本發(fā)明涉及家畜飼養(yǎng)及疾病防治領(lǐng)域，尤其是一種快速檢測(cè)鴨瘟病毒lamp試劑盒。

背景技術(shù)：

鴨瘟(duckplague，dp)又稱(chēng)鴨病毒性腸炎(duckviralenteritis，dve)，是由皰疹病毒科的鴨瘟病毒(duckplaguevirus，dpv)引起的鴨、鵝和天鵝等水禽類(lèi)的一種急性、熱性、敗血性傳染病，主要臨床特征為體溫升高、兩腿麻痹、下痢、流淚和部分病鴨頭、頸部腫大，故該病在我國(guó)有些地方俗稱(chēng)“大頭瘟”。鴨瘟自1923年首次在荷蘭報(bào)道，之后在世界各地許多養(yǎng)鴨國(guó)家均報(bào)導(dǎo)有該病的發(fā)生和流行，我國(guó)于1957年在廣州首次發(fā)現(xiàn)該病。多年來(lái)鴨瘟以高達(dá)90％的死亡率引起社會(huì)廣泛關(guān)注，另外該病傳播速度很快，加上集約化養(yǎng)鴨業(yè)鴨群密度高、流動(dòng)頻繁、極易引起流行，而且該病在一個(gè)大流行期后常呈地方性流行，長(zhǎng)期危害養(yǎng)鴨業(yè)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

目前對(duì)鴨瘟病毒的檢測(cè)方法主要有病毒分離鑒定、elisa法、血清中和試驗(yàn)及pcr技術(shù)等。但病毒分離鑒定方法在低毒力或非致病性毒株情況下可能不引起臨床癥狀；血清學(xué)中和試驗(yàn)雖然結(jié)果準(zhǔn)確，但程序復(fù)雜，耗時(shí)費(fèi)力，不能用于快速診斷及大批量樣品的檢測(cè)；elisa是目前使用最為廣發(fā)的一種方法，具有經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、快速的特點(diǎn)，但靈敏度較pcr技術(shù)而言稍有差距；傳統(tǒng)pcr技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，但該檢測(cè)方法成本高，對(duì)操作者技術(shù)及反應(yīng)儀器要求較高，擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，不利于快速檢測(cè)及在基層實(shí)驗(yàn)室的推廣應(yīng)用。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)是由日本學(xué)者notomi等建立的一種新的核酸擴(kuò)增方法，原理是利用4條特殊設(shè)計(jì)的引物及具有鏈置換活性的bstdna聚合酶，在恒溫條件下特異、高效、快速地?cái)U(kuò)增dna，在1h內(nèi)能達(dá)到109靶序列拷貝。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是：提供一種快速檢測(cè)鴨瘟病毒lamp試劑盒，它能快速、準(zhǔn)確的對(duì)鴨瘟病毒進(jìn)行檢測(cè)，并且成本低廉，使用方便，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：快速檢測(cè)鴨瘟病毒lamp試劑盒，在25μl體系dpv-tklamp擴(kuò)增體系中包括，濃度為5mol/l的甜菜堿5μl，濃度為8000u/mlbstdna的聚合酶0.8μl，濃度為0.1mol/l的硫酸鎂1.0μl，濃度為0.25mol/l的dntps1.4μl，濃度為10pmol/μl的外引物f3/b3各0.5μl，濃度為10pmol/μl的內(nèi)引物fip/bip各4.0μl，dna模板1μl，1μlbybrgreeni，其余由無(wú)核酸酶ddh2o補(bǔ)足至25μl，其中，外引物f3的序列為5’-tgcgaacgcttaatccgg-3’，外引物b3的序列為5’-tgctatgtcacctcgagct-3’；內(nèi)引物fip的序列為5’-ggttttgccagttccatacggc-tttt-ccttcgatgccattatgcct-3’，內(nèi)引物bip的序列為5’-ggttttgccagttccatacggc-tttt-ccttcgatgccattatgcct-3’；該體系在62℃擴(kuò)增60min。

為了驗(yàn)證本發(fā)明的技術(shù)效果，進(jìn)行了以下試驗(yàn)：

1材料和方法

1.1材料

1.1.1菌株本試驗(yàn)的dpv活疫苗(雞胚化弱毒株)購(gòu)自南京天邦生物技術(shù)有限公司，鴨疫里默氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)微生物保藏管理中心(cvcc)；dpvgz株由貴州大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院惠贈(zèng)；dpvchv強(qiáng)毒株、大腸桿菌、鴨疫里默氏巴氏桿菌、鴨沙門(mén)氏菌由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定后保存。

1.1.2試劑和儀器bst2.0dna聚合酶購(gòu)自newenglandbiolabs公司；betaine(甜菜堿)、mgso4購(gòu)自sigma公司；dntps、無(wú)核酸酶ddh2o、dl500dnamaker、基因組dna提取試劑dnaisoreagant、購(gòu)自寶生物(大連)工程有限公司；goldview核酸染料、50×taebuffer購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；梯度pcr儀(veriti)，appliedbiosystems公司；凝膠成像儀(alphaimagerhp)，美國(guó)alphainnotech公司。

1.1.3引物根據(jù)genbank中dpvtk基因序列(ncbi登錄號(hào)為dq640611.1)，通過(guò)網(wǎng)址http://primerexplorer.jp/e/index.html設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物，即f3/b3和fip/bip，序列如下：

以上引物均委托寶生物(大連)工程有限公司。

1.2方法

1.2.1病毒dna的提取根據(jù)基因組dna提取試劑dnaisoreagant說(shuō)明書(shū)所示提取dpv基因組dna，提取出的dna溶解于適量的無(wú)核酸酶ddh2o中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2陽(yáng)性對(duì)照樣品的制備將外引物pcr擴(kuò)增產(chǎn)物用dna凝膠回收試劑盒純化后，克隆到載體pmd19－t上，經(jīng)pcr及測(cè)序分析后，提取質(zhì)粒dna作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.3lamp反應(yīng)條件優(yōu)化根據(jù)lamp反應(yīng)條件，對(duì)betaine、bstdna聚合酶、mgso4、dntps及內(nèi)引物(由于外引物對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響很小)的濃度等條件進(jìn)行優(yōu)化。betaine(5mol/l)在25μl反應(yīng)體系中的加入量分別為：2μl、3μl、4μl、5μl、6μl、7μl、8μl；bstdnapolymerase(8000u/ml)加入量分別為：0.6μl、0.8μl、1.0μl、1.2μl、1.4μl、1.6μl、1.8μl、2μl；mgso4(0.1mol/l)加入量分別為：0.4μl、0.6μl、0.8μl、1.0μl、1.2μl、1.4μl、1.6μl、1.8μl；dntps(0.25mol/l)加入量分別為：1.0μl、1.2μl、1.4μl、1.6μl、1.8μl、2.0μl、2.2μl、2.4μl；內(nèi)引物fip/bip(10pmol/μl)加入量分別為：1.5μl、2.0μl、2.5μl、3.0μl、3.5μl、4.0μl、4.5μl、5.0μl、5.5μl、6.0μl。逐個(gè)對(duì)條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化時(shí)其他條件不變，以確定最佳反應(yīng)體系。擴(kuò)增溫度分別為：60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃，以確定最適擴(kuò)增溫度。反應(yīng)時(shí)間按15min、30min、45min、60min、90min、120min，以確定最優(yōu)反應(yīng)時(shí)間。

1.2.4特異性試驗(yàn)用6株dpv和8株非dpv進(jìn)行驗(yàn)證。提取其基因組dna運(yùn)用試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證試劑盒檢測(cè)dpv的種屬特異性。

1.2.5敏感性試驗(yàn)按照基因組dna提取試劑dnaisoreagant說(shuō)明書(shū)所示，提取dpvdna，通過(guò)紫外分光光度計(jì)檢濃度后，通過(guò)倍比稀釋為：10ng/ml、1ng/ml、100pg/ml、10pg/ml、1pg和0.1pg/ml，進(jìn)行l(wèi)amp擴(kuò)增反應(yīng)，確定試劑盒的檢出限。

1.2.6臨床樣本檢測(cè)采集的病鴨樣品共80份，使用基因組dna提取試劑dnaisoreagant提取基因組dna，用本研究研制的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，并與dpv病原pcr檢測(cè)技術(shù)(gb/t22332-2008)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。

2結(jié)果

2.1重組陽(yáng)性對(duì)照品的克隆測(cè)序

構(gòu)建的試劑盒陽(yáng)性(質(zhì)粒)對(duì)照經(jīng)寶生物(大連)工程有限公司測(cè)序，序列大小為240bp，與設(shè)計(jì)一致。將此序列在ncbi中進(jìn)行blast比對(duì)分析，結(jié)果表明，該序列與genbank上dpv病毒的tk基因同源性大于99％。

2.2反應(yīng)體系

經(jīng)過(guò)對(duì)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的摸索和調(diào)整(如圖1-7所示)，確定在25μl體系dpv-tklamp擴(kuò)增體系為：betaine(5mol/l)5μl，bstdna聚合酶(8000u/ml)0.8μl，mgso4(0.1mol/l)1.0μl，dntps(0.25mol/l)1.4μl，外引物f3/b3(10pmol/μl)0.5μl，內(nèi)引物fip/bip(10pmol/μl)4.0μl，dna模板1μl，1μlbybrgreeni，無(wú)核酸酶ddh2o補(bǔ)足至25μl，62℃擴(kuò)增60min。將擴(kuò)增結(jié)束后的反應(yīng)管置于紫外燈背景下觀察。陰性反應(yīng)管液體為無(wú)色，陽(yáng)性反應(yīng)管液體發(fā)出綠色熒光(圖8)。

2.3特異性

用建立的lamp方法對(duì)dpv，鴨疫里默氏菌，鴨源性多殺性巴氏桿菌，大腸桿菌、鴨沙門(mén)氏菌及健康鴨進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示(圖9)，鴨疫里默氏菌，鴨源性多殺性巴氏桿菌，大腸桿菌、鴨沙門(mén)氏菌及健康鴨均未出現(xiàn)條帶，只有dpvdna為模板的第一條泳道擴(kuò)增出了lamp反應(yīng)典型的梯狀條帶。

2.4敏感性

應(yīng)用試劑盒對(duì)dpv各個(gè)稀釋度基因組dna提取液進(jìn)行檢測(cè)后，如圖9所示，模板dna稀釋度大于1pg/ml時(shí)，均可檢測(cè)出擴(kuò)增產(chǎn)物，0.1pg/ml及0.01pg/mldna模板量下，電泳無(wú)法檢測(cè)出擴(kuò)增產(chǎn)物。因此，該試劑盒對(duì)于dpvdna量的檢出限為1pg/ml。

2.5臨床樣本檢測(cè)

應(yīng)用該試劑盒通過(guò)對(duì)200份樣品進(jìn)行檢測(cè)，有33份樣品中檢出dpv，檢出率為16.5％，與dpv病原pcr檢測(cè)技術(shù)(gb/t22332-2008)檢測(cè)結(jié)果完全一致，但比dpv病原pcr檢測(cè)技術(shù)(gb/t22332-2008)更快速和簡(jiǎn)便。

3討論

dpv屬于α皰疹病毒亞科，是一種泛噬性全身性感染的病毒，能夠引起鴨、鵝和天鵝的急性敗血，感染病鴨以腦、脾、肝、食道、泄殖腔的含毒量最高。該病發(fā)病快、傳播速度快，成鴨感染后發(fā)病率較雛鴨高，死亡率高達(dá)90％左右，目前已經(jīng)成為危害水禽最為嚴(yán)重的疾病之一，給養(yǎng)鴨業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失?；诮鼛啄陙?lái)鴨瘟的臨床癥狀逐漸不明顯，時(shí)而伴隨細(xì)菌性或病毒性疾病的發(fā)生，增加了臨床診斷的難度。因此，實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)包括：病毒的分離鑒定，分子生物學(xué)診斷及血清學(xué)診斷的需求日趨明顯。

lamp是由notomi等學(xué)者在2000年開(kāi)發(fā)的一項(xiàng)核酸檢測(cè)新技術(shù)，這項(xiàng)技術(shù)雖然反應(yīng)原理復(fù)雜，但反應(yīng)時(shí)間為30-60min，只需一個(gè)恒溫箱或水浴鍋即可完成反應(yīng)，可通過(guò)觀察白色沉淀的生成或加入染料后顏色的變化、凝膠電泳結(jié)果來(lái)判斷反應(yīng)是否發(fā)生，與傳統(tǒng)pcr技術(shù)相比告別了昂貴的pvr儀，操作簡(jiǎn)單，更加方便快捷，有利于疫病的檢測(cè)控制，特別適合基層、養(yǎng)殖戶(hù)及出入境檢疫的病原快速診斷。

胸腺激酶(thymidinekinase,tk)基因?qū)儆诎捳畈《镜脑缙诨蚝椭饕亩玖蛑?，缺失tk基因的毒株在非分裂細(xì)胞中的復(fù)制能力極弱，但免疫原性卻沒(méi)有發(fā)生改變。因其特有的安全性，使得tk基因成為構(gòu)建皰疹病毒基因缺失疫苗的首選靶基因。已有研究表明，dpvtk基因與禽類(lèi)皰疹病毒(α-皰疹病毒)的進(jìn)化關(guān)系最近。本研究首次選用tk基因作為lamp檢測(cè)的目的基因，經(jīng)blastn比對(duì)分析，理論上保證擴(kuò)增片段位于tk基因的保守區(qū)段，經(jīng)過(guò)對(duì)實(shí)際菌株樣本的進(jìn)一步檢測(cè)驗(yàn)證，表明本研究建立的lamp試劑盒能夠特異性檢測(cè)和鑒定dpv，并且與養(yǎng)殖生產(chǎn)中產(chǎn)檢的病原：鴨疫里默氏桿菌、鴨多殺性巴氏桿菌、大腸桿菌和鴨沙門(mén)氏菌無(wú)交叉反應(yīng)，具有很強(qiáng)的特異性，有效避免了假陽(yáng)性結(jié)果的產(chǎn)生。有文獻(xiàn)報(bào)道，而魏雪濤等^[6]研究者建立的鴨瘟病毒pcr檢測(cè)靈敏度為15pg/ml，而本研究建立的dpvlamp檢測(cè)試劑盒檢測(cè)dpv基因組dna靈敏度達(dá)1pg/ml，檢測(cè)靈敏度高于常規(guī)pcr檢測(cè)手段。余洋建立的dpvtaqman實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法同樣以tk基因作為檢測(cè)目的基因，靈敏度約為5copies/μl，在3h內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)dvp診斷的同時(shí)，也實(shí)現(xiàn)了對(duì)病毒的定量檢測(cè)，但該檢測(cè)成本高，需要操作者較高的試驗(yàn)操作水平，而目前我國(guó)大部分基層動(dòng)物預(yù)控中心及養(yǎng)殖場(chǎng)仍未配備熒光定量pcr儀或普通pcr儀。本研究利用lamp技術(shù)，能夠在不具備熒光定量pcr儀及普通pcr儀的條件下，將檢測(cè)時(shí)間(包括樣品處理)縮短至2h以?xún)?nèi)，檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便，擴(kuò)增完成后無(wú)需打開(kāi)反應(yīng)管蓋，可直接于紫外燈下觀察產(chǎn)物顏色的變化來(lái)判斷病原感染情況，最大程度地避免了假陽(yáng)性的產(chǎn)生。綜上所述，本研究所建立的dpv診斷診斷試劑盒靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)時(shí)間短、操作簡(jiǎn)便，更適用于低污染量樣品的檢測(cè)，通過(guò)也滿(mǎn)足了基層實(shí)驗(yàn)室或養(yǎng)殖場(chǎng)大規(guī)模普查需要，具有廣闊的推廣應(yīng)用前景。

由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明構(gòu)建了一套完整的lamp體系，lamp擴(kuò)增法可使用水浴鍋或保溫杯進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果肉眼可見(jiàn)，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，特別適合基層現(xiàn)場(chǎng)檢疫，且敏感性高。檢測(cè)時(shí)間(含樣品處理時(shí)間)由原來(lái)的3-4h縮短為2h，其檢測(cè)限達(dá)1pg/ml，特異性為100％，無(wú)假陽(yáng)性和假陰性出現(xiàn)。利用該試劑盒與dpv病原pcr檢測(cè)方法(gb/t22332-2008)分別檢測(cè)200個(gè)病鴨樣品中的鴨瘟病毒，兩種方法的符合率達(dá)100％。本發(fā)明試劑盒具有高效、特異性強(qiáng)和敏感性高等特點(diǎn)，可滿(mǎn)足大批量樣品快速檢測(cè)的要求。因此建立的lamp診斷方可進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，并且結(jié)果準(zhǔn)確，使用方便。

附圖說(shuō)明

圖1mgso4濃度優(yōu)化；

m:dl500marker；1:1.8μl；2:1.6μl；3:1.4μl；4:1.2μl；5:1.0μl；6:0.8μl；7:0.6μ；8:0.4μl；

圖2betaine濃度優(yōu)化；

m:dl500marker；1:8μl；2:7μl；3:6μl；4:5μl；5：4μl；6:3μl；7:2μl；

圖3dntp濃度優(yōu)化；

m:dl500marker；1:1.0μl；2:1.2μl；3:1.4μl；4:1.6μl；5:1.8μl；6:2.0μl；7:2.2μl；8:2.4μl

圖4bstdna聚合酶濃度優(yōu)化；

m:dl500marker；1:0.6μl；2:0.8μl；3:1.0μl；4:1.2μl；5:1.4μl；6:1.6μl；7:1.8μl；8:2μl

圖5內(nèi)引物(fip/bip)濃度優(yōu)化；

m:dl500marker；1:1.5μl；2:2.0μl；3:2.5μl；4:3.0μl；5:3.5μl；6:4.0μl；7:4.5μl；8:5.0μl；9:5.5μl；10:6.0μl；

圖6擴(kuò)增溫度條件優(yōu)化；

m:dl500marker；1:70℃；2:69℃；3:68℃；4:67℃；5:66℃；6:65℃；7:64；8：63℃；9:62；10:61℃；11:60℃

圖7反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化；

m:dl500marker；1:120min；2:90min；3:60min；4:45min；5:30min；6:15min；

圖8lamp反應(yīng)染色結(jié)果；

a：添加goldview后，在自然光下，左邊為dpv陽(yáng)性，右邊為dpv陰性；

b：添加goldview后，在紫外燈下，左邊為dpv陽(yáng)性，右邊為dpv陰性。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的實(shí)施例：快速檢測(cè)鴨瘟病毒lamp試劑盒，在25μl體系dpv-tklamp擴(kuò)增體系中包括，濃度為5mol/l的甜菜堿5μl，濃度為8000u/mlbstdna的聚合酶0.8μl，濃度為0.1mol/l的硫酸鎂1.0μl，濃度為0.25mol/l的dntps1.4μl，濃度為10pmol/μl的外引物f3/b3各0.5μl，濃度為10pmol/μl的內(nèi)引物fip/bip各4.0μl，dna模板1μl，1μlbybrgreeni，其余由無(wú)核酸酶ddh2o補(bǔ)足至25μl，其中，外引物f3的序列為5’-tgcgaacgcttaatccgg-3’，外引物b3的序列為5’-tgctatgtcacctcgagct-3’；內(nèi)引物fip的序列為5’-ggttttgccagttccatacggc-tttt-ccttcgatgccattatgcct-3’，內(nèi)引物bip的序列為5’-ggttttgccagttccatacggc-tttt-ccttcgatgccattatgcct-3’；該體系在62℃擴(kuò)增60min。

sequencelisting

序列表

<110>貴州省畜牧獸醫(yī)研究所

<120>快速檢測(cè)鴨瘟病毒lamp試劑盒

<130>nm:

<160>4

<170>patentinversion

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>根據(jù)genbank中dpvtk基因序列，應(yīng)用在線primerexplorer4.0軟件設(shè)計(jì)，以用lamp擴(kuò)增。

<400>1

tgcgaacgcttaatccgg18

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>根據(jù)genbank中dpvtk基因序列，應(yīng)用在線primerexplorer4.0軟件設(shè)計(jì)，以用lamp擴(kuò)增。

<400>2

tgctatgtcacctcgagct19

<210>3

<211>46

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>根據(jù)genbank中dpvtk基因序列，應(yīng)用在線primerexplorer4.0軟件設(shè)計(jì)，以用lamp擴(kuò)增。

<400>3

ggttttgccagttccatacggcttttccttcgatgccattatgcct46

<210>4

<211>47

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>根據(jù)genbank中dpvtk基因序列，應(yīng)用在線primerexplorer4.0軟件設(shè)計(jì)，以用lamp擴(kuò)增。

<400>4

agccactctttatgttgccgagcttttctgtgtttcgtatacgccct47