本發(fā)明提供一種雙重等位基因特異性聚合酶鏈鎖反應(yīng)的方法，特別是一種用于辨識(shí)核苷酸基因多型性的基因型鑒定芯片的雙重等位基因特異性聚合酶鏈鎖反應(yīng)的方法。

背景技術(shù)：

人體的基因體包含各種遺傳變異，其中單一核苷酸多型性(singlenucleotidepolymorphism，snp)是常被發(fā)現(xiàn)的遺傳變異。單一核苷酸多型性上不同的核苷酸，可能會(huì)改變蛋白質(zhì)的形狀，影響基因的調(diào)控反應(yīng)，進(jìn)而造成各種遺傳性疾病。

近年來(lái)，高通量的微數(shù)組芯片技術(shù)已被廣泛的應(yīng)用于個(gè)體差異性檢測(cè)、比較基因體相關(guān)分析、連鎖不平衡或藥物代謝基因相關(guān)等研究中。然而，高通量的微數(shù)組芯片技術(shù)在進(jìn)行芯片雜交的前處理步驟相當(dāng)耗時(shí)，且芯片掃描后要得到上萬(wàn)個(gè)snp數(shù)據(jù)的判讀過(guò)程復(fù)雜，同時(shí)，該技術(shù)的儀器及耗材購(gòu)置成本相當(dāng)昂貴。而實(shí)時(shí)聚合酶鏈鎖反應(yīng)(real-timepolymerasechainreaction)具有較高的專(zhuān)一性、敏感度及準(zhǔn)確度，但該技術(shù)需要針對(duì)個(gè)別snp位點(diǎn)訂制的特殊修飾探針的制作成本昂貴，導(dǎo)致整體檢測(cè)技術(shù)的成本較高，不利用于大規(guī)模的snp位點(diǎn)檢測(cè)。因此，目前現(xiàn)有技術(shù)缺乏一種有效、快速、較大規(guī)模的檢測(cè)單一核苷酸變異的技術(shù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的一目的在于提供一種用于辨識(shí)核苷酸基因多型性的基因型鑒定芯片的雙重等位基因特異性(allelespecific)聚合酶鏈鎖反應(yīng)的方法，包含：(a)利用一對(duì)以上的引物組并藉由多重單一核苷酸多型性聚合酶鏈鎖反應(yīng)(multiplexsnppcr)擴(kuò)增(amplify)待測(cè)核酸樣本以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，其中該聚合酶鏈鎖反應(yīng)中加入核酸螯合染劑，且該核酸螯合染劑為sybrgreen核苷酸染料；以及(b)以表面固定有辨識(shí)該等位基因特異性的探針(probe)的基因型鑒定芯片鑒定該擴(kuò)增產(chǎn)物，其中該引物組包含至少四條等位基因特異性引物，至少兩條等位基因特異性引物與該核酸樣本的正股(sensestrand)結(jié)合，且該等位基因特異性引物3’端終點(diǎn)與等位基因特異性位點(diǎn)互補(bǔ)，以及至少兩條等位基因特異性引物與該核酸樣本的反股(antisensestrand)結(jié)合，且該等位基因特異性引物3’端終點(diǎn)與等位基因特異性位點(diǎn)互補(bǔ)。

本發(fā)明的又一目的在于提供一種用于辨識(shí)核苷酸基因多型性的的基因型鑒定芯片的雙重等位基因特異性(allelespecific)聚合酶鏈鎖反應(yīng)的方法，包含：(a)利用一對(duì)以上的引物組并藉由多重單一核苷酸多型性聚合酶鏈鎖反應(yīng)(multiplexsnppcr)擴(kuò)增(amplify)待測(cè)核酸樣本以產(chǎn)生第一階段擴(kuò)增產(chǎn)物，其中該聚合酶鏈鎖反應(yīng)中加入核酸螯合染劑，且該核酸螯合染劑為sybrgreen核苷酸染料；(b)利用5’端具有修飾標(biāo)記的通用聚合酶鏈鎖反應(yīng)引物(universalpcrprimer)擴(kuò)增該第一階段擴(kuò)增產(chǎn)物以產(chǎn)生第二階段擴(kuò)增產(chǎn)物；以及(c)以表面固定有辨識(shí)該等位基因特異性的探針(probe)的基因型鑒定芯片鑒定該擴(kuò)增產(chǎn)物，其中該引物組序列包含兩區(qū)域，5’端區(qū)域?yàn)橐煌ㄓ镁酆厦告滄i反應(yīng)引物序列區(qū)域，3’端區(qū)域?yàn)榈任换蛱禺愋砸飬^(qū)域；其中引物組包含至少四條等位基因特異性引物，至少兩條等位基因特異性引物與該核酸樣本的正股(sensestrand)結(jié)合，且該等位基因特異性引物3’端終點(diǎn)與等位基因特異性位點(diǎn)互補(bǔ)，以及至少兩條等位基因特異性引物與該核酸樣本的反股(antisensestrand)結(jié)合，且該等位基因特異性引物3’端終點(diǎn)與等位基因特異性位點(diǎn)互補(bǔ)。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種與核酸染料搭配使用的雙重等位基因特異性(allelespecific)聚合酶鏈鎖反應(yīng)的引物對(duì)，包含：該引物對(duì)包含四條等位基因特異性引物，其中兩條等位基因特異性引物與核酸樣本的正股(sensestrand)結(jié)合，且該等位基因特異性引物3’端終點(diǎn)與等位基因特異性位點(diǎn)互補(bǔ)，以及至少兩條等位基因特異性引物與該核酸樣本的反股(antisensestrand)結(jié)合，且該等位基因特異性引物3’端終點(diǎn)與等位基因特異性位點(diǎn)互補(bǔ)。在本發(fā)明的一實(shí)施例中，該引物對(duì)是應(yīng)用于基因型鑒定芯片。

本發(fā)明的再一目的在于提供一種與核酸螯合染劑搭配的雙重等位基因特異性聚合酶鏈鎖反應(yīng)的引物對(duì)，包含：所述引物對(duì)包含四條等位基因特異性引物，其中兩條等位基因特異性引物與核酸樣本的正股結(jié)合，且所述等位基因特異性引物3’端終點(diǎn)與等位基因特異性位點(diǎn)互補(bǔ)，以及至少兩條等位基因特異性引物與該核酸樣本的反股(antisensestrand)結(jié)合，且所述等位基因特異性引物3’端終點(diǎn)與等位基因特異性位點(diǎn)互補(bǔ)，引物對(duì)的5’端區(qū)域?yàn)橐煌ㄓ镁酆厦告滄i反應(yīng)引物序列區(qū)域。

在本發(fā)明的一實(shí)施例中，所述核酸螯合染劑為sybrgreen核酸染料。

在本發(fā)明的一實(shí)施例中，其中該引物對(duì)具有接近的熔解溫度(meltingtemperature，tm)值。

在本發(fā)明的一實(shí)施例中，其中該修飾標(biāo)記是為熒光、生物素(biotin)、毛地黃皂甘配基(digoxigenin，dig)或寡核酸序列。

在本發(fā)明的一實(shí)施例中，其中該基因型鑒定芯片是以芯片熒光掃描儀進(jìn)行檢測(cè)。

在本發(fā)明的一實(shí)施例中，其中該核酸樣本是存在于選自于由血液、血清、血漿、體液及組織所組成群組。

在本發(fā)明的一實(shí)施例中，其中該引物組的通用聚合酶鏈鎖反應(yīng)引物序列區(qū)域與等位基因特異性引物區(qū)域之間可進(jìn)一步加上密碼(barcode)序列，且該探針包含該密碼序列的互補(bǔ)序列。

因此，本發(fā)明提供一種用于辨識(shí)核苷酸基因多型性的基因型鑒定芯片的雙重等位基因特異性(allelespecific)聚合酶鏈鎖反應(yīng)的方法，結(jié)合sybrgreen核酸染料進(jìn)行多重單一核苷酸多型性聚合酶鏈鎖反應(yīng)(multiplexsnppcr)，再以基因型鑒定芯片檢測(cè)放大產(chǎn)物。本發(fā)明方法所使用的正向(forward)與反向引物(reverse)皆以等位基因特異性位點(diǎn)為引物的3’端終點(diǎn)，不須使用特殊堿基的引物，并能容易的直接依等位基因特異性位點(diǎn)兩旁的序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，故本發(fā)明的方法是不須使用特殊合成引物且引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單的應(yīng)用于基因型鑒定芯片檢測(cè)的方法，并具有同時(shí)檢測(cè)多個(gè)等位基因特異性位點(diǎn)的優(yōu)點(diǎn)。

以下將配合圖式進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式，下述所列舉的實(shí)施例是用以闡明本發(fā)明，并非用以限定本發(fā)明的范圍，任何熟習(xí)此技藝者，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，當(dāng)可做些許更動(dòng)與潤(rùn)飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)視后附的申請(qǐng)專(zhuān)利范圍所界定者為準(zhǔn)。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明的雙重等位基因特異性引物(doubleallelespecificprimer)設(shè)計(jì)的示意圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供一種用于辨識(shí)核苷酸基因多型性的基因型鑒定芯片的雙重等位基因特異性(allelespecific)聚合酶鏈鎖反應(yīng)的方法，其是使用的正向(forward)與反向引物(reverse)皆以等位基因特異性位點(diǎn)為引物的3’端終點(diǎn)，不須使用特殊堿基的引物，并能容易的直接依等位基因特異性位點(diǎn)兩旁的序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，并且結(jié)合螯合試劑(interchelatingagent)進(jìn)行多重(multiplex)聚合酶鏈鎖反應(yīng)，再以單一核苷酸(singlenucleotidepolymorphism，snp)芯片進(jìn)行檢測(cè)。

定義

本文中所述的核酸為dna或rna分子。

本文中所述的核苷酸為核酸的基本組成單位。

實(shí)施例1本發(fā)明的引物設(shè)計(jì)

本發(fā)明的用于辨識(shí)核苷酸基因多型性的基因型鑒定芯片的雙重等位基因特異性聚合酶鏈鎖反應(yīng)方法，分別進(jìn)行等位基因特異性位點(diǎn)的第一階段擴(kuò)增反應(yīng)以及通用引物(universalprimer)的第二階段擴(kuò)增反應(yīng)；再以一表面固定有辨識(shí)探針(probe)的微數(shù)組芯片區(qū)別該等位基因特異性位點(diǎn)的放大產(chǎn)物。

本發(fā)明的方法主要的技術(shù)特征在于雙重等位基因特異性引物的設(shè)計(jì)，相較于傳統(tǒng)聚合酶鏈鎖反應(yīng)是利用正向引物與變異性位點(diǎn)一端的一條dna模板鏈互補(bǔ)，反向引物與變異性位點(diǎn)另一端的另一條dna模板鏈互補(bǔ)。本發(fā)明的方法所使用正向與反向引物皆以變異性位點(diǎn)為引物的3’端終點(diǎn)，不須使用特殊堿基的引物，直接依等位基因特異性位點(diǎn)兩側(cè)的序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。在本實(shí)施例中，本發(fā)明以5個(gè)snp位點(diǎn)作為舉例，包含rs29232、rs401681、rs667282、rs2072590以及rs2131877，但不限于此。需注意的是，一起進(jìn)行多重(multiplex)snp聚合酶鏈鎖反應(yīng)的引物需接近的熔解溫度(meltingtemperature，tm)值，tm公式＝4(g+c)+2(a+t)。

以rs29232為例，如圖1及表一所示，rs29232為a/g基因型變異，直接依該基因型變異的位點(diǎn)兩側(cè)的序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，正向引物(seqidno:1及seqidno:2)分別以變異性位點(diǎn)a或g為引物的3’端終點(diǎn)設(shè)計(jì)二條正向引物；反向引物(seqidno:3及seqidno:4)分別以變異性位點(diǎn)c或t為引物的3’端終點(diǎn)設(shè)計(jì)二條反向引物，分別使用二組引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)(at引物組及gc引物組)，不須使用特殊堿基的引物。其余snp變異性位點(diǎn)引物對(duì)，rs401681以seqidno:5至seqidno:8表示；rs667282以seqidno:9至seqidno:12表示；rs2072590以seqidno:13至seqidno:16表示；rs2131877以seqidno:17至seqidno:20。

關(guān)于第二階段擴(kuò)增反應(yīng)的通用引物，如表一所示，以5’端分別標(biāo)記不同熒光(cy3及cy5)的at通用引物(seqidno:21)及gc通用引物(seqidno:22)。

關(guān)于芯片上區(qū)別該snp變異性位點(diǎn)的放大產(chǎn)物的辨識(shí)探針，本發(fā)明以5’端具有氨基(amine)修飾的辨識(shí)rs29232探針(seqidno:23)、rs401681探針(seqidno:24)、rs667282探針(seqidno:25)、rs2072590探針(seqidno:26)以及rs2131877探針(seqidno:27)固定于芯片上進(jìn)行雜交(hybridization)反應(yīng)，但不限于此。

表一引物序列

關(guān)于用于芯片的擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物的標(biāo)記方式，包含特殊修飾堿基、特殊修飾引物以及化學(xué)修飾等方法，其中特殊修飾堿基是在擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，加入各種特殊修飾堿基，例如：biotin-dctp、cy5-dctp、aminoallyl-dctp等，或使用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(terminaldeoxynucleotidyltransferase)將特殊堿基加在擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物的3’端，例如直接使用以熒光修飾的dctp進(jìn)行第一階段的pcr擴(kuò)增反應(yīng)，便不需再進(jìn)行第二階段的pcr擴(kuò)增反應(yīng)。特殊引物修飾是在擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，加入各種特殊修飾引物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，例如在引物的5’端加上熒光、生物素(biotin)、毛地黃皂甘配基(digoxigenin，dig)或寡核酸序列修飾；化學(xué)修飾是在純化擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物之后，以化學(xué)熒光(如kreatech公司的uls^tm技術(shù))將熒光分子直接加在擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物的堿基上。

實(shí)施例2sybrgreen對(duì)等位基因特異性的辨識(shí)度的影響

本發(fā)明的以雙重等位基因特異性引物(doubleallelespecificprimers)的方法，結(jié)合螯合試劑(interchelatingagent)進(jìn)行第一階段擴(kuò)增反應(yīng)，可提升等位基因特異性的辨識(shí)度。

在本實(shí)施例中，本發(fā)明以sybrgreeni(sybrgreeni核酸染料，產(chǎn)品編號(hào)1988131，羅氏)作為螯合試劑，并且分別將sybrgreeni進(jìn)行：(1)25倍稀釋、(2)50倍稀釋、(3)100倍稀釋、(4)200倍稀釋、(5)400倍稀釋、(6)800倍稀釋、(7)1600倍稀釋、(8)3200倍稀釋、(9)6400倍稀釋。

在本實(shí)施例中，使用購(gòu)自美國(guó)coriell細(xì)胞存儲(chǔ)中心的dna樣本，分別為na12891及na18526；以rs29232進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并經(jīng)由數(shù)據(jù)庫(kù)已知na12891樣本的rs29232基因型為cc及na18526樣本的rs29232基因型為tt。rs29232分別包含：含有各5μmseqidno:1及seqidno:4的at引物對(duì)混合液，以及含有各5μmseqidno:2及seqidno:3的gc引物對(duì)混合液。

此外，本發(fā)明分別使用不同廠牌的sybrgreen擴(kuò)增反應(yīng)混合試劑包含：美國(guó)應(yīng)用生命系統(tǒng)公司(appliedbiosystems，abi)快速sybrgreen擴(kuò)增反應(yīng)混合試劑(fastsybrgreenmastermix，產(chǎn)品編號(hào)4385612)；以及美商伯瑞股份有限公司(bio-rad)iq^tmgreen擴(kuò)增反應(yīng)超級(jí)混合試劑(iq^tmgreensupermix，產(chǎn)品編號(hào)1708880)。

進(jìn)行實(shí)時(shí)(real-time)聚合酶鏈鎖反應(yīng)，反應(yīng)總體積為10μl，包含5μlsybrgreen擴(kuò)增反應(yīng)混合試劑、2μlsybr稀釋液、1μl引物對(duì)混合液、1.8μl水及0.2μl的gdna(50ng/μl)樣本。實(shí)時(shí)(real-time)聚合酶鏈鎖反應(yīng)器(cfxconnectreal-timepcrdetectionsystem，bio-rad)進(jìn)行，其反應(yīng)條件為：95℃反應(yīng)1分鐘，再以95℃，10秒、65℃，30秒為一循環(huán)，并重復(fù)此循環(huán)50次結(jié)束反應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果所得的ct值，經(jīng)由公式δct＝(at引物對(duì)的ct)-(gc引物對(duì)的ct)計(jì)算，使用abi快速sybrgreen擴(kuò)增反應(yīng)混合試劑的結(jié)果如表二所示。因所使用的兩個(gè)樣本基因型為cc(na12891)與tt(na18526)，cc基因型樣本的qpcr結(jié)果的gc引物對(duì)的ct會(huì)比at引物對(duì)的ct小，因此在公式計(jì)算結(jié)果會(huì)是正值，反之在tt基因型樣本的qpcr計(jì)算結(jié)果會(huì)是負(fù)值。數(shù)值絕對(duì)值越大，表示分辨效果越佳，在abisybrgreen的100倍稀釋的兩個(gè)數(shù)值的絕對(duì)值都很大，表示在兩種基因型的分辨效果都很好，但在50倍稀釋只有cc基因型樣本(na12891)絕對(duì)值數(shù)值很大，但tt基因型樣本(na18526)的絕對(duì)值很小，表示在此配方中只有cc基因型的分辨效果較佳，但tt基因型的分辨效果不佳，故100倍稀釋濃度的sybrgreen在abi快速sybrgreen擴(kuò)增反應(yīng)混合試劑的搭配效果最佳。使用bio-radiq^tmgreen擴(kuò)增反應(yīng)超級(jí)混合試劑的結(jié)果如表三所示，800-1600倍稀釋濃度的sybrgreen在bio-radiq^tmgreen擴(kuò)增反應(yīng)超級(jí)混合試劑的搭配效果最佳。其結(jié)果顯示雖不同擴(kuò)增反應(yīng)試劑所使用的最佳sybrgreen濃度不同，但使用sybrgreen確實(shí)可有效提升等位基因特異性的辨識(shí)度。

表二、使用abi快速sybrgreen擴(kuò)增反應(yīng)混合試劑的δct值

表三、使用bio-radiq^tmgreen擴(kuò)增反應(yīng)超級(jí)混合試劑的δct值

實(shí)施例3其他螯合試劑對(duì)等位基因特異性的辨識(shí)度的影響

申請(qǐng)人以其他螯合試劑gelred(gelred^tm核酸染料，產(chǎn)品編號(hào)89139-138，biotium)作為螯合試劑，并且分別將gelred進(jìn)行：(1)100倍稀釋、(2)200倍稀釋、(3)400倍稀釋、(4)800倍稀釋、(5)1600倍稀釋、(6)3200倍稀釋、(7)6400倍稀釋、(8)水。

在本實(shí)施例中，使用購(gòu)自美國(guó)coriell細(xì)胞存儲(chǔ)中心的dna樣本，分別為na12891及na18526；以rs29232進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并經(jīng)由數(shù)據(jù)庫(kù)已知na12891樣本的rs29232基因型為cc及na18526樣本的rs29232基因型為tt。rs29232分別包含：含有各5μmseqidno:1及seqidno:4的at引物對(duì)混合液，以及含有各5μmseqidno:2及seqidno:3的gc引物對(duì)混合液。

進(jìn)行實(shí)時(shí)(real-time)聚合酶鏈鎖反應(yīng)，反應(yīng)總體積為10μl，包含5μlabi快速sybrgreen擴(kuò)增反應(yīng)混合試劑、2μlgelred稀釋液、1μl引物對(duì)混合液、1.8μl水及0.2μl的gdna(50ng/μl)樣本。實(shí)時(shí)(real-time)聚合酶鏈鎖反應(yīng)器(cfxconnectreal-timepcrdetectionsystem，bio-rad)進(jìn)行，其反應(yīng)條件為：95℃反應(yīng)1分鐘，再以95℃，10秒、65℃，30秒為一循環(huán)，并重復(fù)此循環(huán)50次結(jié)束反應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果所得的ct值，經(jīng)由公式δct＝(at引物對(duì)的ct)-(gc引物對(duì)pair的ct)計(jì)算，結(jié)果如表四所示，如同實(shí)施例2的判斷方式，且gelred所有的測(cè)試結(jié)果都跟水差異不大，故gelred對(duì)等位基因特異性的辨識(shí)度效果不佳，顯示非所有的螯合試劑都能提高snp的辨識(shí)效果。

表四、使用gelred及abi快速sybrgreen擴(kuò)增反應(yīng)混合試劑的δct值

實(shí)施例4多重(multiplex)snp的辨識(shí)度

本發(fā)明確認(rèn)使用sybrgreen能有效提升等位基因特異性的辨識(shí)度后，進(jìn)行多重(multiplex)snp聚合酶鏈鎖反應(yīng)以進(jìn)一步確認(rèn)本發(fā)明的方法對(duì)多重snp的辨識(shí)效果。

在本實(shí)施例中，使用rs29232、rs401681、rs667582三種snp進(jìn)行檢測(cè)。其中at引物對(duì)混合物包含：各2.5μm的seqidno:1及seqidno:4(rs29232)、seqidno:6及seqidno:7(rs401681)、seqidno:10及seqidno:11(rs667582)。gc引物對(duì)混合液包含：各2.5μm的seqidno:2及seqidno:3(rs29232)、seqidno:5及8(rs401681)、seqidno:9及seqidno:12(rs667582)。

在本實(shí)施例中，使用購(gòu)自美國(guó)coriell細(xì)胞存儲(chǔ)中心的dna樣本，分別為na12891、na18526、na18526以及na18558，并經(jīng)由數(shù)據(jù)庫(kù)已知各樣本的基因型如表五所示。

表五、各樣本的基因型

進(jìn)行實(shí)時(shí)(real-time)聚合酶鏈鎖反應(yīng)，反應(yīng)總體積為10μl，包含5μlbio-radiq^tmgreen、0.67μlsybrgreen320倍稀釋液、2μl引物對(duì)混合液、2.83μl水及0.5μl的gdna(50ng/μl)樣本。實(shí)時(shí)(real-time)聚合酶鏈鎖反應(yīng)器(cfxconnectreal-timepcrdetectionsystem，bio-rad)進(jìn)行，其反應(yīng)條件為：95℃反應(yīng)1分鐘，再以95℃，10秒、65℃，30秒為一循環(huán)，并重復(fù)此循環(huán)50次結(jié)束反應(yīng)。

各樣本的實(shí)驗(yàn)結(jié)果皆與已知基因型結(jié)果一致，證實(shí)本發(fā)明用于基因型鑒定芯片的雙重等位基因特異性聚合酶鏈鎖反應(yīng)方法應(yīng)用于多重snp亦具有極高的準(zhǔn)確率。此外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果所得的ct值，經(jīng)由公式δct＝(at引物對(duì)的ct)-(gc引物對(duì)的ct)計(jì)算，結(jié)果如表六所示，sybrgreen確實(shí)可有效提升等位基因特異性的辨識(shí)度，且使用多重snp的辨識(shí)度效果佳。

表六、各樣本的δct值

實(shí)施例5基因型鑒定芯片測(cè)試

本發(fā)明的用于辨識(shí)核苷酸基因多型性的基因型鑒定芯片的雙重等位基因特異性聚合酶鏈鎖反應(yīng)方法，在本實(shí)施例中使用rs29232、rs401681、rs667582、rs2072590、rs2131877五種snp進(jìn)行進(jìn)行檢測(cè)，分別進(jìn)行snp變異性位點(diǎn)的第一階段擴(kuò)增反應(yīng)(使用seqidno:1至seqidno:20)以及通用引物的第二階段擴(kuò)增反應(yīng)(使用seqidno:21及seqidno:22)；再以表面固定有辨識(shí)探針(seqidno:23至seqidno:27)的微數(shù)組芯片區(qū)別該snp變異性位點(diǎn)的放大產(chǎn)物。

其中，at引物對(duì)混合物包含：各1.5μm的seqidno:1及seqidno:4(rs29232)、seqidno:6及seqidno:7(rs401681)、seqidno:10及seqidno:11(rs667582)、seqidno:14及seqidno:15(rs2072590)、seqidno:18及seqidno:19(rs2131877)。gc引物對(duì)混合液包含：各1.5μm的seqidno:2及seqidno:3(rs29232)、seqidno:5及seqidno:8(rs401681)、seqidno:9及seqidno:12(rs667582)、seqidno:13及seqidno:16(rs2072590)、seqidno:17及seqidno:20(rs2131877)。

在本實(shí)施例中，使用購(gòu)自美國(guó)coriell細(xì)胞存儲(chǔ)中心的dna樣本，分別為na12891、na18526、na18526以及na18559，并經(jīng)由數(shù)據(jù)庫(kù)已知各樣本的基因型如表七所示。

表七、各樣本的基因型

首先，進(jìn)行第一階段擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)總體積為10μl，包含5μlabi快速sybrgreen擴(kuò)增反應(yīng)混合試劑、1.5μlsybrgreen100倍稀釋液、1.5μl引物對(duì)混合液及2μl的gdna(50ng/μl)樣本。聚合酶連鎖反應(yīng)使用熱循環(huán)反應(yīng)器(pcrsystem9700，abi)進(jìn)行，其反應(yīng)條件為：95℃反應(yīng)1分鐘，再以95℃，10秒、65℃，30秒為一循環(huán)，并重復(fù)此循環(huán)16次，最后降至4℃結(jié)束反應(yīng)。

接著，進(jìn)行第二階段擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)總體積為30μl，包含10μl第一階段擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物、10μlabi快速sybrgreen擴(kuò)增反應(yīng)混合試劑、1μl通用引物(10μm)、9μl水；其中at通用引物(seqidno:21)及gc通用引物(seqidno:22)分別于兩個(gè)反應(yīng)中進(jìn)行，代號(hào)分別為a及b。聚合酶連鎖反應(yīng)使用熱循環(huán)反應(yīng)器(pcrsystem9700，abi)進(jìn)行，其反應(yīng)條件為：95℃反應(yīng)1分鐘，再以95℃，10秒、70℃，30秒為一循環(huán)，并重復(fù)此循環(huán)30次，最后降至4℃結(jié)束反應(yīng)。將相同樣本的a及b反應(yīng)產(chǎn)物混合后進(jìn)行以下芯片雜交步驟。

將第二階段反應(yīng)物加入100μl雜交緩沖液(4.27m四甲基氯化銨溶液(tetramethylammoniumchloridesolution)、0.9％empigenbb洗滌液、100mmtris緩沖液(ph8.0))及50μl甲酰胺(formamide)混合均勻，以80℃加熱5分鐘，在于4℃冷卻5分種。將冷卻后的產(chǎn)物注入至表面固定有辨識(shí)探針(seqidno:23至seqidno:27)的芯片，將該芯片以2rpm轉(zhuǎn)速于45℃烘箱反應(yīng)至隔夜。之后進(jìn)行芯片清洗步驟，再以42℃洗滌液i(2xsspe緩沖液，含0.1％sds)于80rpm轉(zhuǎn)速的震蕩器上震蕩清洗3分鐘；以42℃洗滌液ii(0.1xsspe緩沖液，含0.1％sds)于80rpm轉(zhuǎn)速的震蕩器上震蕩清洗3分鐘；以室溫洗滌液iii(0.1xsspe緩沖液)于80rpm轉(zhuǎn)速的震蕩器上震蕩清洗5分鐘；將芯片以離心機(jī)旋干。最后以一芯片熒光掃描儀進(jìn)行芯片掃描步驟，本發(fā)明使用具有兩支固態(tài)激光雷射波長(zhǎng)635nm(pmt750v)及532nm(pmt600v)的luxscan^tm10k/a芯片掃描儀(capitalbio)進(jìn)行掃描。再以genepix4.0(axonlaboratory)進(jìn)行芯片影像分析。

經(jīng)由at(訊號(hào)強(qiáng)度-背景強(qiáng)度)/gc(訊號(hào)強(qiáng)度-背景強(qiáng)度)計(jì)算出log2比率(ratio)值，如果為g或c同型合子(homozygote)基因型，數(shù)值會(huì)是負(fù)值；如果為a或t同型合子(homozygote)基因型數(shù)值會(huì)是正值；如果是異形合子(heterozygote)數(shù)值會(huì)界于兩種同型合子中間。如表八所示，各樣本的實(shí)驗(yàn)結(jié)果皆與已知基因型結(jié)果一致，證實(shí)本發(fā)明用于基因型鑒定芯片的雙重等位基因特異性聚合酶鏈鎖反應(yīng)方法應(yīng)用于多重snp亦具有極高的準(zhǔn)確率。顯示本發(fā)明的用于基因型鑒定芯片的雙重等位基因特異性聚合酶鏈鎖反應(yīng)方法能有效分辨單管擴(kuò)增反應(yīng)中的多種snp產(chǎn)物。

表八、各樣本的計(jì)算出log2比率(ratio)值

此外，本發(fā)明亦可在snp變異性位點(diǎn)引物組的5’端加上一修飾標(biāo)記直接進(jìn)行第一階段擴(kuò)增反應(yīng)，不需再進(jìn)行第二階段擴(kuò)增反應(yīng)，或者在產(chǎn)物無(wú)任何修飾的情況下，也可以類(lèi)似表面電漿共振(surfaceplasmonresonance，spr)方法偵測(cè)是否有產(chǎn)物雜交在芯片表面。

更進(jìn)一步地，當(dāng)單一snp的基因型超過(guò)兩種基因型時(shí)，如表九所示，可將等位基因特異性引物的5’端再加上密碼(barcode)序列，以及表面固定包含密碼(barcode)互補(bǔ)序列的辨識(shí)探針，擴(kuò)增反應(yīng)依實(shí)施例五的方法進(jìn)行，最后芯片的雜交結(jié)果可看見(jiàn)該snp會(huì)有兩種訊號(hào)結(jié)果(如表九a類(lèi)及b類(lèi))，a類(lèi)辨識(shí)探針可辨識(shí)第一密碼序列，b類(lèi)辨識(shí)探針可辨識(shí)第二密碼序列。計(jì)算a類(lèi)訊號(hào)的紅綠熒光強(qiáng)度log2比率(ratio)，判斷樣本是否含有a或g，或是計(jì)算b類(lèi)訊號(hào)的紅綠熒光強(qiáng)度log2比率，判斷檢體是否含有t或c。

表九、基因特異性引物的5’端密碼(barcode)序列辨識(shí)方式

綜上所述，本發(fā)明提供一種用于辨識(shí)核苷酸基因多型性的基因型鑒定芯片的雙重等位基因特異性引物(doubleallelespecificprimers)的方法，該方法使用的正向(forward)與反向引物(reverse)皆以等位基因特異性位點(diǎn)為引物的3’端終點(diǎn)，不須使用特殊堿基的引物，并能容易的直接依等位基因特異性位點(diǎn)兩旁的序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，并且結(jié)合螯合試劑(interchelatingagent)進(jìn)行多重(multiplex)聚合酶鏈鎖反應(yīng)。該方法能有效將目前市面上snp芯片將擴(kuò)增產(chǎn)物注入芯片進(jìn)行雜交的前處理步驟的時(shí)間減少至5小時(shí)，并能減少合成特殊堿基引物所需的昂貴成本，且具有同時(shí)檢測(cè)多個(gè)等位基因特異性位點(diǎn)的優(yōu)點(diǎn)，故本發(fā)明的方法是一種有效、快速、低成本、較大規(guī)模的檢測(cè)snp變異的技術(shù)。