技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一個(gè)基因的三種探針及其設(shè)計(jì)方法，尤其是一種動(dòng)力相關(guān)蛋白1基因crna原位雜交的探針及其制備方法。

背景技術(shù)：
：

神經(jīng)元作為神經(jīng)系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)和功能單元，具有高度極化細(xì)胞，軸突和樹(shù)突，常需要大量能量以維持正常神經(jīng)回路。而線粒體作為細(xì)胞持續(xù)供能的場(chǎng)所，在神經(jīng)元的發(fā)育及功能中發(fā)揮重要作用。其中線粒體的數(shù)量、質(zhì)量及分布三者直接決定神經(jīng)元的功能。

線粒體表現(xiàn)在形態(tài)上的動(dòng)力學(xué)改變，處于不斷的融合與分裂過(guò)程中。線粒體的融合與分裂的動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程對(duì)正常細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)及生理機(jī)能的維持至關(guān)重要。其中動(dòng)力相關(guān)蛋白1(dynamin-relatedprotein1,drp1)是調(diào)控線粒體分裂的關(guān)鍵蛋白。在線粒體分裂過(guò)程中drp1轉(zhuǎn)移至線粒體外膜上，進(jìn)行組裝和寡聚化，通過(guò)gtp水解作用使線粒體外膜分裂為兩部分。而分裂蛋白主要是通過(guò)對(duì)drp1的綁定和募集促進(jìn)分裂的。研究發(fā)現(xiàn)，drp1的活性還與多種神經(jīng)退行性疾病是緊密相連。因此，對(duì)drp1的研究將有助于我們深入理解線粒體在神經(jīng)系統(tǒng)中的重要功能意義，為疾病的發(fā)病機(jī)制研究提供新的思路，以期尋找到新的治療靶點(diǎn)。

熒光原位雜交技術(shù)是根據(jù)已知特異的dna序列，設(shè)計(jì)合成特異寡聚核苷酸探針，利用熒光標(biāo)記與生物體中互補(bǔ)的核苷酸雜交，通過(guò)熒光進(jìn)行精確定量定位，檢測(cè)生物體中核苷酸的存在與表達(dá)豐度。而關(guān)于利用熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)drp1基因在活體動(dòng)物中mrna豐度顯示尚屬空白。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
：

本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種動(dòng)力相關(guān)蛋白1基因用于熒光原位雜交的引物及探針的設(shè)計(jì)和制備方法。

本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)解決的：

一種動(dòng)力相關(guān)蛋白1基因crna原位雜交的探針，同一個(gè)基因，分別從中間找出三種不同大小的片段設(shè)計(jì)并合成引物。

drp1基因片段1的序列為：

5'gctcagtgctggaaagcctagtgggcagggaccttcttcccagaggaactggtgtggtcacccggagacctctcattctgcagctagtccacgtttcaccagaagataaaagaaaaacaacaggagaagaaaatgaaatttcagagctggagagttgaagcagaagaatggggtaaatttcttcacaccaaaaacaagctttacacagattttatgaaattcgacaagaaattgaaaatgaaactgaaagaatttcaggaaataataagggggtaagccctgagccaatccatc3′

drp1基因片段2的序列為：

5'ttcgtaaaaggttgcccgtgacaaatgaaatggtgcataacttagtggcaattgagctagcgtatatcaacacaaaacaccccgactttgctgatgcctgtgggctaatgaacaataatatagaggaacaaagaagaaacaggctagcaagagagctgccttcagctggatcacgggacaagttaattcaggacaacagaagagaaactaaaaatgtcccatctgcaggtggtgggattggagacggtggtcaggaaccaacaaca3′

drp1基因片段3的序列為：

5'catctgcaggtggtgggattggagacggtggtcaggaaccaacaacaggcaactggagaggaatgctgaaaacttcaaaagctgaagaattacttgctgaagaaaaatcaaaaccaattccaattatgccagcaagtccacagaaaggccatgctgtcaatttgctagatgtgccagttccagttgcaa3′

所述探針的制備方法：

(1)根據(jù)drp1基因的genebank序列我們?cè)O(shè)計(jì)了3對(duì)drp1特異的引物；

(2)構(gòu)建drp1基因的crna原位雜交的探針質(zhì)粒；將探針質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌后，細(xì)菌培養(yǎng)后進(jìn)行測(cè)序；

(3)制備drp1基因的crna原位雜交探針；

(4)檢測(cè)drp1基因的crna探針的原位雜交。

所述步驟(1)drp1基因3對(duì)引物如下：

所述步驟(2)按照如下步驟進(jìn)行：

(a)將小鼠的cdna用drp1基因的3對(duì)特異的引物分別進(jìn)行pcr擴(kuò)增；

(b)將pcr產(chǎn)物用omega膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收；

(c)將回收后的產(chǎn)物使用ta克隆載體試劑盒于室溫與多克隆位點(diǎn)兩端具有t7，sp6啟動(dòng)子的載體進(jìn)行連接；

(d)將連接好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α，培養(yǎng)；

(e)使用天跟質(zhì)粒提取試劑盒提取探針質(zhì)粒后進(jìn)行測(cè)序；

所述步驟(3)按照如下步驟進(jìn)行：

(a)步驟(2)的到的細(xì)菌測(cè)序正確后，經(jīng)判斷確認(rèn)drp1探針序列插入載體的順序是正向的；

(b)以測(cè)序正確的drp1探針質(zhì)粒為模板，使用t7，sp6特異引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增；

(c)將pcr產(chǎn)物用omega膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收；

(d)用t7-rna聚合酶/sp6-rna聚合酶對(duì)探針進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記；

所述步驟(4)按照如下步驟進(jìn)行：

(a)取材并固定包埋組織及切片；

所述取材及固定的方式：將小鼠用7％水合氯醛深麻后，經(jīng)左心室用0.01mol/l的depc-pbs快速?zèng)_洗去除血液，再以4％depc-多聚甲醛灌注固定24h；將組織轉(zhuǎn)移并浸沒(méi)于30％蔗糖溶液中脫水至沉底48h；

所述的0.01mol/ldepc-pbs是2.9gna2hpo4·12h2o，0.29gnah2po4·12h2o，9.0gnacl用ddh2o定容至1l后，再加入體積百分比為0.1％的depc1ml放置過(guò)夜后，高壓滅菌制成的磷酸鹽緩沖液；

所述4％的多聚甲醛是40g多聚甲醛加入500ml蒸餾水加熱使之解聚溶解后，再加入500ml的0.2mol/lpb緩沖液定容至1000ml，pb的終濃度為0.1mol/l；

所述0.2mol/lpb緩沖液為29.01gna2hpo4·12h2o，2.965nah2po4·12h2o加ddh2o定容至1000ml，再加入體積百分比為0.1％的depc1ml放置過(guò)夜后，高壓滅菌制成的磷酸鹽緩沖液；

所述包埋組織方法：取出固定的組織用包埋劑otc包埋；將包埋好的組織進(jìn)行切片：將組織切成25～30μm組織切片，并將切好的切片保存于0.01mol/l的depc-pbs中，放于4℃冰箱備用；

(b)選取上述組織切片與室溫條件下經(jīng)含有2％h2o2的0.1mol/ldepc-pb處理10min以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；

(c)用0.3％tritonx-100的0.1mol/ldepc-pb處理20min；

(d)用乙?；禾幚斫M織切片10min；

(e)用0.1mol/ldepc-pb清洗組織切片2次，每次10min；

(f)接著將組織放入預(yù)雜交液中，58-60℃預(yù)雜交1h以封閉非特異結(jié)合為點(diǎn)；

所述預(yù)雜交液1ml是由500ul的去離子甲酰胺，250ul的20xssc溶液，200μl的10％阻斷劑，50ul的2％的nls溶液，10ul的10％的sds溶液配制而成。

所述10％阻斷劑是由4g的阻斷劑溶于0.1m的馬來(lái)酸緩沖液中配制而成；所述0.1m馬來(lái)酸緩沖液為464mg馬來(lái)酸，351mg的nacl溶于ddh2o中，使用naoh調(diào)節(jié)ph至7.5，定容至40ml，高壓滅菌。

(g)在預(yù)雜交液中加入drp1探針終濃度為1ng/ul，于58-60℃雜交爐中恒溫孵育16-20h；

(h)雜交后用washbuffer洗滌雜交的組織切片，58℃，2次，每次20min；

所述washbuffer10ml是由5ml的去離子甲酰胺，1ml的20xssc溶液，500ul2％的nls溶于ddh2o中配制而成；

(l)用rnasebuffer洗滌上述的組織切片，室溫孵育5min；

所述rnasebuffer10ml為1mtris-hcl，ph8.0，0.5medta，5mnacl溶于ddh2o中配制而成；

(j)加入終濃度為20ug/ml的rnasea處理，37℃恒溫孵育30min，以消化未結(jié)合的crna探針；

(k)用2xssc，2％nls洗滌上述的組織切片，37℃恒溫孵育2次，每次20min；

(l)用0.2xssc，2％nls洗滌上述的組織切片，37℃恒溫孵育2次，每次20min；

(m)將組織切片放在ts7.5溶液中室溫孵育5min；所述ts7.5由1mtris-hcl，ph8.0，5mnacl溶于ddh2o中配制而成；

(n)將組織切片于tbs中室溫封閉1h；

所述tbs為含有1％阻斷劑的ts7.5溶液；

(o)在組織切片加入地高辛抗體，效價(jià)為1:100-1:1500，室溫孵育過(guò)夜；

(p)將上述切片tnt中室溫洗滌2次，每次10min；

(q)將切片用0.1mol/lpb室溫洗滌10min；

(r)加入β-d-glucose(200mg/ml)1:100稀釋?zhuān)覝胤跤?0min；

(s)將切片用0.1mol/lpb室溫洗滌10min；tnt中室溫洗滌2次，每次10min；

(t)加入含有fitc-avidin(1:500)的tbs溶液避光室溫孵育3h；

(u)將上述切片tnt中室溫洗滌3次，每次10min；

(v)使用熒光封片劑將上述組織切片封片，熒光顯微鏡下觀察。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明對(duì)活體動(dòng)物建立模型后進(jìn)行灌注、取材、切片，通過(guò)地高辛標(biāo)記的crna探針與組織中drp1基因的mrna發(fā)生特異性的結(jié)合，加入熒光抗體，方便、準(zhǔn)確的觀察到組織中drp1基因mrna水平的變化。本發(fā)明使用的動(dòng)力相關(guān)蛋白1的探針序列，對(duì)動(dòng)力相關(guān)蛋白1基因mrna的顯示有明確的特異性，實(shí)現(xiàn)了對(duì)drp1基因mrna水平的顯示作用。

附圖說(shuō)明：

圖1為本發(fā)明的drp1的引物1在大腦皮層的分布x60倍圖；

圖2為本發(fā)明的drp1的引物2在大腦皮層的分布x60倍圖；

圖3為本發(fā)明的drp1的引物3在大腦皮層的分布x60倍圖；

具體實(shí)施方式：

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)描述：

參見(jiàn)圖1，圖2和圖3，drp1基因crna原位雜交探針的制備方法，按照如下步驟

(1)根據(jù)drp1基因的genebank序列我們?cè)O(shè)計(jì)合成3對(duì)drp1基因特異的引物，并且分別擴(kuò)增制備crna探針；

(2)構(gòu)建drp1基因的crna原位雜交的探針質(zhì)粒；將探針質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌后，細(xì)菌培養(yǎng)后進(jìn)行測(cè)序；

(3)制備drp1基因的crna原位雜交探針；

(4)檢測(cè)drp1基因的crna探針的原位雜交。

探針的設(shè)計(jì)：

根據(jù)drp1基因的genebank序列我們?cè)O(shè)計(jì)合成了3對(duì)drp1基因特異的引物，并且分別擴(kuò)增制備crna探針；

drp1基因3對(duì)特異的引物如下：

drp1基因的crna原位雜交的探針質(zhì)粒的構(gòu)建：

1.將小鼠的cdna用三對(duì)引物分別進(jìn)行pcr擴(kuò)增；

2.將pcr產(chǎn)物用omega膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收；

3.將回收后的產(chǎn)物使用ta克隆載體試劑盒于室溫與多克隆位點(diǎn)兩端具有t7，sp6啟動(dòng)子的載體進(jìn)行連接；

4.將連接好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌后，搖菌培養(yǎng)提取質(zhì)粒送上海生工公司進(jìn)行測(cè)序。

drp1基因的crna原位雜交探針的制備：

1.測(cè)序正確后，經(jīng)判斷確認(rèn)drp1基因3對(duì)探針序列插入載體的順序是正向的；

2.以測(cè)序正確的drp1探針質(zhì)粒為模板，使用t7，sp6特異引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增；

3.將pcr產(chǎn)物用omega膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收。

4.用t7-rna聚合酶/sp6-rna聚合酶對(duì)探針進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記，體外轉(zhuǎn)錄的試劑盒(ambionmegascript)是ambion公司的產(chǎn)品。

drp1基因的crna探針的原位雜交檢測(cè)：

1.取材并固定包埋組織及切片；

所述取材方法：將小鼠用7％水合氯醛深麻后，經(jīng)左心室用0.01mol/l的depc-pbs快速?zèng)_洗去除血液，再以4％depc-多聚甲醛灌注固定24h；

所述固定組織方法：將組織轉(zhuǎn)移并浸沒(méi)于30％蔗糖溶液中脫水至沉底48h；

所述包埋組織方法：取出固定的組織用包埋劑otc包埋；將包埋好的組織進(jìn)行切片：將組織切成25～30μm組織切片，并將切好的切片保存于0.01mol/l的depc-pbs中，放于4℃冰箱備用；

2.選取上述組織切片與室溫條件下經(jīng)含有2％h2o2的0.1mol/ldepc-pb處理10min以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；

3.用0.3％tritonx-100的0.1mol/ldepc-pb處理20min；

4.用乙?；禾幚斫M織切片10min；

5.用0.1mol/ldepc-pb清洗組織切片2次，每次10min；

6.接著將組織放入預(yù)雜交液中，58-60℃預(yù)雜交1h以封閉非特異結(jié)合為點(diǎn)；

7.在預(yù)雜交液中加入drp1探針終濃度為1ng/ul，于58-60℃雜交爐中恒溫孵育16-20h；

8.雜交后用washbuffer洗滌雜交的組織切片，58℃，2次，每次20min；

9.用rnasebuffer洗滌上述的組織切片，室溫孵育5min；

10.加入終濃度為20ug/ml的rnasea處理，37℃恒溫孵育30min，以消化未結(jié)合的crna探針；

11.用2xssc，2％nls洗滌上述的組織切片，37℃恒溫孵育2次，每次20min；

12用02xssc，2％nls洗滌上述的組織切片，37℃恒溫孵育2次，每次20min；

13.將組織切片放在ts7.5溶液中室溫孵育5min；所述ts7.5由1mtris-hcl，ph8.0，5mnacl溶于ddh2o中配制而成；

14.將組織切片于tbs中室溫封閉1h；

15.在組織切片加入地高辛抗體，效價(jià)為1:100-1:1500，室溫孵育過(guò)夜；

16.將上述切片tnt中室溫洗滌2次，每次10min；

17.將切片用0.1mol/lpb室溫洗滌10min；

18.加入β-d-glucose(200mg/ml)1:100稀釋?zhuān)覝胤跤?0min；

19.將切片用0.1mol/lpb室溫洗滌10min；將上述切片tnt中室溫洗滌2次，每次10min；

20.加入含有fitc-avidin(1:500)的tbs溶液避光室溫孵育3h；

21.將上述切片tnt中室溫洗滌3次，每次10min；

22.使用熒光封片劑將上述組織切片封片，熒光顯微鏡下觀察。

所用試劑：

omega膠回收試劑盒，公司：omega，貨號(hào)：d2500-01

質(zhì)粒提取試劑盒，公司：天跟，貨號(hào)：dp103-02

ta克隆試劑盒，公司：invitrogen，貨號(hào)：450640

兩端具有t7，sp6啟動(dòng)子的載體，公司：invitrogen貨號(hào)：am1322

t7rna聚合酶試劑盒，公司：roche貨號(hào)：11685619910

sp6rna聚合酶試劑盒，公司：roche貨號(hào)：11685619910

20xssc公司：invitrogen，貨號(hào)：am9763

anti-digoxigenin-pod，公司：roche，貨號(hào)：11207733910

anti-fluorescein-pod，公司：roche，貨號(hào)：11426346910

labvision^tmliquidfast-redsubstratesystem，公司：thermoscientific^tmta-060-al

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制，雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例揭露如上，然而并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉本專(zhuān)業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案范圍內(nèi)，當(dāng)可利用上述揭示的方法及技術(shù)內(nèi)容作出些許的更動(dòng)或修飾為等同變化的等效實(shí)施例，但凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與修飾，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。