腫瘤活組織體外培養(yǎng)系統(tǒng)及培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種腫瘤活組織的體外培養(yǎng)系統(tǒng)以及相應的腫瘤活組織體外培養(yǎng)方法。本發(fā)明所述的一種腫瘤活組織體外培養(yǎng)系統(tǒng)，包括：模擬體內(nèi)的基膜結(jié)構(gòu)及腫瘤的血供系統(tǒng)的支撐體系；腫瘤組織標本處理液，為含有二性霉素2ug/ml、青霉素1000U/ml、鏈霉素1000ug/ml的RPMI1640培養(yǎng)液；以及腫瘤組織培養(yǎng)專用培養(yǎng)基，是以DMEM與HamF?l2各50％混合液基礎(chǔ)，含有：20ug/L?bFGF、20ug/L?EGF、10ug/L?PDGF、10ug/L?HGF、10ug/L?IGF、10ug/L?NRG1、10ug/L?VEGF及5％的胎牛血清，以及500U/ml青霉素、500ug/ml鏈霉素。本發(fā)明為腫瘤組織細胞的體外培養(yǎng)提供系統(tǒng)的解決方案及合適的培養(yǎng)基。
【專利說明】腫瘤活組織體外培養(yǎng)系統(tǒng)及培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種腫瘤活組織的體外培養(yǎng)系統(tǒng)，尤其是涉及腫瘤活組織的專用體外培養(yǎng)液，也涉及相應的腫瘤活組織的體外培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]研究表明，不同類型的腫瘤具有不同的生物學特性；同種類型的腫瘤，不同的個體，其生物學特性也不相同。為了研究每一個體的腫瘤組織細胞的生物學特性，如腫瘤組織細胞對放、化療的敏感性，為腫瘤病人的診治提供依據(jù)，必需進行原代腫瘤活組織細胞的培養(yǎng)。
[0003]模擬體內(nèi)的微環(huán)境
[0004]首先，離開人體的腫瘤細胞由于改變了營養(yǎng)的吸取方式及生存的微環(huán)境，常發(fā)生失巢凋亡(anoikis)。因此，體外腫瘤組織細胞培養(yǎng)時，首先考慮必須模擬體內(nèi)的微環(huán)境，這是體外培養(yǎng)腫瘤組織細胞生存的關(guān)鍵。上皮來源的腫瘤細胞依賴貼附于某種支持物上才能生長，即所謂的貼壁依賴性細胞。在培養(yǎng)器皿表面包被生長基質(zhì)，如膠原或其它細胞外基質(zhì)成分等，模擬體內(nèi)的基膜結(jié)構(gòu)，不僅特別有利于上皮細胞的貼附和生長，也有利于培養(yǎng)細胞的分化，使細胞極性表現(xiàn)更為明顯。腫瘤細胞雖有較強克隆生長力，但仍有一定的群體性或與其它細胞相依存關(guān)系。其一，腫瘤細胞與腫瘤細胞的相互依存；其二，腫瘤細胞與基質(zhì)成纖維細胞的依賴。體外分散培養(yǎng)和排除成纖維細胞后也會同時消除或減弱這些依存關(guān)系，可能影響癌細胞生存與生長 的活性。
[0005]體外培養(yǎng)的特殊成份
[0006]由于不同的腫瘤細胞其驅(qū)動基因不同，優(yōu)勢信號轉(zhuǎn)導通路也不相同。離體后的腫瘤組織由于自分泌系統(tǒng)中生存相關(guān)因子被稀釋，達不到腫瘤生存或生長的需求，因此，在培養(yǎng)基中必須加入相應組分。
[0007]基本培養(yǎng)基的選擇
[0008]不同的培養(yǎng)基，對腫瘤組織的培養(yǎng)具有一定的差別。如M199和RPMI1640培養(yǎng)基僅適用于上皮組織的短期培養(yǎng)和維持其生存，對上皮組織的長期培養(yǎng)和促增殖作用并不明顯。DMEM和HamF12培養(yǎng)基用于上皮組織培養(yǎng)時有其特殊作用?？纱龠M上皮細胞的貼附；維持上皮細胞在體外培養(yǎng)狀態(tài)的分化。HamF12培養(yǎng)基的特殊性特別適用原代上皮細胞的培養(yǎng)，培養(yǎng)基成分中添加微量元素的無機離子，更加利于細胞的生長和代謝。在實際培養(yǎng)時，將DMEM與HamF12按一定比例混合用于上皮來源的腫瘤組織細胞的培養(yǎng)。正常細胞培養(yǎng)在不加血清或低血清不易生長或生存，腫瘤細胞在低血清培養(yǎng)基中也能生長。
[0009]防范微生物污染
[0010]不同器官的腫瘤，可能被污染的程度不同。來源于體表或襯貼消化道、呼吸道內(nèi)等處的腫瘤組織，直接暴露或同外環(huán)境相接觸，組織本身帶有各種病原微生物或受其污染的機會較多。體外培養(yǎng)時，首先必須對腫瘤組織塊進行預處理。需處理液及培養(yǎng)基。
[0011]去除非腫瘤細胞[0012]上皮組織借薄層基膜和結(jié)締組織相連。取材分離細胞時會帶入少量結(jié)締組織成分，常常造成成纖維細胞與上皮細胞混和生長，因此，必須盡可能取癌巢組織。
[0013]由于腫瘤組織細胞的體外培養(yǎng)受到上述的許多因素的影響，目前國內(nèi)外未見系統(tǒng)的解決腫瘤組織細胞培養(yǎng)方案及合適的培養(yǎng)基，也無可售的專用腫瘤組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基及培養(yǎng)技術(shù)，因此有必要開發(fā)有效的腫瘤活組織體外培養(yǎng)系統(tǒng)以及相應的培養(yǎng)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]本發(fā)明的目的在于提供一種腫瘤活組織體外培養(yǎng)系統(tǒng)，包括模擬體內(nèi)的基膜結(jié)構(gòu)及腫瘤的血供系統(tǒng)的支撐體系和腫瘤組織標本處理液與專用培養(yǎng)基，為腫瘤組織細胞的體外培養(yǎng)提供系統(tǒng)的解決方案及合適的培養(yǎng)基。
[0015]本發(fā)明所述的一種腫瘤活組織體外培養(yǎng)系統(tǒng)，包括:模擬體內(nèi)的基膜結(jié)構(gòu)及腫瘤的血供系統(tǒng)的支撐體系；腫瘤組織標本處理液，為含有二性霉素2ug/ml、青霉素1000U/ml、鏈霉素1000ug/ml的RPMI1640培養(yǎng)液；以及腫瘤組織培養(yǎng)專用培養(yǎng)基，是以DMEM與HamF12 各 50%混合液基礎(chǔ)，含有:20ug/L bFGF、20ug/L EGFU0ug/L PDGFU0ug/L HGF, lOug/LIGFUOug/L NRG1、lOug/L VEGF及 5% 的胎牛血清，以及 500U/ml 青霉素、500ug/ml 鏈霉素。
[0016]根據(jù)本發(fā)明所述的腫瘤活組織體外培養(yǎng)系統(tǒng)的進一步特征，所述支撐體系是以支架支撐的膠原包被的高吸水性的濾紙。
[0017]本發(fā)明的另一目的是提供一種腫瘤活組織體外培養(yǎng)方法。
[0018]本發(fā)明所述的腫瘤活組織體外培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
[0019]A.腫瘤組織的培養(yǎng)前處理:以腫瘤組織處理液充分浸泡腫瘤組織15 - 20分鐘；所述腫瘤組織標本處理液，為含有二性霉素2ug/ml、青霉素1000U/ml、鏈霉素1000ug/ml的RPMI1640培養(yǎng)液；
[0020]B.將浸泡過的腫瘤組織取出，鏡下切成0.5-lmm3的小塊，置于支撐體系中采用腫瘤組織培養(yǎng)專用培養(yǎng)基進行培養(yǎng)；所述支撐體系是模擬體內(nèi)的基膜結(jié)構(gòu)及腫瘤的血供系統(tǒng)的支撐體系；所述腫瘤組織培養(yǎng)專用培養(yǎng)基，是以DMEM與HamF 12各50%混合液基礎(chǔ)，含有:20ug/L bFGF、20ug/L EGFU0ug/L PDGFU0ug/L HGFUOug/L IGFUOug/L NRGlUOug/L VEGF及5%的胎牛血清，以及500U/ml青霉素、500ug/ml鏈霉素。
[0021]根據(jù)本發(fā)明所述的培養(yǎng)方法的進一步特征，所述腫瘤組織是來源于體表或襯貼消化道、呼吸道內(nèi)等處的腫瘤組織，直接暴露或同外環(huán)境相接觸的腫瘤組織。
[0022]優(yōu)選地，所述支撐體系是以支架支撐的膠原包被的高吸水性的濾紙。
[0023]本發(fā)明所述的腫瘤活組織體外培養(yǎng)系統(tǒng)，以及相應的培養(yǎng)方法，具有以下有益效果:
[0024](I)防微生物污染的處理效果:腫瘤組織尤其是來源于體表或襯貼消化道、呼吸道內(nèi)等處的腫瘤組織，直接暴露或同外環(huán)境相接觸的腫瘤組織，經(jīng)本發(fā)明所研制的處理液處理，置專用培養(yǎng)基培養(yǎng)，其污染率約為1.26%，而未處理的標本進行培養(yǎng)污染率為24.1%。
[0025](2)本發(fā)明提供了以支架支撐的膠原包被的高吸水性的濾紙作為支撐體系進行組織塊培養(yǎng)，實驗結(jié)果表明:以本發(fā)明所述支撐體系培養(yǎng)的腫瘤組織的生存與生長狀態(tài)都顯著優(yōu)于在浸泡培養(yǎng)狀態(tài)。[0026](3)在本發(fā)明所述的支撐體系下，分別以本發(fā)明研制的專用腫瘤組織培養(yǎng)基與RPMI1640培養(yǎng)基對腫瘤組織進行培養(yǎng)，培養(yǎng)5天后進行檢測，結(jié)果顯示:專用腫瘤組織培養(yǎng)基的腫瘤組織生存與生長狀態(tài)顯著優(yōu)于在RPMI1640培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)狀態(tài)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 圖1為采用本發(fā)明所述的腫瘤活組織體外培養(yǎng)系統(tǒng)與采用常規(guī)浸泡培養(yǎng)和RPMI1640培養(yǎng)基對腫瘤組織的培養(yǎng)實驗結(jié)果。
【具體實施方式】
[0028]實施例一:本發(fā)明所述的腫瘤活組織體外培養(yǎng)系統(tǒng)
[0029]本發(fā)明所述的腫瘤活組織體外培養(yǎng)系統(tǒng)采用模擬體內(nèi)的基膜結(jié)構(gòu)及腫瘤的血供系統(tǒng)的支撐體系，優(yōu)選是采用以支架支撐的膠原包被的高吸水性的濾紙。
[0030]本發(fā)明配制了兩種培養(yǎng)液，第一種是腫瘤組織標本處理液，用于腫瘤組織的培養(yǎng)前處理；第二種是腫瘤組織培養(yǎng)專用培養(yǎng)基，用于結(jié)合所述支撐體系一同使用，區(qū)別于常規(guī)的浸泡培養(yǎng)。
[0031]本發(fā)明所述腫瘤組織標本處理液是以常規(guī)的RPMI1640培養(yǎng)液為基礎(chǔ)，加入以下成分:二性霉素2ug/ml、青霉素1000U/ml、鏈霉素1000ug/ml。
[0032]本發(fā)明所述腫瘤組織培養(yǎng)專用培養(yǎng)基是以DMEM與HamF 12各50%混合液基礎(chǔ)，加入以下成分:20ug/L bFGF、20ug/L EGFU0ug/L PDGFU0ug/L HGFUOug/L IGFUOug/LNRGlUOug/L VEGF及5%的胎牛血清，以及500U/ml青霉素、500ug/ml鏈霉素。
[0033]上述處理液和培養(yǎng)基中采用的成分，均是商業(yè)上可用的試劑。
[0034]將實施例一所配置的腫瘤組織標本處理液和腫瘤組織培養(yǎng)專用培養(yǎng)基用于后面的實施例。這些腫瘤組織標本處理液和腫瘤組織培養(yǎng)專用培養(yǎng)基以及支撐體系可用于所有類型的腫瘤活組織的體外培養(yǎng)，例如來源于體表或襯貼消化道、呼吸道內(nèi)等處的腫瘤組織，直接暴露或同外環(huán)境相接觸的腫瘤組織，而不限于以下實施例所舉例說明的胃腸道的腫瘤組織。
[0035]實施例二:本發(fā)明所述的腫瘤組織標本處理液的去污、防污染效果
[0036]以胃腸道的腫瘤進行微組織塊培養(yǎng)前處理，取新鮮腫瘤組織，一組以常規(guī)含雙抗的RPMI1640的培養(yǎng)液處理，另一組以本發(fā)明所述腫瘤組織標本處理液處理。
[0037]結(jié)果顯示，以常規(guī)含雙抗的RPMI1640的培養(yǎng)液處理組，32例胃癌中6例污染、47例腸癌中13例被污染。而以本發(fā)明所述腫瘤組織標本處理液處理的標本，只有I例腸癌被污染。
[0038]結(jié)論:本發(fā)明所述腫瘤組織標本處理液處理去污、防污效果顯著優(yōu)于常規(guī)含雙抗的RPMI1640的培養(yǎng)液處理(P〈0.05)。見表1。
[0039]表1:腫瘤組織標本處理液的去污、防污染效果
[0040]
【權(quán)利要求】
1.一種腫瘤活組織體外培養(yǎng)系統(tǒng)，其特征在于，所述系統(tǒng)包括: 模擬體內(nèi)的基膜結(jié)構(gòu)及腫瘤的血供系統(tǒng)的支撐體系； 腫瘤組織標本處理液，為含有二性霉素2ug/ml、青霉素1000U/ml、鏈霉素1000ug/ml的RPMI1640培養(yǎng)液；以及 腫瘤組織培養(yǎng)專用培養(yǎng)基，是以DMEM與HamF 12各50 %混合液基礎(chǔ)，含有:20ug/LbFGF、20ug/L EGFU0ug/L PDGFUOug/L HGFUOug/L IGFUOug/L NRGU10ug/L VEGF及 5%的胎牛血清，以及500U/ml青霉素、500ug/ml鏈霉素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腫瘤活組織體外培養(yǎng)系統(tǒng)，其特征在于:所述支撐體系是以支架支撐的膠原包被的高吸水性的濾紙。
3.一種腫瘤活組織體外培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟: A.腫瘤組織的培養(yǎng)前處理:以腫瘤組織處理液充分浸泡腫瘤組織15- 20分鐘；所述腫瘤組織標本處理液，為含有二性霉素2ug/ml、青霉素1000U/ml、鏈霉素1000ug/ml的RPMI1640培養(yǎng)液； B.將浸泡過的腫瘤組織取出，鏡下切成0.5-lmm3的小塊，置于支撐體系中采用腫瘤組織培養(yǎng)專用培養(yǎng)基進行培養(yǎng)；所述支撐體系是模擬體內(nèi)的基膜結(jié)構(gòu)及腫瘤的血供系統(tǒng)的支撐體系；所述腫瘤組織培養(yǎng)專用培養(yǎng)基，是以DMEM與HamF 12各50%混合液基礎(chǔ)，含有:20ug/L bFGF、20ug/L EGFU0ug/L PDGF、10ug/L HGF、10ug/L IGFUOug/L NRGUlOug/LVEGF及5%的胎牛血清 ，以及500U/ml青霉素、500ug/ml鏈霉素。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)方法，其特征在于:所述腫瘤組織是來源于體表或襯貼消化道、呼吸道內(nèi)等處的腫瘤組織，直接暴露或同外環(huán)境相接觸的腫瘤組織。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)方法，其特征在于:所述支撐體系是以支架支撐的膠原包被的高吸水性的濾紙。
【文檔編號】C12N5/09GK103966168SQ201410212174
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月19日
【發(fā)明者】符立梧, 梁永鉅, 王仁友 申請人:廣州恒迪生物科技有限公司