Dhfr在檢測(cè)膀胱癌中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明DHFR在檢測(cè)膀胱癌中的應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)基因檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。包括下述步驟：(1)從樣本的膀胱組織和外周血中分別提取DNA，得到DNA模板；(2)以引物對(duì)P為引物，分別以從樣本的膀胱組織和外周血提取的DNA為模板，分別進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增；(3)根據(jù)ΔΔCt來計(jì)算每個(gè)樣本的log2比值，并將其與全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)得到的拷貝數(shù)改變情況進(jìn)行比較，當(dāng)拷貝數(shù)變化超過2.5或小于1.5時(shí)或者當(dāng)用GISTIC算法得到G分?jǐn)?shù)>0.08或者G分?jǐn)?shù)<0.08時(shí)，為膀胱癌樣本。本發(fā)明具有指出了DHFR序列擴(kuò)增可以作為檢測(cè)膀胱癌的標(biāo)記物；DHFR基因可以作為膀胱癌的基因靶向治療試劑盒的優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】DHFR在檢測(cè)膀胱癌中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)基因檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及DHFR在檢測(cè)膀胱癌中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 在全世界各個(gè)國(guó)家和地區(qū)，膀胱癌是一種最常見泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤。據(jù)估計(jì)，僅在2008年單年度就有386300例新發(fā)病例和150200例死亡病例。過去的研究表明:膀胱癌是一個(gè)具有較高異質(zhì)性的疾病，它有兩個(gè)不同亞型(淺表型和侵入型)，其臨床表現(xiàn)多變和遺傳背景復(fù)雜。最近，我們開展的一項(xiàng)研究結(jié)果表明:在膀胱移行細(xì)胞癌中，有八個(gè)染色質(zhì)重塑基因(UTX，MLL-MLL3，CREBBP-EP300，NCORl,ARIDlA 和 CHD6)存在頻發(fā)突變。然而，目前我們對(duì)膀胱癌的體細(xì)胞突變情況仍缺乏系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)，我們對(duì)膀胱癌發(fā)生過程中的關(guān)鍵“驅(qū)動(dòng)基因”也知之甚少。
[0003]為了確定這些突變基因與膀胱癌發(fā)生的相關(guān)性，我們采用過去研究中所描述的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析了每個(gè)基因的體細(xì)胞突變率是否顯著高于整個(gè)基因組的背景突變率。通過該分析，我們一共發(fā)現(xiàn)了 37個(gè)顯著突變基因，其中包括7個(gè)已知膀胱癌的基因(TP53，HRAS, FGFR3，PIK3CA，RBl，KRAS和TSCI)以及我們過去所發(fā)現(xiàn)的八個(gè)染色質(zhì)重塑基因(UTX, ARID1A, MLL-MLL3, CREBBP-EP300, NCORl 和 CHD6)。此外，我們還分析了染色質(zhì)重塑相關(guān)基因和基因家族的突變情況，并在膀胱癌中觀察到多個(gè)其他染色質(zhì)重塑基因的頻發(fā)突變，包括組蛋白脫甲基酶基因UTX/UTY(30% )，核染色質(zhì)重塑基因ARID1A/4A(17% )，組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因MLL/MLL3/MLL5(16% )，組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶基因EP300/400(15% )，SffI/SNF復(fù)合體相關(guān)基因SMARCA4/C1 (7% )和組蛋白脫甲基酶基因JARID 1A/B^% )?？偟膩碚f，在99例病例中，至少有57例(58%)患者的染色質(zhì)重塑基因存在體細(xì)胞突變，這進(jìn)一步表明調(diào)節(jié)染色質(zhì)構(gòu)象的表觀遺傳學(xué)改變和翻譯后修飾可能是膀胱癌發(fā)生過程中的一種主要的驅(qū)動(dòng)機(jī)制。
[0004]我們采用了全基因組測(cè)序技術(shù)分析了 99例腫瘤的拷貝數(shù)變異情況，發(fā)現(xiàn)染色體臂或整個(gè)染色體水平的異常主要集中在以下染色體(臂):5p，8q，13p和20p_q擴(kuò)增和8p, 9p-q, lip, 14p, 15p, 17p和21p丟失。與先前的研究結(jié)果一致,就總體擴(kuò)增或缺失的特征而言，不同膀胱癌亞型的擴(kuò)增或缺失特征沒有明顯差異。通過拷貝數(shù)變異分析，我們發(fā)現(xiàn)許多公認(rèn)的致癌基因異?？赡芘c膀胱癌的發(fā)生相關(guān)。我們采用GSITIC算法來識(shí)別在多個(gè)樣本中重復(fù)出現(xiàn)的小片段拷貝數(shù)變異。我們一共找到84個(gè)局部擴(kuò)增區(qū)域，其中包括幾個(gè)過去已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與膀胱癌有關(guān)的基因，如:TR10，MDM2, MYC, E2F3, CCNDl和ERBB2。其他擴(kuò)增區(qū)域所包含的基因在膀胱癌中尚屬首次報(bào)道，包括CCNE1，CEBPA，E2F1和MUCl。我們還發(fā)現(xiàn)了 80個(gè)重復(fù)發(fā)生的局部缺失區(qū)域，包括RBl和CREBBP (它們?cè)诎螂装┲谐０l(fā)生截?cái)嗤蛔?。最常見的局部缺失區(qū)域(可在50%腫瘤中檢測(cè)到)為9p21，其中包含CDKN2A/B基因。有趣的是，我們?cè)?4例腫瘤中(14%)發(fā)現(xiàn)位于染色體5q(常發(fā)生缺失的區(qū)域)的DHFR基因發(fā)生擴(kuò)增，并且觀察到DHFR mRNA水平上升和基因組擴(kuò)增之間存在中等強(qiáng)度的相關(guān)性(R2 =0.60，P = 0.018)。DHFR(編碼二氫葉酸還原酶的基因)的突變的突變可以作為膀胱癌突變的檢測(cè)標(biāo)志，協(xié)同其他檢測(cè)方式對(duì)膀胱癌的檢測(cè)具有重要意義。同時(shí)DHFR編碼的二氫葉酸還原酶在細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖過程嘌呤和胸苷酸合成中是必不可少的關(guān)鍵酶，也是許多根治性膀胱切除術(shù)前化療抗癌藥的靶點(diǎn)。DHFR擴(kuò)增可以作為一個(gè)生物標(biāo)志物，用來評(píng)估MTX治療膀胱癌的效果。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于公開了 DHFR在檢測(cè)膀胱癌中的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0007]1、DHFR在檢測(cè)膀胱癌中的應(yīng)用，包括下述步驟:
[0008](I)、從樣本的膀胱組織和外周血中分別提取DNA，得到DNA模板；
[0009](2)、以5對(duì)引物對(duì)為引物，分別以從樣本的膀胱組織和外周血提取的DNA為模板，分別進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增，其中引物對(duì)為:
[0010]
CCND IF5，-C'TGCGAGGAACAGAAGTGCG-3，,
CCNDlR5'-GG ATGGAGTTGTCGGTGTAG ATG-S5 ；
CDKN2A/2BF5 '-G AAGTCTTGGTCCTGATGTCCCC-3 *?
CDKN2A/2BR5, -CGGCTCTTCTGCAC AACTC AACT-3,；
DIIFEF5，-AGGGACCAGGTTGGATTAGGd,
DIIFRR5 ’-AGGGCAAGGAAGTCTTCACAGC-3';
ERBB2F5，-CTGCTGG AC ATTG ACG AG AC A-3，，
ERBB2K5 ’-TTGATGGGCACCTGGG AG-3 ’ ；
[0011](3)、根據(jù)Λ ACt來計(jì)算每個(gè)樣本的log2比值，并將其與全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)得到的拷貝數(shù)改變情況進(jìn)行比較，當(dāng)拷貝數(shù)變化超過2.5或小于1.5時(shí)或者當(dāng)用GISTIC算法得到G分?jǐn)?shù)>0.08或者G分?jǐn)?shù)〈0.08時(shí)，為膀胱癌樣本。
[0012]上述技術(shù)方案所述的DHFR在檢測(cè)膀胱癌中的應(yīng)用，其中，所述實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為:
[0013]第一步預(yù)變性:95°C 10秒，重復(fù)I次；
[0014]第二步PCR反應(yīng):95°C 5秒和60°C 30秒，重復(fù)40次。
[0015]上述技術(shù)方案所述的DHFR在檢測(cè)膀胱癌中的應(yīng)用，其中，所述實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增體系中含有:12.5μ I 2 X Premix Ex TaqU μ I DHFR 上游引物(10 μ Μ)、I μ I DHFR 下游引物(10 μ Μ)、2 μ I DNA模板和8.5 μ I d Η20(滅菌蒸懼水)。
[0016]本發(fā)明具有以下有益效果:
[0017]1、DHFR序列擴(kuò)增可以作為檢測(cè)膀胱癌的標(biāo)記物；
[0018]2、DHFR基因可以作為膀胱癌的基因靶向治療試劑盒；
[0019]3、DHFR基因有可能用于評(píng)估MTX治療膀胱癌的效果?！緦＠綀D】

【附圖說明】:
[0020] 1、圖1為RT-PCR反應(yīng)結(jié)果。
[0021 ] 2、圖2為RT-PCR反應(yīng)程序。

【具體實(shí)施方式】
:
[0022]為使本發(fā)明的技術(shù)方案便于理解，以下結(jié)合具體試驗(yàn)例對(duì)本發(fā)明DHFR在檢測(cè)膀胱癌中的應(yīng)用作進(jìn)一步的說明。
[0023]本發(fā)明實(shí)施例中未作特殊說明的操作方法均按照儀器中的說明書進(jìn)行操作。
[0024]實(shí)施例1:DHFR在檢測(cè)膀胱癌中的應(yīng)用:
[0025]一、樣本來源與及選擇標(biāo)準(zhǔn):
[0026]通過泌尿生殖系統(tǒng)癌癥基因組聯(lián)盟(UCGC)的中國(guó)成員機(jī)構(gòu)，從新檢測(cè)的患者中獲取腫瘤樣本和與其匹配的外周血或正常對(duì)照組(相鄰的形態(tài)正常的膀胱組織)。按照倫理審查委員會(huì)規(guī)定的制度，每個(gè)病人在招聘研究之前均簽署了知情同意書。患者的詳細(xì)的臨床資料見表1。
[0027]表1 99例膀胱癌患者信息
[0028]

【權(quán)利要求】
1.DHFR在檢測(cè)膀胱癌中的應(yīng)用，包括下述步驟: (1)、從樣本的膀胱組織和外周血中分別提取DNA，得到DNA模板； (2)、以5對(duì)引物對(duì)為引物，分別以從樣本的膀胱組織和外周血提取的DNA為模板，分別進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增，其中引物對(duì)為:
CCNDIF5，-CTGCGAGGAACAGAAGTGCG-3，,CCNDIK5 ’-GG ATGG AGTTGTCGGTGTAG ATG-3 ’ ；CDKN2A/2BF5 ,-GAAGTCTTGGTCCTG ATGTCCCC-35?CDKN2A/2BR5’-CGGCTCTTCTGCACAACTCAACT-3，.?DHFRF5 ’-AGGGACCAGGTTGGATTAGGC-3 ’,DHFRR5 !-AGGGCAAGGAAGTCTTCACAGC-3,:ERBB2F5，-CTGCTGGACATTGACGAGACA-3，?
ERBB2R5 ^TTGATGGGC ACCTGGGAG-3 ’ ； (3)、根據(jù)ΛΛ Ct來計(jì)算每個(gè)樣本的log2比值，并將其與全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)得到的拷貝數(shù)改變情況進(jìn)行比較，當(dāng)拷貝數(shù)變化超過2.5或小于1.5時(shí)或者當(dāng)用GISTIC算法得到G分?jǐn)?shù)>0.08或者G分?jǐn)?shù)〈0.08 時(shí)，為膀胱癌樣本。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DHFR在檢測(cè)膀胱癌中的應(yīng)用，其特征在于，所述實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為: 第一步預(yù)變性:95°C 10秒，重復(fù)I次； 第二步PCR反應(yīng):95°C 5秒和60°C 30秒，重復(fù)40次。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DHFR在檢測(cè)膀胱癌中的應(yīng)用，其特征在于，所述實(shí)時(shí)定量PCR 擴(kuò)增體系中含有:12.5μ 12XPremix Ex TaqU μ I DHFR 上游引物(10 μ Μ)、I μ IDHFR下游引物(10 μ Μ)、2 μ I DNA模板和8.5 μ I d Η20(滅菌蒸餾水)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104164482SQ201410212369
【公開日】2014年11月26日 申請(qǐng)日期:2014年5月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月20日
【發(fā)明者】吳松, 黃毅, 楊坤, 蔣濤濤, 謝暢, 毛有勝, 蔡志明 申請(qǐng)人:吳松, 蔡志明