本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體而言，涉及一種編碼rhfgf-6的核酸片段、表達(dá)載體、宿主細(xì)胞、生產(chǎn)方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

成纖維細(xì)胞生長因子-6(fibroblastgrowthfactor-6，fgf-6)是fgf家族成員之一，屬fgf4亞家族(fgf4、fgf5、fgf6)。人fgf-6基因定位于人類染色體12p13，共有約15kb的三個(gè)外顯子，其編碼的蛋白由208個(gè)氨基酸殘基組成單鏈多肽，n端有約37個(gè)氨基酸殘基的疏水信號(hào)肽序列，成熟蛋白有171個(gè)氨基酸(38-208氨基酸殘基)，其理論分子質(zhì)量為19kda，等電點(diǎn)約為9.73。人fgf-6與鼠的氨基酸序列具有93.3％的高度同源性。哺乳動(dòng)物fgf-6位點(diǎn)上的比較基因組學(xué)顯示出人類、大鼠和小鼠fgf-6啟動(dòng)子是高度保守的。在結(jié)構(gòu)上，fgf-6與fgf基因家族的其它成員是非常相似的，尤其與fgf-4(70％)、fgf-5(49％)具有高度的序列同源性。體內(nèi)外的研究表明，fgf-6在分化發(fā)育、骨生成、腫瘤形成和其他細(xì)胞發(fā)育過程中也發(fā)揮著重要的作用。

先天性心臟病是指在胚胎發(fā)育時(shí)期由于心臟發(fā)育障礙而導(dǎo)致心臟形態(tài)、功能異常的疾病。pax-8基因在調(diào)節(jié)心臟發(fā)育和心肌細(xì)胞凋亡的中有著重要作用，而pax-8基因敲除小鼠的心臟中發(fā)現(xiàn)fgf-6的表達(dá)顯著上調(diào)，表明fgf-6是pax-8的下游基因而受到其調(diào)控。lins等將攜帶fgf-6基因的重組真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至大鼠h9c2心肌細(xì)胞中，使其得到有效過表達(dá)，測(cè)得心肌細(xì)胞的增殖能力變強(qiáng)，能抵抗由血清饑餓引起的細(xì)胞凋亡。(zhangj,etal.chinesejournalofpathophysiology,2009,25(7):1292-1297；gaoz,plamedicaljournal,2009,34(9):1082-1084；huangx,zhejiangx,zhejiang.medicine,2010(11):1591-1593；lins,etal.journalofwenzhoumedicalcollege,2013,43(1):9-14.)

grass等研究發(fā)現(xiàn)fgf-6和tgfβ-2可以協(xié)同刺激軟骨結(jié)節(jié)的形成，誘導(dǎo)hmsc的定向分化與增殖，以應(yīng)用到軟骨組織修復(fù)中。bosettim等研究發(fā)現(xiàn)fgf-6可能是一個(gè)重要的調(diào)節(jié)骨生成和骨重構(gòu)的因子，其在成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞中的活性證明了這一點(diǎn)，并推測(cè)fgf-6是通過rankl激活map激酶的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，隨后激活破骨細(xì)胞，完成骨生成。(hunzikereb,etal.oars,2002,10(6):432-463；dozinb,etal.matrixbiol,2002,21(5):449-459；jiangy,nature,2002,418(6893):41-49；grasss,development,1996,122(1):141-150；bosettim,jcellphysiol,2010,225(2):466-471.)

通常采用微生物發(fā)酵的方式生產(chǎn)rhfgf-6(recombinanthumanfgf-6，重組人fgf-6)，但是現(xiàn)有技術(shù)中微生物發(fā)酵表達(dá)rhfgf-6的表達(dá)量以及所表達(dá)的rhfgf-6的活性都很低，難以滿足規(guī)?；瘧?yīng)用的需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一在于提供一種編碼rhfgf-6的核酸片段，其核苷酸序列如seqidno.1所示。該核酸片段消除了不利于表達(dá)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，并且不改變fgf-6的氨基酸序列。

本發(fā)明的目的之二在于提供一種包含上述編碼rhfgf-6的核酸片段的表達(dá)載體，將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入宿主細(xì)胞，得到重組菌，培養(yǎng)該重組菌，用誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，能高表達(dá)rhfgf-6。

本發(fā)明的目的之三在于提供一種包含上述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)該宿主細(xì)胞，用誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，能高表達(dá)rhfgf-6。

本發(fā)明的目的之四在于提供一種運(yùn)用包含上述核酸片段的宿主細(xì)胞生產(chǎn)rhfgf-6的方法，應(yīng)用該方法生產(chǎn)的rhfgf-6表達(dá)量高，活性高。

本發(fā)明的目的之五在于提供rhfgf-6在制備促進(jìn)肌肉組織再生、促進(jìn)骨生成、修復(fù)心肌損傷、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合或促進(jìn)血管再生的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題是采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。

一種編碼rhfgf-6的核酸片段，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

一種表達(dá)載體，其包含上述的編碼rhfgf-6的核酸片段。

含有上述的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。

一種生產(chǎn)rhfgf-6的方法，其包括將上述的編碼rhfgf-6的核酸片段轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞，得到重組菌，培養(yǎng)該重組菌，用誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，得到蛋白樣品，蛋白樣品經(jīng)純化處理后，得到純凈的rhfgf-6。

本發(fā)明實(shí)施例的一種編碼rhfgf-6的核酸片段、表達(dá)載體、宿主細(xì)胞、生產(chǎn)方法及應(yīng)用的有益效果是：本發(fā)明提供的編碼rhfgf-6的核酸片段根據(jù)fgf-6的天然序列(如seqidno.2所示)優(yōu)化而得，在天然序列的基礎(chǔ)上去除了37個(gè)信號(hào)肽，消除了不利于表達(dá)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，但是不改變fgf-6的氨基酸序列，將此核酸片段構(gòu)建到載體構(gòu)成重組表達(dá)載體，再將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入宿主細(xì)胞，得到重組菌，培養(yǎng)該重組菌，用誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，能夠高表達(dá)rhfgf-6，并且表達(dá)的rhfgf-6具有促進(jìn)肌肉組織再生、促進(jìn)骨生成、修復(fù)心肌損傷、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合或促進(jìn)血管再生的活性。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，應(yīng)當(dāng)理解，以下附圖僅示出了本發(fā)明的某些實(shí)施例，因此不應(yīng)被看作是對(duì)范圍的限定，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他相關(guān)的附圖。

圖1為實(shí)施例2中提供的pet3a-rhfgf-6的重組表達(dá)載體圖；

圖2為實(shí)施例2中提供的pet3a-rhfgf-6重組載體酶切鑒定圖；

圖3為實(shí)施例2中提供的rhfgf-6誘導(dǎo)表達(dá)的westernblot鑒定以及sds-page分析圖；

圖4為實(shí)施例3中陽離子交換柱層析及肝素親和柱層析的sds-page圖；

圖5為實(shí)施例3中純化后的rhfgf-6的hplc分析圖；

圖6為實(shí)施例6中mtt法測(cè)定rhfgf-6促進(jìn)細(xì)胞增殖活性的驗(yàn)證圖；

圖7為實(shí)施例7中不同濃度rhfgf-6對(duì)氧化損傷模型的保護(hù)作用的驗(yàn)證圖；

圖8為實(shí)施例7中各組促增殖相關(guān)蛋白的westernblot及灰度值分析圖；

圖9為實(shí)施例7中各組凋亡相關(guān)蛋白的westernblot及灰度值分析圖。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

下面對(duì)本發(fā)明實(shí)施例的一種編碼rhfgf-6的核酸片段、表達(dá)載體、宿主細(xì)胞、生產(chǎn)方法及應(yīng)用進(jìn)行具體說明。

發(fā)明人優(yōu)化了天然的fgf-6序列(如seqidno.2所示)，去掉了37個(gè)信號(hào)肽，得到了優(yōu)化后的核酸片段序列(如seqidno.1所示)，該序列消除了不利于表達(dá)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，并且不改變fgf-6的氨基酸序列。

本發(fā)明提供了含有上述編碼rhfgf-6的核酸片段的表達(dá)載體，將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入宿主細(xì)胞，得到重組菌，培養(yǎng)該重組菌，用誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，能高表達(dá)rhfgf-6。

優(yōu)選的，該表達(dá)載體為原核表達(dá)載體。

優(yōu)選的，該原核表達(dá)載體為pet3a、pet3c、pet14b或pet28a中的任意一種。

更優(yōu)選的，該原核表達(dá)載體為pet3a。

本發(fā)明提供了含有上述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)該宿主細(xì)胞，用誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，能高表達(dá)rhfgf-6。

優(yōu)選的，該宿主細(xì)胞選自大腸桿菌bl21、c41或rosetta中的任意一種。

更優(yōu)選的，該宿主細(xì)胞為bl21(de3)plyss。

本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)rhfgf-6的方法，其將上述的核酸片段轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞，得到重組菌，培養(yǎng)該重組菌，用誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，得到蛋白樣品，蛋白樣品經(jīng)純化處理后，得到純凈的rhfgf-6。具體包括如下步驟：

(1)將上述核酸片段構(gòu)建到上述表達(dá)載體，得到重組表達(dá)載體。

(2)將上述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入上述宿主細(xì)胞，得到重組菌。

(3)培養(yǎng)上述重組菌，用誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，得到蛋白樣品，蛋白樣品經(jīng)純化處理后，得到純凈的rhfgf-6。

具體地，培養(yǎng)重組菌包括：將重組菌以1:50-100(v:v)的比例接種至lb培養(yǎng)基中進(jìn)行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)至a600達(dá)到0.8-1.0，得到活化培養(yǎng)液；然后按1:10-20(v:v)的比例將活化培養(yǎng)液接種至含有磷酸鹽緩沖對(duì)的lb培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)至a600達(dá)到3-5，得到擴(kuò)大培養(yǎng)液；再按1:10-20(v:v)的比例將擴(kuò)大培養(yǎng)液接種至含有罐內(nèi)培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，并加入無機(jī)鹽及生長因子，以溫度37℃、ph值6.8-7.0、調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)數(shù)和通氣量以及流加碳源保持do>25％，至a600達(dá)到20-25(對(duì)數(shù)生長中期)；加入誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

誘導(dǎo)劑可選用iptg(異丙基-β-d-硫代半乳糖苷)或乳糖。

優(yōu)選的，所用誘導(dǎo)劑為乳糖，并且乳糖的終濃度為28-32mm。

iptg是外源蛋白高效表達(dá)的誘導(dǎo)劑，但其價(jià)格昂貴且對(duì)人體有潛在毒性，而乳糖廉價(jià)易得且無毒，這對(duì)于重組外源蛋白的工程化生產(chǎn)具有重要意義。本發(fā)明中，乳糖誘導(dǎo)外源蛋白表達(dá)量與iptg誘導(dǎo)效果相當(dāng)，但其產(chǎn)物量則大大超過iptg誘導(dǎo)，外源蛋白的可溶性表達(dá)量也有所增加。

優(yōu)選的，誘導(dǎo)表達(dá)的條件為：ph7.0-7.2，33-35℃下，誘導(dǎo)表達(dá)4h-6h。

具體地，變性處理以及純化包括如下步驟：

(1)菌體的收集以及破碎

誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后，低溫高速離心收集菌體，-20℃凍存?zhèn)溆?。將菌體室溫融化后，以1:20-40(g:ml)比例充分懸浮于細(xì)胞裂解緩沖液(20mmpb,2mmedta-2na,0.1mnacl,1％tritonx-100,1mmpmsf,5mmdtt,ph7.5)，進(jìn)行高壓均質(zhì)。鏡檢下可見視野范圍內(nèi)無完整大腸桿菌后，低溫高速離心，棄上清，收集沉淀。

(2)包涵體清洗

取上述沉淀，加入10-20倍(g:ml)量清洗緩沖液1(20mmpb,2mmedta-2na,0.1mnacl,1％tritonx-100,0.5％去氧膽酸鈉,ph7.3)室溫充分?jǐn)嚢柘礈旌蟮蜏馗咚匐x心，棄上清，收集沉淀。再加入10-20倍(g:ml)量清洗緩沖液2(20mmpb,2mmedta-2na,0.1mnacl,1％tritonx-100,ph7.3)室溫充分?jǐn)嚢柘礈旌?，低溫高速離心，棄上清，收集沉淀。再加入10-20倍(g:ml)量清洗緩沖液3(20mmpb,2mmedta-2na,0.1mnacl,1％tritonx-100,2m脲,ph7.3)，室溫充分?jǐn)嚢柘礈旌螅蜏馗咚匐x心，棄上清，收集沉淀即為包涵體。

(3)包涵體變性

稱取適量包涵體，加入10-20倍(g:ml)量變性緩沖液(20mmpb,2mmedta-2na,0.1mnacl,1％tritonx-100,8m脲,ph7.3)，充分懸浮，并在磁力攪拌條件下低溫溶解過夜后，低溫高速離心去除未溶物，即得包涵體的變性溶液。

(4)包涵體的純化

包涵體的純化包括復(fù)性后純化、純化后復(fù)性以及柱上復(fù)性三種方法。

其中，包涵體的復(fù)性包括稀釋復(fù)性和透析復(fù)性兩種方法，具體地：

(a)稀釋復(fù)性：取包涵體變性溶液，在4℃磁力攪拌條件下，緩慢滴入10-40倍(v:v)體積復(fù)性緩沖液(20mmpb,2mmedta-2na,0.1mnacl,1％tritonx-100,ph7.3)，復(fù)性過程18h-24h。復(fù)性完畢，低溫高速離心去除沉淀或采用中空纖維超濾裝置進(jìn)行初步分離，所采用的截留分子量為10kd。

(b)透析復(fù)性：取包涵體變性溶液，裝入截留分子量為7kd的透析袋中，在低溫磁力攪拌條件下，放入20-50倍(v:v)復(fù)性緩沖液(20mmpb,2mmedta-2na,0.1mnacl,1％tritonx-100,5mmdtt,ph7.3)，復(fù)性液中還可添加氧化/還原型谷胱甘肽、精氨酸或甘油。8h-12h小時(shí)更換復(fù)性液，共3-4次。復(fù)性完畢，低溫高速離心去除沉淀或采用中空纖維超濾裝置進(jìn)行初步分離，所采用的截留分子量為10kd。

復(fù)性后純化，即將變性后的包涵體溶液經(jīng)上述復(fù)性方法復(fù)性后，先后經(jīng)過陽離子交換層析以及肝素親和層析純化，得到純凈的rhfgf-6。

純化后復(fù)性，即將變性后的包涵體溶液經(jīng)陽離子交換層析，經(jīng)上述復(fù)性方法復(fù)性后，最后再進(jìn)行肝素親和層析，得到純凈的rhfgf-6。

柱上復(fù)性，即將變性后的包涵體溶液先經(jīng)陽離子交換層析柱上復(fù)性及純化，再經(jīng)肝素親和層析純化，得到純凈的rhfgf-6。

上述三種方法中，陽離子交換層析所用的填料為cm或sp陽離子交換填料，肝素親和層析所用的填料為heparinsepharose親和層析填料。

本發(fā)明還提供了采用上述方法制備的rhfgf-6的生物學(xué)活性檢測(cè)方法。

首先，用mtt比色法檢測(cè)了rhfgf-6對(duì)小鼠胚胎成纖維細(xì)(nih3t3)、小鼠成肌細(xì)胞(c2c12)以及大鼠心肌細(xì)胞(h9c2)的增殖的影響。結(jié)果顯示，rhfgf-6具有良好的促進(jìn)成纖維細(xì)胞及成肌細(xì)胞增殖的活性，但對(duì)正常心肌細(xì)胞增殖活性不明顯。然后，用mtt比色法以及免疫印跡分析(westernblot)檢測(cè)了rhfgf-6對(duì)雙氧水導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷的修復(fù)作用。結(jié)果顯示，rhfgf-6具有良好的修復(fù)心肌細(xì)胞損傷的作用。

以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的特征和性能作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

實(shí)施例1

本實(shí)施例中提供一種編碼rhfgf-6的核酸片段。

該核酸片段的核苷酸序列如seqidno.1所示。該序列由人fgf-6的天然序列(如seqidno.2所示)根據(jù)大腸桿菌偏好性進(jìn)行密碼子優(yōu)化，去除了37個(gè)信號(hào)肽，消除了不利于表達(dá)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，但不改變fgf-6的氨基酸序列。

將本實(shí)施例提供的核酸片段構(gòu)建到表達(dá)載體，并將此重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞，得到重組菌，培養(yǎng)該重組菌，用誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，能獲得高表達(dá)rhfgf-6。

實(shí)施例2

本實(shí)施例提供一種生產(chǎn)rhfgf-6的方法，包括如下步驟：

2.1構(gòu)建重組表達(dá)載體

合成rhfgf-6基因，在編碼rhfgf-6的核酸片段(seqidno.1)的5’端與3’端分引入起始密碼子和終止密碼子，并引入特異性酶切位點(diǎn)ndeⅰ和bamhⅰ。

37℃下用ndeⅰ和bamhⅰ雙酶切分別處理表達(dá)載體pet3a和rhfgf-6基因，酶切4h。

回收相應(yīng)的酶切片段，用t4dna連接酶16℃連接過夜，構(gòu)建重組表達(dá)載體。pet3a-rhfgf-6重組表達(dá)載體圖如圖1所示。

2.2重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化及鑒定

將重組表達(dá)載體pet3a-fgf-6轉(zhuǎn)化進(jìn)入宿主細(xì)胞：大腸桿菌bl21(de3)plyss中，在含有載體抗性的lb平板上挑選陽性克隆，并進(jìn)行質(zhì)粒雙酶切(酶切位點(diǎn)是ndeⅰ和bamhⅰ)鑒定。

鑒定結(jié)果如圖2所示(圖中，m1為dnamarkerdl15000；1為fgf6cdna；2為pet-3a空載體；3、4分別為pet-3a-fgf6重組表達(dá)載體；m2為dnamarkerdl2000)。重組表達(dá)載體經(jīng)酶切后，在500bp附近出現(xiàn)條帶，表明編碼rhfgf-6的核酸片段正確插入載體中。

對(duì)克隆序列進(jìn)行正向、逆向序列分析測(cè)定，測(cè)定結(jié)果證實(shí)克隆序列與設(shè)計(jì)序列完全一致。即本步驟中成功構(gòu)建了pet3a-rhfgf-6重組表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)化進(jìn)入宿主細(xì)胞bl21(de3)plyss中，得到重組菌pet3a-rhfgf-6/bl21(de3)plyss。

2.3培養(yǎng)重組菌(pet3a-rhfgf-6/bl21(de3)plyss)，誘導(dǎo)表達(dá)rhfgf-6

2.3.1活化培養(yǎng)

將pet3a-rhfgf-6/bl21(de3)plyss重組菌以1:100(v:v)的比例接種至lb培養(yǎng)基(包括：10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母粉，10g/l氯化鈉)中進(jìn)行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)至a600達(dá)到1.0，得到活化培養(yǎng)液。

2.3.2擴(kuò)大培養(yǎng)

按1:20(v/v)的比例將活化培養(yǎng)液接種至含有磷酸鹽緩沖對(duì)的lb培養(yǎng)基(包括：23g/l胰蛋白胨，17g/l酵母粉，3.5g/l磷酸氫二鉀，1.2g/l磷酸二氫鉀，4g/l氯化鈉，2g/l葡萄糖)中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)至a600達(dá)到5，得到擴(kuò)大培養(yǎng)液。

2.3.3罐內(nèi)培養(yǎng)

按1:20(v/v)的比例將擴(kuò)大培養(yǎng)液接種至含有罐內(nèi)培養(yǎng)基(包括：23g/l胰蛋白胨，17g/l酵母粉，3.5g/l磷酸氫二鉀，1.2g/l磷酸二氫鉀，4g/l氯化銨，1g/l硫酸鎂，0.02g/l氯化鈣，0.01g/l維生素b1，5g/l葡萄糖以及適量微量元素)的發(fā)酵罐中，并加入無機(jī)鹽及生長因子，溫度37℃、ph值7.0、調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)數(shù)和通氣量以及加碳源保持do>25％，至a600達(dá)到25(對(duì)數(shù)生長中期)。

2.3.4誘導(dǎo)培養(yǎng)

加入乳糖作為誘導(dǎo)劑，保持終濃度為28mm進(jìn)行誘導(dǎo)，加入后溫度控制在33℃、ph值7.1、并通過調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)數(shù)和通氣量以及加碳源、氮源及磷酸鹽緩沖溶液保持do>25％，誘導(dǎo)培養(yǎng)3h-6h。

培養(yǎng)重組菌全過程中，每小時(shí)取樣測(cè)a600值，并在誘導(dǎo)前進(jìn)行鏡檢。誘導(dǎo)后每小時(shí)留樣進(jìn)行sds-page檢測(cè)以及westernblot鑒定。

sds-page檢測(cè)以及westernblot鑒定結(jié)果如圖3所示。其中，圖3-a為westernblot鑒定圖(1、2、3、4、5的樣品分別取自誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)3h、4h、5h、6h的培養(yǎng)液)，圖3-b為sds-page檢測(cè)分析圖(1、2、3、4、5的樣品分別取自誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)3h、4h、5h、6h的培養(yǎng)液，m為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品)。

由圖3-a和圖3-b可知，加入乳糖誘導(dǎo)前，重組菌不表達(dá)rhfgf-6，誘導(dǎo)后rhfgf-6表達(dá)量持續(xù)增長，且誘導(dǎo)后6h的rhfgf-6產(chǎn)量及表達(dá)量最多。

2.4菌體的收集及破碎

2.4.1菌體的收集

于4℃，9000r/min離心10min收集菌體，收集的菌體-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.4.2菌體的破碎

將室溫凍融的菌體以1:40(g:ml)比例充分懸浮于細(xì)胞裂解緩沖液(20mmpb,2mmedta-2na,0.1mnacl,1％tritonx-100,1mmpmsf,5mmdtt,ph7.5)，進(jìn)行高壓均質(zhì)。以300bar循環(huán)1次，再以800bar均質(zhì)2次，鏡檢在可見視野范圍內(nèi)無完整大腸桿菌后，4℃，9000r/min離心40min，棄上清，收集沉淀。

2.5包涵體的清洗及變性

2.5.1包涵體的清洗

取上述沉淀，加入20倍(g:ml)量清洗緩沖液1(20mmpb,2mmedta-2na,0.1mnacl,1％tritonx-100,0.5％去氧膽酸鈉,ph7.3)，室溫充分?jǐn)嚢柘礈?h后，4℃，9000r/min離心30min，棄上清，收集沉淀。再加入20倍(g:ml)量清洗緩沖液2(20mmpb,2mmedta-2na,0.1mnacl,1％tritonx-100,ph7.3)，室溫充分?jǐn)嚢柘礈?h后，4℃，9000r/min離心30min，棄上清，收集沉淀。再加入20倍(g:ml)量清洗緩沖液3(20mmpb,2mmedta-2na,0.1mnacl,1％tritonx-100,2m脲,ph7.3)，室溫充分?jǐn)嚢柘礈?h后，4℃，9000r/min離心30min，棄上清，收集沉淀即為包涵體。

2.5.2包涵體的變性

稱取適量包涵體，加入20倍量(g:ml)變性緩沖液(20mmpb,2mmedta-2na,0.1mnacl,1％tritonx-100,8m脲,ph7.3)，充分懸浮，并在磁力攪拌條件下4℃溶解過夜。4℃，9000r/min離心30min，去除未溶物，即得包涵體的變性溶液。

2.6包涵體的復(fù)性

取上述包涵體的變性溶液，先經(jīng)過陽離子交柱換層析柱上復(fù)性及純化，再經(jīng)過肝素親和柱層析純化，得到rhfgf-6。

2.6.1陽離子交換柱層析

陽離子交換柱層析的層析介質(zhì)選用cm或sp陽離子交換層析填料。具體地：

用5個(gè)柱體積的平衡液(20mmpb,2mmedta-2na,8m脲,0.1mnacl,ph7.3)平衡層析柱至基線穩(wěn)定。

將包涵體的變性溶液上樣。

用5個(gè)柱體積的平衡液平衡層析柱至基線穩(wěn)定。

用100％-0％(v/v)的平衡液以及0％-100％(v/v)的復(fù)性液(20mmpb,2mmedta-2na,0.1mnacl,ph7.3)進(jìn)行梯度復(fù)性。此過程中，開始階段，平衡液輸出100％，復(fù)性液輸出0％；隨后進(jìn)行梯度洗脫，平衡液輸出逐漸減少最終為0％，復(fù)性液輸出逐漸增加最終為100％，此過程需要12h以上。

復(fù)性完成后，用5個(gè)柱體積洗脫液(20mmpb,2mmedta-2na,0.6mnacl,ph7.3)清洗層析柱，收取蛋白峰，測(cè)定蛋白含量，并進(jìn)行sds-page檢測(cè)其純度。

2.6.2肝素親和柱層析

肝素親和柱層析的層析介質(zhì)選用heparinsepharose親和層析填料。具體地：

用5個(gè)柱體積的平衡液(20mmpb,2mmedta-2na,0.6mnacl,ph7.3)平衡層析柱至基線穩(wěn)定。

將經(jīng)陽離子交換柱層析收集的蛋白洗脫液上樣。

用5個(gè)柱體積的平衡液平衡層析柱至基線穩(wěn)定。

用5個(gè)柱體積洗脫液1(20mmpb,2mmedta-2na,1.2mnacl,ph7.3)清洗層析柱，去除雜蛋白。

用5個(gè)柱體積洗脫液2(20mmpb,2mmedta-2na,2.0mnacl,ph7.3)清洗層析柱收取蛋白峰，測(cè)定蛋白含量，并進(jìn)行sds-page檢測(cè)其純度。

實(shí)施例3

本實(shí)施例提供一種生產(chǎn)rhfgf-6的方法，包括如下步驟：

構(gòu)建表達(dá)載體、重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化及鑒定、培養(yǎng)重組菌，誘導(dǎo)表達(dá)rhfgf-6、菌體的收集及破碎、包涵體的清洗及變性與實(shí)施例2中提供的步驟與方法基本相同，其區(qū)別在于，本實(shí)施例中誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件為：乳糖濃度保持30mm，溫度為34℃，ph7.0。除此之外，本實(shí)施例提供的生產(chǎn)rhfgf-6的方法還包括：

3.1包涵體的復(fù)性

取包涵體變性溶液，裝入截留分子量為7kd的透析袋中，在4℃磁力攪拌條件下，放入50倍(v:v)復(fù)性緩沖液(20mmpb,2mmedta-2na,0.1mnacl,1％tritonx-100,5mmdtt,ph7.3)，復(fù)性液中還可添加氧化/還原型谷胱甘肽、精氨酸、甘油等。12h更換復(fù)性液，共4次，得到包涵體復(fù)性溶液。復(fù)性完畢，離心去除沉淀或采用中空纖維超濾裝置進(jìn)行初步分離，所采用的截留分子量為10kd。

3.2陽離子交換柱層析

陽離子交換柱層析的層析介質(zhì)選用cm或sp陽離子交換層析填料。具體地：

用5個(gè)柱體積的平衡液(20mmpb,2mmedta-2na,0.1mnacl,ph7.3)平衡層析柱至基線穩(wěn)定。

將包涵體復(fù)性溶液上樣。

用5個(gè)柱體積的平衡液平衡層析柱至基線穩(wěn)定。

用5個(gè)柱體積洗脫液(20mmpb,2mmedta-2na,0.6mnacl,ph7.3)清洗層析柱，收取蛋白峰，測(cè)定蛋白含量，并進(jìn)行sds-page檢測(cè)其純度。

3.3肝素親和柱層析

所用材料以及方法均同實(shí)施例2中肝素親和層析部分。

經(jīng)陽離子柱層析的rhfgf-6以及肝素親和柱層析后的rhfgf-6的sds-page檢測(cè)圖如圖4所示。圖4-a(1、2、3的樣品分別取自變性上清、上樣穿出液、目的蛋白洗脫峰，m為marker)為經(jīng)陽離子柱層析的rhfgf-6的sds-page檢測(cè)圖。變性上清中，含有雜蛋白較多，上樣穿出液中沒有目的蛋白條帶，表明目的蛋白與層析介質(zhì)結(jié)合，目的蛋白洗脫峰的目的條帶明顯，說明目的蛋白rhfgf-6被洗脫下來。圖4-b(1、2、3、4的樣品分別取自復(fù)性后上清、上樣穿出液、雜質(zhì)峰、目的蛋白洗脫峰，m為marker)為經(jīng)肝素親和柱層析的rhfgf-6的sds-page檢測(cè)圖，只有1和4有目的條帶，并且4沒有雜蛋白條帶，說明rhfgf-6被高度純化。

對(duì)純化后的rhfgf-6進(jìn)行高效液相檢測(cè)，具體操作如下：

色譜柱采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，理論板數(shù)應(yīng)不低于2000；柱溫25±1℃、恒溫器4±1℃；以a相(0.1％tfa-水溶液：量取1.0ml三氟乙酸加水至1000ml，充分混勻)、b相(0.1％tfa-乙腈溶液：量取1.0ml三氟乙酸加入色譜純乙腈至1000ml，充分混勻)為流動(dòng)相，在室溫條件下，進(jìn)行梯度洗脫(10-100％b相)，流速1ml/min。樣品濃度為1mg/ml，上樣量應(yīng)不低于10μg，在波長280nm處檢測(cè)。

檢測(cè)結(jié)果如圖5所示。樣品經(jīng)過此兩步純化，即離子交換柱層析、肝素親和柱層析，純度提高至95％以上。

實(shí)施例4

本實(shí)施例提供一種生產(chǎn)rhfgf-6的方法，包括如下步驟：

構(gòu)建表達(dá)載體、重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化及鑒定、培養(yǎng)重組菌，誘導(dǎo)表達(dá)rhfgf-6、菌體的收集及破碎、包涵體的清洗及變性與實(shí)施例2中提供的步驟與方法基本相同，其區(qū)別在于，本實(shí)施例中誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件為：乳糖濃度保持32mm，溫度為35℃，ph7.2。除此之外，本實(shí)施例提供的生產(chǎn)rhfgf-6的方法還包括：

4.1陽離子交換柱層析

陽離子交換柱層析的層析介質(zhì)選用cm或sp陽離子交換層析填料。具體地：

用5個(gè)柱體積的平衡液(20mmpb,2mmedta-2na,8m脲,0.1mnacl,ph7.3)平衡層析柱至基線穩(wěn)定。

將包涵體變性溶液上樣。

用5個(gè)柱體積的平衡液平衡層析柱至基線穩(wěn)定。

用5個(gè)柱體積洗脫液(20mmpb,2mmedta-2na,8m脲,0.3mnacl,ph7.3)清洗層析柱，收取蛋白峰，測(cè)定蛋白含量，并進(jìn)行sds-page檢測(cè)其純度。

4.2復(fù)性

取經(jīng)陽離子交換柱層析的蛋白溶液，在4℃磁力攪拌條件下，緩慢滴入40倍體積(v：v)復(fù)性緩沖液(20mmpb,2mmedta-2na,0.1mnacl,1％tritonx-100,ph7.3)，復(fù)性24h，得到復(fù)性溶液。復(fù)性完畢，離心去除沉淀或采用中空纖維超濾裝置進(jìn)行初步分離，所采用的截留分子量為10kd。

4.3肝素親和柱層析

對(duì)復(fù)性溶液進(jìn)行肝素親和柱層析。所用材料以及方法均同實(shí)施例2中肝素親和層析部分。

實(shí)施例5

本實(shí)施例提供一種優(yōu)化的表達(dá)載體與宿主細(xì)胞的組合。

按照實(shí)施例2中2.1的方法，將實(shí)施例1提供的核酸片段，分別構(gòu)建到載體pet3a、pet3c、pet14b、pet28a中，得到重組載體pet3a-rhfgf-6、pet3c-rhfgf-6、pet14b-rhfgf-6、pet28a-rhfgf-6。并將這些重組載體分別轉(zhuǎn)化進(jìn)入宿主細(xì)胞：大腸桿菌c41(de3)plyss、rosetta(de3)或rosetta(de3)plyss、bl21(de3)、bl21(de3)plyss，得到一系列重組菌。

按照實(shí)施例2中的方法培養(yǎng)這些重組菌，在相同條件誘導(dǎo)表達(dá)rhfgf-6，并進(jìn)行sds-page檢測(cè)以及westernblot鑒定。

結(jié)果表明，將核酸片段構(gòu)建到載體pet3a，并且將重組表達(dá)載體pet3a-rhfgf-6轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌bl21(de3)plyss時(shí)，得到重組菌pet3a-rhfgf-6/bl21(de3)plyss，rhfgf-6的表達(dá)量最高，占菌體總蛋白量20.1％。相同條件下，pet3a-rhfgf-6/bl21(de3)、pet3a-rhfgf-6/c41(de3)plyss、pet3a-rhfgf-6/rosetta(de3、pet3a-rhfgf-6/rosetta(de3)plyss中rhfgf-6的表達(dá)量占菌體總蛋白量的比例分別為18.2％、15.4％、10.1％及11.8％。

由此可見，將本發(fā)明提供的編碼rhfgf-6的核酸片段構(gòu)建到表達(dá)載體pet3a得到重組表達(dá)載體pet3a-rhfgf-6，將此重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入進(jìn)入宿主細(xì)胞大腸桿菌bl21(de3)plyss得到重組菌pet3a-rhfgf-6/bl21(de3)plyss，培養(yǎng)該重組菌，用濃度為28-32mm的乳糖誘導(dǎo)表達(dá)rhfgf-6，可使表達(dá)的rhfgf-6的含量占菌體總蛋白含量的20.1％。

實(shí)施例6

本實(shí)施例提供了rhfgf-6在促進(jìn)細(xì)胞增殖中的應(yīng)用。分別考察了rhfgf-6對(duì)nih3t3、c2c12、h9c2的增殖的影響。其包括如下步驟：

6.1細(xì)胞傳代培養(yǎng)

維持培養(yǎng)液：含10％(v/v)胎牛血清(fbs)、1％(v/v)雙抗(青霉素-鏈霉素)的dmem。

用維持培養(yǎng)液分別培養(yǎng)上述三種細(xì)胞。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，用胰酶消化計(jì)數(shù)后，按8×10³/孔的細(xì)胞鋪板到96孔板，每孔加入100μl維持培養(yǎng)液，于37℃、5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

6.2饑餓培養(yǎng)

用含0.5％fbs(其余成分同維持培養(yǎng)液)的饑餓培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h。

6.3mtt試驗(yàn)

加入不同濃度(2、4、8、16、32、64、128、256ng/ml)的rhfgf-6蛋白到96孔板中，并且分別設(shè)置陰性對(duì)照孔和陽性對(duì)照孔，其中陰性對(duì)照孔分別加入相同梯度濃度的pbs，陽性對(duì)照孔分別加入相同梯度濃度的afgf(酸性成纖維細(xì)胞生長因子)或bfgf(堿性成纖維細(xì)胞生長因子)。加入后繼續(xù)培養(yǎng)48h后每孔加入25μl的mtt(5mg/ml)，再培養(yǎng)4h，吸掉孔中的液體，每孔加入150μldmso，震蕩15min，使結(jié)晶物充分溶解，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm下測(cè)定各孔吸光度。

rhfgf-6促進(jìn)細(xì)胞增殖的結(jié)果如圖6所示。圖6-a為rhfgf-6對(duì)nih3t3增殖活性的影響圖(a、b、c、d分別為不同濃度的rhfgf-6、afgf、bfgf、pbs對(duì)nih3t3增殖活性的影響曲線)，圖6-b為rhfgf-6對(duì)h9c2增殖活性的影響圖(a、b、c、d分別為不同濃度的rhfgf-6、afgf、bfgf、pbs對(duì)h9c2增殖活性的影響曲線)，圖6-c(a、b、c分別為不同濃度的rhfgf-6、afgf(對(duì)照品)、pbs對(duì)c2c12增殖活性的影響曲線)為rhfgf-6對(duì)c2c12增殖活性的影響圖。

mtt比色法是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長的方法?；罴?xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性mtt還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(formazan)并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜(dmso)能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長處測(cè)定其光吸光度值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量，吸光度值越高，活細(xì)胞數(shù)越多。

rhfgf-6對(duì)正常h9c2細(xì)胞無明顯促增殖活性，對(duì)nih3t3以及c2c12細(xì)胞的促進(jìn)作用呈劑量依賴性。rhfgf-6濃度在1.5ng/ml-25ng/ml時(shí)，對(duì)c2c12細(xì)胞具有顯著的促增殖作用，并呈線性相關(guān)。

實(shí)施例7

本實(shí)施例提供rhfgf-6在雙氧水導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷的修復(fù)中的應(yīng)用。其包括如下步驟：

7.1細(xì)胞傳代培養(yǎng)

維持培養(yǎng)液：含10％(v/v)胎牛血清(fbs)、1％(v/v)雙抗(青霉素-鏈霉素)的dmem。

用維持培養(yǎng)液培養(yǎng)h9c2。取對(duì)數(shù)生長期的h9c2，用胰酶消化計(jì)數(shù)后，按8×10³/孔的細(xì)胞鋪板到96孔板，每孔加入100μl維持培養(yǎng)液，于37℃、5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

7.2制備h9c2氧化損傷模型

取對(duì)數(shù)生長期的h9c2細(xì)胞，按1×10⁴/孔的細(xì)胞鋪板到96孔板，每孔加入100μl維持培養(yǎng)液，于37℃、5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，用含0.5％fbs的饑餓培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h。將雙氧水按終濃度為0μm、10μm、20μm、50μm、100μm、200μm、400μm加入到96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)12h后，利用mtt法測(cè)定各孔吸光度。根據(jù)如下公式計(jì)算存活率：

存活率(％)＝(雙氧水處理組吸光度-空白對(duì)照組吸光度)/(正常對(duì)照組吸光度-空白對(duì)照組吸光度)×100％

7.3不同濃度的rhfgf-6蛋白對(duì)氧化損傷模型的保護(hù)作用

將rhfgf-6、afgf和bfgf按終濃度為25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml加入到96孔板中，培養(yǎng)2h后加入終濃度為200μm的雙氧水繼續(xù)培養(yǎng)12h，利用mtt法測(cè)定各孔吸光度。根據(jù)上述公式計(jì)算存活率。

7.4氧化損傷模型中l(wèi)dh活性和mda含量的檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長期的h9c2細(xì)胞，按2×10⁵/孔的細(xì)胞鋪板到6孔板上，每孔加入2ml維持培養(yǎng)液，于37℃、5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，用含0.5％fbs的饑餓培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h。將rhfgf-6、afgf和bfgf按終濃度為25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml加入到6孔板中，培養(yǎng)2h后加入200μm的雙氧水繼續(xù)培養(yǎng)12h。將每組細(xì)胞按照ldh試劑盒(購自南京建成生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：a020-2)和mda試劑盒(購自南京建成生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：a003-4)說明書進(jìn)行活性和含量的測(cè)定。

7.5蛋白提取及westernblot分析

h9c2細(xì)胞先用rhfgf-6按終濃度為50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml培養(yǎng)2h后，加入200μm的雙氧水繼續(xù)培養(yǎng)12h。取出h9c2細(xì)胞，吸出原有細(xì)胞培養(yǎng)液，用pbs沖洗三次。6孔板每孔加入200μl細(xì)胞裂解液，吹打數(shù)下。將細(xì)胞裂解液鋪勻，冰上放置30min。然后12000g，4℃，離心30min，取上清液。取一部分上清液用bca法測(cè)定總蛋白濃度，剩余分裝后置于-80℃?zhèn)溆?。利用westernblot方法研究不同濃度的rhfgf-6對(duì)氧化損傷的h9c2細(xì)胞的保護(hù)作用。所用抗體為兔抗人erk、p-erk、p38mapk、p-p38mapk、caspase-3、bcl-2、bax、和β-actin(內(nèi)參)一抗(1:800)及抗兔二抗(1:8000)。對(duì)各組蛋白灰度掃描后，按如下公式進(jìn)行灰度值分析：

相對(duì)灰度值＝(樣品灰度值-背景灰度值)/(內(nèi)參灰度值-背景灰度值)

rhfgf-6對(duì)氧化損傷模型的修復(fù)如圖7-9所示。圖中，##表示：與control(對(duì)照組)組比較，p﹤0.01；*表示：與氧化損傷模型組比較，p﹤0.05，**表示：與氧化損傷模型組比較，p﹤0.01。

圖7-a為mtt比色法檢測(cè)rhfgf-6對(duì)氧化損傷模型的增殖促進(jìn)結(jié)果圖，rhfgf-6對(duì)氧化損傷模型組的細(xì)胞增殖能力有明顯的促進(jìn)作用，0-200ng/ml范圍內(nèi)，濃度越高，rhfgf-6促進(jìn)氧化損傷模型增殖作用越強(qiáng)。圖7-b為rhfgf-6對(duì)氧化損傷模型的乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase，ldh)活性影響圖。氧化損傷模型中l(wèi)dh活性明顯較正常細(xì)胞偏高，rhfgf-6可降低氧化損傷模型的ldh的活性，0-200ng/ml內(nèi)，rhfgf-6濃度越高，降低ldh活性的作用越強(qiáng)。圖7-c為rhfgf-6對(duì)氧化損傷模型中總丙二醛(malondialdehyde，mda)含量的影響圖。氧化損傷模型中mda的含量明顯高于正常細(xì)胞，rhfgf-6可降低氧化損傷模型的mda的含量，0-200ng/ml內(nèi)，rhfgf-6濃度越大，降低mda含量的作用越強(qiáng)。

erk1/2以及p38mapk蛋白的磷酸化水平是rhfgf-6介導(dǎo)的促增殖作用的相關(guān)指標(biāo)；caspase3、bax、bcl-2是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵指標(biāo)。圖8-a為rhfgf-6對(duì)氧化損傷模型中磷酸化的erk1/2的表達(dá)水平的影響圖。氧化損傷模型中磷酸化的erk1/2的表達(dá)水平明顯低于正常細(xì)胞，rhfgf-6可提高磷酸化的erk1/2的表達(dá)水平，0-200ng/ml內(nèi)，濃度越高，提高磷酸化的erk1/2的表達(dá)水平的能力越強(qiáng)；圖8-b為rhfgf-6對(duì)氧化損傷模型中磷酸化的p38mapk的表達(dá)水平的影響圖。氧化損傷模型中磷酸化的p38mapk的表達(dá)水平明顯低于正常細(xì)胞，rhfgf-6可提高磷酸化的p38mapk的表達(dá)水平，0-200ng/ml內(nèi)，濃度越高，提高磷酸化的p38mapk的表達(dá)水平的能力越強(qiáng)。即rhfgf-6對(duì)心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用并且這種保護(hù)作用呈劑量依賴性。

圖9-a為rhfgf-6對(duì)氧化損傷模型中caspase-3的表達(dá)水平的影響圖。氧化損傷模型中caspase-3的表達(dá)水平明顯高于正常細(xì)胞，rhfgf-6可降低caspase-3的表達(dá)水平，0-200ng/ml內(nèi)，濃度越高，降低caspase-3的表達(dá)水平的能力越強(qiáng)。圖9-b為rhfgf-6對(duì)氧化損傷模型中bax的表達(dá)水平的影響圖。氧化損傷模型中bax的表達(dá)水平明顯高于正常細(xì)胞，rhfgf-6可降低bax的表達(dá)水平，0-200ng/ml內(nèi)，濃度越高，降低bax的表達(dá)水平的能力越強(qiáng)。圖9-c為rhfgf-6對(duì)氧化損傷模型中bcl-2是的表達(dá)水平的影響圖。氧化損傷模型中bcl-2的表達(dá)水平明顯低于正常細(xì)胞，rhfgf-6可提高bcl-2的表達(dá)水平，0-200ng/ml內(nèi)，濃度越高，提高bcl-2的表達(dá)水平的能力越強(qiáng)。進(jìn)一步表明rhfgf-6具有保護(hù)和修復(fù)受損心肌細(xì)胞的功能。

綜上所述，本發(fā)明提供的編碼rhfgf-6的核酸片段根據(jù)fgf-6的天然序列優(yōu)化而得，在天然序列的基礎(chǔ)上去除了37個(gè)信號(hào)肽，消除了不利于表達(dá)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，但是不改變fgf-6的氨基酸序列，將此核酸片段構(gòu)建到載體構(gòu)成重組表達(dá)載體，再將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入宿主細(xì)胞，得到重組菌，培養(yǎng)該重組菌，能夠高表達(dá)rhfgf-6，并且表達(dá)的rhfgf-6具有促進(jìn)肌肉組織再生、促進(jìn)骨生成、修復(fù)心肌損傷、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合、促進(jìn)血管再生的活性。

以上所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。本發(fā)明的實(shí)施例的詳細(xì)描述并非旨在限制要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍，而是僅僅表示本發(fā)明的選定實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

sequencelisting

<110>溫州醫(yī)科大學(xué)

<120>一種編碼rhfgf-6的核酸片段、表達(dá)載體、宿主細(xì)胞、生產(chǎn)方法及應(yīng)用

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>522

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

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<210>2

<211>522

<212>dna

<213>智人（homosapiens）

<400>2

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