醋酸菌污染水平的監(jiān)控對葡萄酒、啤酒工業(yè)的意義重大。因此，建立快速高效的醋酸桿菌屬和葡萄糖桿菌屬微生物分離、檢驗和鑒別技術(shù)在食醋、葡萄酒等發(fā)酵工業(yè)中具有重要地位，是決定發(fā)酵產(chǎn)品過程成敗的關(guān)鍵，對于提高發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)具有重大意義。

目前，醋酸菌的分離通常在以酵母膏和葡萄糖配成的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加酒精、醋酸、碳酸鈣的瓊脂培養(yǎng)基中進行，這些瓊脂平板只能分離出產(chǎn)酸、耐酸或耐乙醇細菌，而是否為醋酸菌還需要進行醋酸液體發(fā)酵定性實驗、生理生化實驗等一系列實驗來檢驗和鑒別，時間長達5-7天，存在耗時、費力等缺點。另外，16srrna序列分析和midi微生物鑒定系統(tǒng)等技術(shù)雖然已經(jīng)在醋酸菌的檢驗、鑒定中有所應(yīng)用，但這些技術(shù)對儀器設(shè)備要求高、成本高、周期長，還無法在發(fā)酵調(diào)味品、葡萄酒等企業(yè)和科研機構(gòu)中廣泛應(yīng)用推廣。因此，快速、高效、準確、廉價的醋酸桿菌屬和葡萄糖桿菌屬鑒別培養(yǎng)基的開發(fā)受到食醋、大曲白酒、葡萄酒等發(fā)酵工業(yè)和醋酸菌研究學(xué)者的高度關(guān)注。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種適于醋酸桿菌屬和葡萄糖桿菌屬的檢測和計數(shù)用鑒別培養(yǎng)基及其應(yīng)用，所述培養(yǎng)基能準確鑒別醋酸桿菌屬和葡萄糖桿菌屬，可作為醋酸桿菌屬和葡萄糖桿菌屬分離培養(yǎng)基、檢測培養(yǎng)基和計數(shù)培養(yǎng)基，廣泛應(yīng)用于食醋、大曲白酒、醋酸、葡萄酒等行業(yè)及其研究領(lǐng)域。

本發(fā)明提供了一種醋酸桿菌屬和葡萄糖桿菌屬快速鑒別培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基中的檢測的功能性成分為酵母膏、葡萄糖、無機鹽、乙醇和放線菌酮；

其中酵母膏、葡萄糖、無機鹽、乙醇和放線菌酮的濃度滿足體系中乙酸濃度達到1ng時就呈現(xiàn)紅色。

作為實施例的優(yōu)選，酵母膏、葡萄糖、無機鹽、乙醇和放線菌酮的一種具體濃度為酵母膏1～1.5％、葡萄糖1～1.5％、無機鹽1.49～3.15％、乙醇3～5％、放線菌酮50～200μg/ml。

所述的無機鹽為氯化鐵、氯化鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂和碳酸鈣中的任一種或幾種。

所述培養(yǎng)基，其一種具體組成如下：酵母膏1～1.5％、葡萄糖1～1.5％、碳酸鈣1～2％、氯化鐵0.05～0.25％、氯化鈉0.2～0.3％、乙醇3～5％、放線菌酮50～200μg/ml、磷酸氫二鉀0.04～0.1％、硫酸鎂0.2～0.5％、瓊脂1.5～2.0％。

本發(fā)明的醋酸桿菌屬和葡萄糖桿菌屬鑒別培養(yǎng)基，其ph值為4.0～4.5。

本發(fā)明的培養(yǎng)基可應(yīng)用于食醋、醋酸、大曲白酒、葡萄酒、啤酒行業(yè)的醋酸桿菌屬和葡萄糖桿菌屬的檢測應(yīng)用；其一種具體操作方法如下：

1)配制醋酸桿菌屬和葡萄糖桿菌屬鑒別培養(yǎng)基；

2)取10g或10ml樣品，放入盛有90ml帶有玻璃珠的無菌水三角瓶中，搖振20分鐘混勻，為10^-1稀釋度，然后，從10^-1稀釋度中吸取1ml放入盛有9ml無菌水的試管種，為10^-2稀釋度，以此類推，制成不同稀釋度的樣品稀釋液；

3)取3個稀釋梯度，分別涂布于醋酸桿菌屬和葡萄糖桿菌屬鑒別培養(yǎng)基，于30℃培養(yǎng)36-48h，菌落呈現(xiàn)紅色的菌落為醋酸桿菌屬和葡萄糖桿菌屬。

本發(fā)明的培養(yǎng)基可實現(xiàn)36-48h分離鑒別醋酸桿菌屬和葡萄糖桿菌屬，縮短分離鑒別時間72-120h，使篩選和計數(shù)更加快速便捷。

本發(fā)明培養(yǎng)基的組分在檢測醋酸桿菌屬和葡萄糖桿菌屬菌落時呈現(xiàn)特征紅色，提高分離鑒別的效果。而且本發(fā)明添加氯化鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂作為鑒別培養(yǎng)基的成分，縮短醋酸桿菌屬和葡萄糖桿菌屬菌落呈色時間，提高分離鑒別的效率。本發(fā)明添加碳酸鈣作為鑒別培養(yǎng)基的成分，可用于高產(chǎn)乙酸的醋酸桿菌屬和葡萄糖桿菌屬分離鑒別，適用于食醋、醋酸行業(yè)。

附圖說明

圖1：醋酸桿菌屬和葡萄糖桿菌屬培養(yǎng)基鑒別實驗圖，其中1為巴氏醋酸桿菌滬釀1.01；2為植物乳桿菌；

圖2：醋酸桿菌屬和葡萄糖桿菌屬培養(yǎng)基醋醅應(yīng)用實驗圖；

圖3：實施例2的檢測圖。

具體實施方式

下面通過實施例的方式進一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實施例范圍中。

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，醋酸桿菌屬和葡萄糖桿菌屬的檢測分析易與乳酸菌等其他產(chǎn)酸細菌產(chǎn)生混淆。建立的鑒別培養(yǎng)基可以準確鑒別醋酸桿菌屬和葡萄糖桿菌，呈現(xiàn)特征紅色且無透明圈，而乳酸菌等其他產(chǎn)酸細菌菌落不呈現(xiàn)紅色且部分產(chǎn)生透明圈。

實施例1：醋酸桿菌屬和葡萄糖桿菌屬培養(yǎng)基鑒別實驗

1、菌株

巴氏醋酸桿菌滬釀1.01(acetobacterpasteurianushuniang1.01)。

植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)

2、培養(yǎng)基

(1)傳統(tǒng)分離培養(yǎng)基：酵母粉1％，葡萄糖1％，碳酸鈣2％，瓊脂1.5～2.0％，ph4.5，121℃滅菌15min。

(2)醋酸桿菌屬和葡萄糖桿菌屬鑒別培養(yǎng)基：酵母膏1～1.5％，葡萄糖1～1.5％，碳酸鈣1～2％，氯化鐵0.05～0.25％，氯化鈉0.2～0.3％，磷酸氫二鉀0.04～0.1％，硫酸鎂0.2～0.5％，瓊脂1.5～2.0％，ph4.0～4.5，121℃滅菌15min。在滅菌后加入乙醇3～5％，放線菌酮50～200μg/ml。

3、篩選

取巴氏醋酸桿菌滬釀1.01和植物乳桿菌斜面，分別將滬釀1.01和植物乳桿菌接種于傳統(tǒng)分離培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基，于30℃培養(yǎng)36-48h，在傳統(tǒng)分離培養(yǎng)基平板上滬釀1.01和植物乳桿菌生長后形成的透明圈，而在醋酸桿菌屬和葡萄糖桿菌屬鑒別培養(yǎng)基上滬釀1.01生長后菌落呈現(xiàn)特征性紅色(圖1)，植物乳桿菌生長后形成透明圈。

實施例2：醋酸桿菌屬和葡萄糖桿菌屬鑒別培養(yǎng)基在固體醋醅中醋酸菌分離、檢測和計數(shù)應(yīng)用實驗

1、培養(yǎng)基：

(1)醋酸桿菌屬和葡萄糖桿菌屬鑒別培養(yǎng)基：酵母膏1～1.5％，葡萄糖1～1.5％，碳酸鈣1～2％，氯化鐵0.05～0.25％，氯化鈉0.2～0.3％，磷酸氫二鉀0.04～0.1％，硫酸鎂0.2～0.5％，瓊脂1.5～2.0％，ph4.0～4.5，121℃滅菌15min。在滅菌后加入乙醇3～5％，放線菌酮50～200μg/ml。

(2)醋酸發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖1％，酵母膏1％，ph4.5，121℃滅菌15min。在滅菌后加入乙醇5％。

2、固體醋醅處理

稱取固體醋醅10g，放入盛有90ml帶有玻璃珠的無菌水三角瓶中，搖振20分鐘混勻，為10^-1稀釋度，然后，從10^-1稀釋度中吸取1ml放入盛有9ml無菌水的試管種，為10^-2稀釋度，以此類推，制成不同稀釋度的固體醋醅溶液。

3、固體醋醅中醋酸菌分離實驗

取固體醋醅稀釋梯度，分別涂布于醋酸桿菌屬和葡萄糖桿菌屬鑒別培養(yǎng)基，于30℃培養(yǎng)36-48h，在醋酸桿菌屬和葡萄糖桿菌屬鑒別培養(yǎng)基上長出兩類細菌菌落，一類菌落呈現(xiàn)紅色；第二類菌落無紅色(圖2)。

4、醋酸發(fā)酵驗證實驗

對醋酸桿菌屬和葡萄糖桿菌屬鑒別培養(yǎng)基上細菌菌落共76株菌株(無紅色菌落菌株數(shù)43個，紅色菌落菌株數(shù)33個)，分別接入100ml醋酸發(fā)酵培養(yǎng)基，于30℃培養(yǎng)96h后，利用高效液相色譜法檢測發(fā)酵液中醋酸進行定性，測定條件：示差折光檢測器，aminexhpx-87h色譜柱，檢測器溫度45℃，柱溫65℃，流動相5mmol/l硫酸，流速0.6ml/min，20μl進樣量。醋酸發(fā)酵和醋酸檢測均設(shè)置3個平行。(表1)

表1醋酸發(fā)酵驗證實驗

從本實驗結(jié)果來看，醋酸桿菌屬和葡萄糖桿菌屬鑒別培養(yǎng)基上33株產(chǎn)生紅色菌落的菌株均能利用乙醇產(chǎn)乙酸，為醋酸桿菌屬和葡萄糖桿菌屬；醋酸桿菌屬和葡萄糖桿菌屬鑒別培養(yǎng)基上43株無紅色菌落的菌株均不能利用乙醇產(chǎn)乙酸，不是醋酸桿菌屬和葡萄糖桿菌屬細菌。該鑒別培養(yǎng)基僅需要36-48h就可以實現(xiàn)醋酸桿菌屬和葡萄糖桿菌屬的分離鑒別，比傳統(tǒng)醋酸菌分離鑒別方法縮短了3-5天，具有快速、高效、準確、廉價的特點。

從本實驗結(jié)果來看，固體醋醅中醋酸菌數(shù)量為3.6×10⁴cfu/g。

實施例2：醋酸桿菌屬和葡萄糖桿菌屬鑒別培養(yǎng)基葡萄酒中醋酸菌分離、檢測和計數(shù)應(yīng)用實驗

1、培養(yǎng)基：

醋酸桿菌屬和葡萄糖桿菌屬鑒別培養(yǎng)基；

醋酸發(fā)酵培養(yǎng)基；

2、固體醋醅處理

稱取葡萄酒發(fā)酵液10ml，放入盛有90ml帶有玻璃珠的無菌水三角瓶中，搖振20分鐘混勻，為10^-1稀釋度，然后，從10^-1稀釋度中吸取1ml放入盛有9ml無菌水的試管種，為10^-2稀釋度，以此類推，制成不同稀釋度的葡萄酒溶液。

3、固體醋醅中醋酸菌檢測和計數(shù)實驗

取葡萄酒稀釋梯度，分別涂布于醋酸桿菌屬和葡萄糖桿菌屬鑒別培養(yǎng)基，于30℃培養(yǎng)36-48h，在醋酸桿菌屬和葡萄糖桿菌屬鑒別培養(yǎng)基上長出兩類細菌菌落，一類菌落呈現(xiàn)紅色；第二類菌落無紅色(圖3)。

4、醋酸發(fā)酵驗證實驗

對醋酸桿菌屬和葡萄糖桿菌屬鑒別培養(yǎng)基上細菌菌落共69株菌株(無紅色菌落菌株數(shù)24個，紅色菌落菌株數(shù)45個)，分別接入100ml醋酸發(fā)酵培養(yǎng)基，于30℃培養(yǎng)96h后，利用高效液相色譜法檢測發(fā)酵液中醋酸進行定性，測定條件：示差折光檢測器，aminexhpx-87h色譜柱，檢測器溫度45℃，柱溫65℃，流動相5mmol/l硫酸，流速0.6ml/min，20μl進樣量。醋酸發(fā)酵和醋酸檢測均設(shè)置3個平行。

從本實驗結(jié)果來看，醋酸桿菌屬和葡萄糖桿菌屬鑒別培養(yǎng)基上45株產(chǎn)生紅色菌落的菌株100％產(chǎn)乙酸，均為醋酸桿菌屬和葡萄糖桿菌屬。醋酸桿菌屬和葡萄糖桿菌屬鑒別培養(yǎng)基上24株無紅色菌落的菌株均不能利用乙醇產(chǎn)乙酸，不是醋酸桿菌屬和葡萄糖桿菌屬細菌。從本實驗結(jié)果來看，葡萄酒發(fā)酵液中醋酸菌數(shù)量為1.2×10²cfu/ml。