本發(fā)明涉及一種檢測(cè)豬偽狂犬病毒的試劑盒及其用途，特別涉及一種基于rpa反應(yīng)的用于快速檢測(cè)豬偽狂犬病毒的實(shí)時(shí)熒光rpa試劑盒以及試紙條rpa試劑盒，還涉及二者在快速檢測(cè)豬偽狂犬病毒中的用途，本發(fā)明屬于預(yù)防獸醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

自pcr技術(shù)誕生以來已經(jīng)有三十年了。從經(jīng)典pcr、實(shí)時(shí)定量pcr再到現(xiàn)在的數(shù)字pcr，這一技術(shù)在不斷蛻變卻從未淡出我們的視野。但是該技術(shù)需要特殊昂貴的熱循環(huán)儀器以及熟練的操作人員，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，難以用在現(xiàn)場(chǎng)診斷以及實(shí)驗(yàn)條件差的地方。在發(fā)展中國(guó)家實(shí)驗(yàn)室中，由于pcr實(shí)施所需要的基礎(chǔ)設(shè)備和技術(shù)所限，大多數(shù)發(fā)展中國(guó)家仍然集中在使用傳統(tǒng)的試驗(yàn)方法，比如血清學(xué)方法、顯微鏡技術(shù)，或者培養(yǎng)以及鑒定傳染性以及非傳染性疾病。為了填補(bǔ)傳統(tǒng)方法和pcr之間的空缺，新的等溫分子診斷技術(shù)正在開發(fā)，該方法尤其適用于基礎(chǔ)設(shè)施、實(shí)驗(yàn)設(shè)備以及試驗(yàn)技術(shù)難于支持使用pcr進(jìn)行診斷的地方。

與常規(guī)方法相比較，等溫?cái)U(kuò)增實(shí)驗(yàn)具有很高的敏感性和特異性，這些原因促使不同的公司商業(yè)化不同的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，比如，環(huán)介導(dǎo)的擴(kuò)增(lamp；eiken,日本)，rpa(rpa；alere,usaandtwistdx,uk)，鏈置換擴(kuò)增(stranddisplacementamplification,bectondickson,usa)。在這些技術(shù)中，lamp是使用最為廣泛，且最成熟的試驗(yàn)方法。與rpa方法相比較，lamp技術(shù)具有試驗(yàn)設(shè)計(jì)比較麻煩(3對(duì)引物)，特異性相對(duì)較弱(能擴(kuò)增很多條帶)，時(shí)間仍然相對(duì)較長(zhǎng)，以及易于污染等不足的地方。

英國(guó)twistdxinc公司開發(fā)的重組酶聚合酶擴(kuò)增(recombinasepolymeraseamplification，rpa)被稱為是可以替代pcr的核酸檢測(cè)技術(shù)。以此為基礎(chǔ)的核酸擴(kuò)增產(chǎn)品能夠在15分鐘內(nèi)，37℃-42℃之間進(jìn)行核酸檢測(cè)?，F(xiàn)在使用最多的、最為成熟的為進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控的體系(如exo試劑盒，real-timerpa)以及基于試紙條的終點(diǎn)檢測(cè)(nfo試劑盒，recombinasepolymeraseamplificationassaycombinedwithlateralflowtest，lfsrpa)。

實(shí)時(shí)熒光rpa(real-timerpa)試驗(yàn)需要能激發(fā)并檢測(cè)熒光基團(tuán)的恒溫儀器，比如酶標(biāo)儀或?qū)崟r(shí)檢測(cè)的熱循環(huán)儀。自開發(fā)以來，該技術(shù)已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用到人類疾病、獸醫(yī)藥物、食品工業(yè)以及農(nóng)業(yè)中，比如用于土拉弗朗西斯菌、細(xì)螺旋體、hiv-1dna、鼠疫桿菌、炭疽桿菌、天花病毒、b型鏈球菌、大腸桿菌產(chǎn)生的志賀毒素、中東呼吸綜合征冠狀病毒、裂谷熱病毒、口蹄疫病毒、牛冠狀病毒、埃博拉病毒、蘇丹病毒、馬爾堡病毒、施馬倫貝格病毒、牛病毒性腹瀉病毒、黃熱病毒以及戈登病毒等病原的檢測(cè)。

對(duì)于試紙條rpa(lfsrpa)試驗(yàn)而言，只要溫度能控制在37-42℃之間就行，比如可以在水浴鍋等設(shè)置中進(jìn)行反應(yīng)，或者直接用人的體溫進(jìn)行加熱，隨后可以通過側(cè)流層析試紙條lfs(hybridetect2t，mileniabiotecgmbh,germany)讀取試驗(yàn)結(jié)果。自開發(fā)以來，該技術(shù)已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用到人類疾病、獸醫(yī)藥物、食品工業(yè)以及農(nóng)業(yè)中，比如用于感染性皮下及造血組織壞死病毒(ihhnv)、惡性瘧原蟲、洋李痘皰病毒、羌蟲、力克次體、隱孢子蟲以及黃熱病毒等的檢測(cè)。與常規(guī)方法相比較，該實(shí)驗(yàn)具有很高的敏感性和特異性。

豬偽狂犬病是由豬偽狂犬病毒(pseudorabiesvirus,prv)引起的危害家畜以及多種野生動(dòng)物的一種以發(fā)熱、奇癢和急性腦脊髓炎等為典型神經(jīng)癥狀的急性傳染病，豬是偽狂犬病的傳染源及自然儲(chǔ)存宿主。本病毒感染的仔豬死亡率可以高達(dá)100％，該病對(duì)于育肥豬的主要影響是減緩其生長(zhǎng)速度，種豬可能因此而喪失繁殖能力，懷孕母豬可能會(huì)有流產(chǎn)、產(chǎn)出死胎或者木乃伊胎等癥狀。prv不僅僅感染豬，而且還可以感染牛、狗、羊和嚙齒動(dòng)物。其他的主要?jiǎng)游锔腥緋rv主要引起快速死亡的臨床癥狀，并伴隨有神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，這和狂犬病的癥狀相似。已經(jīng)有報(bào)道在全世界的家養(yǎng)豬、野豬群以及野生動(dòng)物中檢測(cè)到該病的存在，這些宿主構(gòu)成了病毒宿主庫。因此，建立一種快速、簡(jiǎn)單、特異、敏感的檢測(cè)方法來檢測(cè)prv對(duì)于該病的防控起著關(guān)鍵的作用。

perez,l.j等(perez,l.j.,etal.,amultiplesybrgreeni-basedreal-timepcrsystemforthesimultaneousdetectionofporcinecircovirustype2,porcineparvovirus,pseudorabiesvirusandtorquetenosusvirus1and2inpigs.jvirolmethods,2012.179(1):p.233-41.)公開了一種基于sybrgreeni的，可用于同時(shí)檢測(cè)豬2型圓環(huán)病毒，豬細(xì)小病毒，偽狂犬病毒和豬torqueteno病毒1型和2型的real-timepcr方法。但該方法需要復(fù)雜的試驗(yàn)設(shè)備以及熟練的操作人員，該方法需要較長(zhǎng)的試驗(yàn)時(shí)間(大約1.5h)。同時(shí)由于sybrgreeni非特異性結(jié)合所有的雙鏈dna，因此，該方 法的特異性相對(duì)較差。

en,f.x等(en,f.x.,etal.,loop-mediatedisothermalamplificationestablishmentfordetectionofpseudorabiesvirus.jvirolmethods,2008.151(1):p.35-9.)公開了一種用于檢測(cè)豬偽狂病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法。通過lamp的擴(kuò)增結(jié)果表明，該方法能夠出現(xiàn)很多擴(kuò)增條帶，因此該方法存在非特異性擴(kuò)增，而且該方法需要設(shè)計(jì)三對(duì)引物來進(jìn)行擴(kuò)增，因此增加了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的難度，并且增加了其與其他檢測(cè)平臺(tái)相結(jié)合的難度。并且檢測(cè)溫度較高(63℃)，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)(60min)。并且需要核酸電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，增加了污染的可能性。

本發(fā)明針對(duì)豬偽狂犬病毒的gd基因，建立并評(píng)估了基于熒光探針的rpa(real-timerpa)檢測(cè)試劑盒以及基于試紙條的lfsrpa檢測(cè)試劑盒以實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)豬偽狂犬病毒的目的，據(jù)我們所知，國(guó)內(nèi)外尚無建立這樣的試劑盒用于檢測(cè)豬偽狂犬病毒。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種能快速、簡(jiǎn)單、特異的鑒定豬偽狂犬病毒的檢測(cè)方法及試劑盒。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段：

本發(fā)明發(fā)明人針對(duì)豬偽狂犬病毒的gd基因設(shè)計(jì)引物和探針。同時(shí)通過對(duì)來自于genbank中的ay217094.1,y14834.1,km189914.3,kt253413.1,kr051961.1,kp257591.1,kp315913.1,km061380.1,kp098534.1,kp259831.1,kc981239.1,kf017335.1和ay196984.1的gd基因同源序列進(jìn)行比對(duì)分析，進(jìn)一步確定了豬偽狂犬病毒gd基因的保守區(qū)域，針對(duì)該區(qū)域設(shè)計(jì)引物和探針，以期能夠檢測(cè)到盡可能多的豬偽狂犬病毒。所有的引物和探針都由生工生物(上海，中國(guó))合成。本發(fā)明分別設(shè)計(jì)合成了三對(duì)上游引物和三對(duì)下游引物，通過對(duì)引物與探針組合進(jìn)行擴(kuò)增效果評(píng)價(jià)，最終將其中一對(duì)能夠產(chǎn)生最強(qiáng)的擴(kuò)增信號(hào)的引物對(duì)與探針組合應(yīng)用到本發(fā)明中。針對(duì)實(shí)時(shí)熒光rpa(real-timerpa)與試紙條rpa(lfsrpa，recombinasepolymeraseamplificationassaycombinedwithlateralflowtest)的不同檢測(cè)特點(diǎn)，本發(fā)明分別設(shè)計(jì)了用于豬偽狂犬病毒檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光rpa以及試紙條rpa檢測(cè)的引物和探針序列，該兩種試劑盒針對(duì)同一靶標(biāo)序列，但引物和探針的修飾堿基和檢測(cè)平臺(tái)不同。

本發(fā)明一種用于快速檢測(cè)豬偽狂犬病毒的實(shí)時(shí)熒光rpa(real-timerpa)檢測(cè) 試劑盒，包括有一對(duì)引物和一條探針，

其中，所述的一對(duì)引物和一條探針的序列如下所示：

上游引物：5’-tactttatcgagtacgccgactgcgaccccaggca-3’(seqidno.1所示)

下游引物：5’-accatgaagtcggtgaggatgttcacgccgtcgac-3’(seqidno.2所示)

探針：5’-cgatgtggtggaccccgtccgcggactaca

(fam-dt)(thf)(bhq1-dt)tccccacggaggacg--p-3’(seqidno.3所示)

其中，fam-dt表示攜帶有熒光素基團(tuán)的胸腺嘧啶核苷酸，thf表示四氫呋喃連接子，bhq1-dt表示攜帶有熒光淬滅基團(tuán)bhq1的胸腺嘧啶核苷酸，p表示磷酸，用于阻止鏈的延伸。

在本發(fā)明所述的實(shí)時(shí)熒光rpa檢測(cè)試劑盒中，優(yōu)選的，所述試劑盒中還包括水解緩沖液，醋酸鎂以及ddh2o。

使用本發(fā)明所述的實(shí)時(shí)熒光rpa檢測(cè)試劑盒檢測(cè)豬偽狂犬病毒，優(yōu)選的，反應(yīng)體系如下：14.75μl的水解緩沖液，1.05μl的10μm上游引物，1.05μl的10μm下游引物，0.075μl的10μm探針，2μl的病毒dna模板，4.825μl的ddh2o以及1.25μl的280mm醋酸鎂；

擴(kuò)增反應(yīng)在溫度設(shè)定為37-39℃的實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀中進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間為20min-1h，結(jié)束后通過mx3005p軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

更優(yōu)選的，擴(kuò)增反應(yīng)在溫度設(shè)定為39℃的實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀中進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間為20min，結(jié)束后通過mx3005p軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

對(duì)本發(fā)明的實(shí)時(shí)熒光rpa(real-timerpa)試劑盒的檢測(cè)靈敏度及特異性進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，靈敏度試驗(yàn)結(jié)果表明使用該試劑盒檢測(cè)豬偽狂犬病毒的敏感性為10²拷貝/反應(yīng)，并且具有較廣的檢測(cè)范圍，至少在10⁶-10²拷貝/反應(yīng)范圍內(nèi)的樣品均能被檢測(cè)出來。特異性檢測(cè)結(jié)果表明，使用該試劑盒分別檢測(cè)豬偽狂犬病毒、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒、豬瘟病毒、豬2型圓環(huán)病毒、豬細(xì)小病毒以及口蹄疫病毒，結(jié)果只有豬偽狂犬病毒能夠很好的進(jìn)行擴(kuò)增，其他病毒均不能擴(kuò)增，因此，說明該試劑盒具有很好的特異性。我們用建立的real-timerpa方法來檢測(cè)采集自山東省的臨床樣品(n＝36)以及健康豬的血清樣品(n＝12)，并將檢測(cè)結(jié)果與qpcr的檢測(cè)結(jié)果相比較，結(jié)果表明real-timerpa的檢測(cè)結(jié)果與qpcr完全一致，即具有100％的符合 度。

因此，進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了以上所述的實(shí)時(shí)熒光rpa檢測(cè)試劑盒在制備檢測(cè)豬偽狂犬病毒試劑中的用途。

本發(fā)明還提出了一種用于快速檢測(cè)豬偽狂犬病毒的試紙條rpa(lfsrpa)檢測(cè)試劑盒，含有側(cè)流層析試紙條(hybridetect2t，mileniabiotecgmbh,germany)，以及有一對(duì)引物和一條探針，

其中，所述的一對(duì)引物和一條探針的序列如下所示：

上游引物：5’-tactttatcgagtacgccgactgcgaccccaggca-3’(seqidno.1所示)

下游引物：5’-biotin-accatgaagtcggtgaggatgttcacgccgtcgac-3’(seqidno.2所示)

探針：5’-fam-gatgtggtggaccccgtccgcggactacat

-thf-ttccccacggaggac-p-3’(seqidno.4所示)。

其中，biotin表示生物素，fam表示羧基熒光素，thf表示四氫呋喃連接子，p表示磷酸，用于阻止鏈的延伸。

在本發(fā)明所述的試紙條rpa檢測(cè)試劑盒中，優(yōu)選的，所述試劑盒中還包括水解緩沖液，醋酸鎂以及ddh2o。

使用本發(fā)明所述的試紙條rpa檢測(cè)試劑盒檢測(cè)豬偽狂犬病毒，優(yōu)選的，反應(yīng)體系如下：14.75μl的水解緩沖液，1.05μl的10μm上游引物，1.05μl的10μm下游引物，0.3μl的10μm探針，2μl的病毒dna模板，4.6μl的ddh2o以及1.25μl的280mm醋酸鎂；

擴(kuò)增反應(yīng)在溫度設(shè)定為39℃的水浴鍋中進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間為15min-30min，結(jié)束后使用側(cè)流層析試紙條(hybridetect2t，mileniabiotecgmbh,germany)對(duì)結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。

更優(yōu)選的，擴(kuò)增反應(yīng)在溫度設(shè)定為39℃的水浴鍋中進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間為20min，結(jié)束后使用側(cè)流層析試紙條對(duì)結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。

對(duì)本發(fā)明的試紙條rpa(lfsrpa)試劑盒的檢測(cè)靈敏度及特異性進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，靈敏度試驗(yàn)結(jié)果表明使用該試劑盒檢測(cè)豬偽狂犬病毒的敏感性為10²拷貝/反應(yīng)，并且具有較廣的檢測(cè)范圍，至少在10⁶-10²拷貝/反應(yīng)范圍內(nèi)的樣品均能被檢測(cè)出來。特異性檢測(cè)結(jié)果表明，使用該試劑盒分別檢測(cè)豬偽狂犬病毒、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒、豬瘟病毒、豬2型圓環(huán)病毒、豬細(xì)小病毒以及口蹄疫病毒，結(jié)果只有豬偽狂 犬病毒能夠很好的進(jìn)行擴(kuò)增，其他病毒均不能擴(kuò)增，因此，說明該試劑盒具有很好的特異性。我們用建立的lfsrpa方法來檢測(cè)采集自山東省的臨床樣品(n＝36)以及健康豬的血清樣品(n＝12)，并將檢測(cè)結(jié)果與qpcr的檢測(cè)結(jié)果相比較，結(jié)果表明real-timerpa的檢測(cè)結(jié)果與qpcr完全一致，即具有100％的符合度。

因此，進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了所述的試紙條rpa檢測(cè)試劑盒在制備檢測(cè)豬偽狂犬病毒試劑中的用途。

相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：

(1)能夠節(jié)約試驗(yàn)時(shí)間：rpa整個(gè)試驗(yàn)過程只需要25min，該時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于qpcr方法的1.5小時(shí)以及l(fā)amp的60min。加上樣品處理以及準(zhǔn)備試驗(yàn)的時(shí)間，rpa整個(gè)檢測(cè)過程能夠在一個(gè)小時(shí)之內(nèi)完成。

(2)能夠降低反應(yīng)溫度：rpa只需要恒溫39℃即可完成試驗(yàn)，該溫度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于qpcr方法的60℃-95℃以及l(fā)amp的65℃。

(3)方法更加簡(jiǎn)單、便于攜帶：擴(kuò)增所需的酶和一些其他必要的東西已經(jīng)凍干保存，能夠在常溫下長(zhǎng)時(shí)間放置，擴(kuò)增時(shí)只需要加入水解緩沖液、引物、探針和模板，并加入鎂離子起始反應(yīng)即可，lfsrpa方法只需要一個(gè)水浴鍋即可完成試驗(yàn)，不需要熟練的試驗(yàn)人員。

(4)特異性強(qiáng)：本發(fā)明試劑盒中添加了探針，增加了檢測(cè)的特異性，基于熒光試劑的lamp方法因?yàn)闆]有探針，特異性相對(duì)較差。

(5)更加不易于污染：本發(fā)明試劑盒中添加了核酸外切酶iii，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行切割，因此降低了產(chǎn)物污染的可能性，qpcr方法沒有添加切割產(chǎn)物的酶，lamp需要跑核酸電泳膠，因此，均有污染的可能性。

(6)檢測(cè)結(jié)果真實(shí)可靠：與現(xiàn)有的qpcr方法的符合度為100％。

附圖說明

圖1(a)為將合成的針對(duì)prv引物和探針的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒進(jìn)行十倍倍比稀釋，稀釋范圍為10⁶-10¹拷貝/反應(yīng)，隨后用real-timerpa方法進(jìn)行敏感性檢測(cè)，如圖所示為擴(kuò)增20min后實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀的結(jié)果。此圖可看出本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物和探針可以在39℃條件下，很好的檢測(cè)10⁶-10²拷貝/反應(yīng)的模板。其中nc代表陰性對(duì)照。

圖1(b)為利用prism5.0軟件(graphpadsoftware,usa)對(duì)real-timerpa方法的可重復(fù)性進(jìn)行驗(yàn)證。閾值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差(sd)。該試驗(yàn)進(jìn)行過6次重復(fù)性 試驗(yàn)。

圖1(c)為對(duì)real-timerpa方法的6次重復(fù)性結(jié)果進(jìn)行退行性分析。我們用三角符號(hào)標(biāo)出95％可能性的檢測(cè)限制。

圖2為比較豬偽狂犬病毒混合組織樣品(n＝18)和不同代次prv毒株的real-timerpa和qpcr檢測(cè)結(jié)果，用excel軟件來進(jìn)行退行性分析，其中y軸為rpa的時(shí)間閾值，x軸為qpcr循環(huán)數(shù)閾值。

圖3(a)為檢測(cè)lfsrpa方法的敏感性，我們將合成的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒進(jìn)行定量，并以十倍倍比稀釋的方式稀釋出濃度為10⁶-10⁰拷貝/反應(yīng)的質(zhì)粒dna作為模板進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)條件為上述的最佳試驗(yàn)條件(39℃，20min)，試驗(yàn)結(jié)果如圖所示，nc代表陰性對(duì)照；圖3(b)為檢測(cè)lfsrpa方法的特異性，我們分別用豬偽狂犬病毒、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒、豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒、豬細(xì)小病毒、口蹄疫病毒提取的dna/rna作為模板進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如圖所示，nc代表陰性對(duì)照。

圖4(a)為用lfsrpa方法檢測(cè)qpcr確認(rèn)的prv陽性樣品(n＝10)以及(b)陰性樣品(n＝6)的檢測(cè)結(jié)果，其中pc代表陽性對(duì)照，nc代表陰性對(duì)照。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

實(shí)施例1快速檢測(cè)豬偽狂犬病毒的實(shí)時(shí)熒光rpa(real-timerpa)檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法的建立

1、引物及探針序列的設(shè)計(jì)及制備

本發(fā)明發(fā)明人通過對(duì)來自于genbank中的ay217094.1,y14834.1,km189914.3,kt253413.1,kr051961.1,kp257591.1,kp315913.1,km061380.1,kp098534.1,kp259831.1,kc981239.1,kf017335.1和ay196984.1的gd基因同源序列進(jìn)行比對(duì)分析，確定了豬偽狂犬病毒gd基因的保守區(qū)域，針對(duì)該區(qū)域設(shè)計(jì)了引物和探針，以期能夠檢測(cè)到盡可能多的豬偽狂犬病毒。所有的引物和探針都由生工生物(上海，中國(guó))合成。本發(fā)明分別設(shè)計(jì)合成了三對(duì)上游引物、三對(duì)下游引物以及一條探針序列，如下表1所示。

表1、本發(fā)明設(shè)計(jì)的豬偽狂犬病毒real-timerpa引物和探針

2.毒株、細(xì)胞以及臨床樣品

本研究中使用的所有的毒株均由本實(shí)驗(yàn)室保存：prv(fa)毒株，pcv2nx毒株，prrsv(sd0907)毒株，csfv(c-strain)毒株，ppv(av30)毒株，(fmdv)/o/cha毒株。豬偽狂犬病毒混合組織樣品(n＝18)是由豬的組織混合均漿液混合prv陽性樣品，我們分別收集來自山東省的36份臨床樣品以及12份健康豬的血清進(jìn)行試驗(yàn)。pk-15細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存，用含有10％血清的mem在37℃，5％co2的條件下培養(yǎng)。

3.病毒基因組提取

使用高純度的病毒核酸提取方法(roche)按照說明書來來提取病毒dna/rna，并最終用50μl的無rnase水洗脫。提取的dna/rna存放到-80℃冰箱中以待隨后的使用。

4.產(chǎn)生質(zhì)粒dna標(biāo)準(zhǔn)品

金維智合成prv的gd基因片段(287bp)，并克隆到puc57載體，命名為pprv/rpa。用質(zhì)粒提取方法(promega,usa)來提取pprv/rpa質(zhì)粒。用nanovue(gelifescience)來定量純化的dna,并隨后進(jìn)行十倍倍比稀釋，并隨后儲(chǔ)存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

5、real-timerpa試驗(yàn)擴(kuò)增條件優(yōu)化

以提取純化的病毒dna/rna或者標(biāo)準(zhǔn)dna質(zhì)粒為模板進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)體系如下：14.75μl水解緩沖液(rehydrationbuffer，twistdxexokit,cambridge,unitedkingdom)，1.05μl上游引物(10μm)，1.05μl下游引物(10μm)，0.075μl的rpaexo探針(10μm)，2μl的dna/rna模板，4.825μl的ddh2o以及1.25μl的醋 酸鎂(magnesiumacetate，280mm)。

其中，所述的一對(duì)引物和一條探針的序列如下所示：

上游引物：5’-tactttatcgagtacgccgactgcgaccccaggca-3’(seqidno.1所示)

下游引物：5’-accatgaagtcggtgaggatgttcacgccgtcgac-3’(seqidno.2所示)

探針：5’-cgatgtggtggaccccgtccgcggactaca

(fam-dt)(thf)(bhq1-dt)tccccacggaggacg--p-3’(seqidno.3所示)

在進(jìn)行rpa引物的反應(yīng)溫度的確定時(shí)，按照上述體系加入反應(yīng)物。我們分別試驗(yàn)了37℃、38℃、39℃不同的反應(yīng)溫度，反應(yīng)時(shí)間為20min，結(jié)束后通過mx3005p軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。通過對(duì)結(jié)果分析表明，39℃擴(kuò)增結(jié)果最佳。所以本發(fā)明所設(shè)計(jì)的豬偽狂犬病毒real-timerpa擴(kuò)增溫度設(shè)定為39℃。在進(jìn)行real-timerpa引物的反應(yīng)時(shí)間的確定時(shí)，按照上述體系加入反應(yīng)物。并將溫度設(shè)定為39℃時(shí)，試驗(yàn)反應(yīng)不同時(shí)間擴(kuò)增差異。我們將時(shí)間分別設(shè)定為20min、30min和1h，結(jié)果表明，擴(kuò)增20min之后的陰性在一個(gè)小時(shí)之后仍然為陰性，20min之后的陽性在一個(gè)小時(shí)之后仍然為陽性，因此，我們選擇20min為本發(fā)明的擴(kuò)增設(shè)定時(shí)間。

同時(shí)本發(fā)明分別用該體系對(duì)合成的三對(duì)上游引物和三對(duì)下游引物與探針的組合進(jìn)行評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)結(jié)果表明其中一對(duì)引物(fe1/re3)與探針的組合能夠產(chǎn)生最強(qiáng)的擴(kuò)增信號(hào)，因此，該引物對(duì)與探針進(jìn)行組合應(yīng)用到本發(fā)明中。

real-timerpa試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果判定：一個(gè)樣品所有的重復(fù)試驗(yàn)，在特定的時(shí)間內(nèi)(20min)擴(kuò)增結(jié)果均大于背景值3.5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)方差(3.5sd)的為陽性，反之，該樣品為陰性。

6、real-timerpa試驗(yàn)靈敏度和特異性檢測(cè)

在進(jìn)行real-timerpa方法反應(yīng)靈敏度檢測(cè)時(shí)，按照上述體系加入反應(yīng)物。使用模板為上述合成的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，通過核酸測(cè)定儀測(cè)定濃度計(jì)算出拷貝數(shù)，分別稀釋出濃度梯度為10⁶-10¹個(gè)拷貝/反應(yīng)的共計(jì)6個(gè)梯度作為模板。擴(kuò)增反應(yīng)在溫度設(shè)定為39℃的qpcr儀中進(jìn)行，時(shí)間設(shè)定為20min，通過實(shí)時(shí)熒光實(shí)時(shí)監(jiān)控?cái)U(kuò)增結(jié)果。結(jié)果如圖1a所示，從該結(jié)果可以看出該方法的敏感性為10²拷貝/反應(yīng)，并且具有較廣的檢測(cè)范圍，至少在10⁶-10²拷貝/反應(yīng)范圍內(nèi)的樣品均能被檢測(cè)出來。

在real-timerpa敏感性試驗(yàn)中，我們對(duì)于同一個(gè)試驗(yàn)進(jìn)行了6次重復(fù)，結(jié)果表 明6次試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果一致，均能夠很好的檢測(cè)最低10²個(gè)拷貝/反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)dna，本發(fā)明利用prism5.0軟件(graphpadsoftware,usa)對(duì)試驗(yàn)的可重復(fù)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如圖1b所示，表明該發(fā)明具有很好的可重復(fù)性。閾值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差(sd)。同時(shí)，本發(fā)明利用excel軟件對(duì)real-timerpa試驗(yàn)的6次重復(fù)性結(jié)果進(jìn)行退行性分析，結(jié)果如圖1c所示，說明該方法能夠很好的檢測(cè)豬偽狂犬病毒。

隨后我們用豬偽狂犬病毒混合組織樣品(n＝18)進(jìn)一步驗(yàn)證該實(shí)驗(yàn)的敏感性，試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明：qpcr檢測(cè)結(jié)果與rpa檢測(cè)結(jié)果完全一致，所有樣品均為陽性，并且我們用excel統(tǒng)計(jì)了qpcr檢測(cè)結(jié)果(ct值)與rpa檢測(cè)結(jié)果(min)之間的相關(guān)性(見圖2)。

在進(jìn)行real-timerpa方法的反應(yīng)特異性的檢測(cè)時(shí)，按照上述體系加入反應(yīng)物。其中使用模板分別為豬偽狂犬病毒(prv)、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(hp-prrsv)、豬瘟病毒(csfv)、豬2型圓環(huán)病毒(pcv2)、豬細(xì)小病毒(ppv)以及口蹄疫病毒(fmdv)。擴(kuò)增反應(yīng)在溫度設(shè)定為39℃的qpcr儀中進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間設(shè)定為20min。結(jié)果表明，只有prv能夠很好的進(jìn)行擴(kuò)增，其他病毒均不能擴(kuò)增，因此，該方法具有很好的特異性，結(jié)果如表2所示。

qpcr方法參照文獻(xiàn)(perez,l.j.,etal.,amultiplesybrgreeni-basedreal-timepcrsystemforthesimultaneousdetectionofporcinecircovirustype2,porcineparvovirus,pseudorabiesvirusandtorquetenosusvirus1and2inpigs.jvirolmethods,2012.179(1):p.233-41.)方法進(jìn)行。

表2評(píng)估prvreal-timepra方法的特異性

neg:代表陰性

7、real-timerpa試驗(yàn)檢測(cè)臨床樣品

我們用建立的real-timerpa方法來檢測(cè)采集自山東省的臨床樣品(n＝36)以及健康豬的血清樣品(n＝12)，并將檢測(cè)結(jié)果與qpcr的檢測(cè)結(jié)果相比較。結(jié)果表明 12份健康豬的血清樣品real-timerpa檢測(cè)結(jié)果和qpcr檢測(cè)結(jié)果一致，均都為陰性。在36份臨床樣品中，real-timerpa檢測(cè)結(jié)果為11份陽性樣品(時(shí)間為：6.6min-8.6min)，這與qpcr檢測(cè)結(jié)果完全一致(ct值為20-29)。基于檢測(cè)的48份樣品，與qpcr檢測(cè)結(jié)果相比較，real-timerpa的敏感性和特異性均為100％。

qpcr方法參照文獻(xiàn)(perez,l.j.,etal.,amultiplesybrgreeni-basedreal-timepcrsystemforthesimultaneousdetectionofporcinecircovirustype2,porcineparvovirus,pseudorabiesvirusandtorquetenosusvirus1and2inpigs.jvirolmethods,2012.179(1):p.233-41.)方法進(jìn)行。

表3比較real-timepra方法和qpcr方法的臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

綜上可見，本發(fā)明設(shè)計(jì)合成的一對(duì)引物和一條探針基因序列以及其形成的實(shí)時(shí)熒光pra(real-timerpa)方法可以快速診斷豬偽狂犬病毒，而且該檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、快速、檢測(cè)結(jié)果真實(shí)可靠。

實(shí)施例2快速檢測(cè)豬偽狂犬病毒的試紙條rpa(lfsrpa)檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法的建立

1、引物及探針序列的設(shè)計(jì)及制備

本發(fā)明發(fā)明人通過對(duì)來自于genbank中的ay217094.1,y14834.1,km189914.3,kt253413.1,kr051961.1,kp257591.1,kp315913.1,km061380.1,kp098534.1,kp259831.1,kc981239.1,kf017335.1和ay196984.1的gd基因同源序列進(jìn)行比對(duì)分析，確定了豬偽狂犬病毒gd基因的保守區(qū)域，針對(duì)該區(qū)域設(shè)計(jì)了引物和探針，以期能夠檢測(cè)到盡可能多的豬偽狂犬病毒。所有的引物和探針都由生工生物(上海，中國(guó))合成。本發(fā)明分別設(shè)計(jì)合成了三對(duì)上游引物、三對(duì)下游引物以及一條探針序列，如下表1所示。

表1、本發(fā)明設(shè)計(jì)的豬偽狂犬病毒real-timerpa引物和探針

2.毒株、細(xì)胞以及臨床樣品

本研究中使用的所有的毒株均由本實(shí)驗(yàn)室保存：prv(fa)毒株，pcv2nx毒株，prrsv(sd0907)毒株，csfv(c-strain)毒株，ppv(av30)毒株，(fmdv)/o/cha毒株。豬偽狂犬病毒混合組織樣品(n＝18)是由豬的組織混合均漿液混合prv陽性樣品，我們分別收集來自山東省的36份臨床樣品以及12份健康豬的血清進(jìn)行試驗(yàn)。pk-15細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存，用含有10％血清的mem在37℃，5％co2的條件下培養(yǎng)。

3.病毒基因組提取

使用高純度的病毒核酸提取方法(roche)按照說明書來來提取病毒dna/rna，并最終用50μl的無rnase水洗脫。提取的dna/rna存放到-80℃冰箱中以待隨后的使用。

4.產(chǎn)生質(zhì)粒dna標(biāo)準(zhǔn)品

金維智合成prv的gd基因片段(287bp)，并克隆到puc57載體，命名為pprv/rpa。用質(zhì)粒提取方法(promega,usa)來提取pprv/rpa質(zhì)粒。用nanovue(gelifescience)來定量純化的dna,并隨后進(jìn)行十倍倍比稀釋，并隨后儲(chǔ)存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

5.lfsrpa方法擴(kuò)增條件優(yōu)化

我們以提取純化的病毒dna/rna或者標(biāo)準(zhǔn)dna質(zhì)粒為模板進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)體系如下：14.75μl水解緩沖液(rehydrationbuffer，twistdxexokit,cambridge,unitedkingdom)，1.05μl上游引物(10μm)，1.05μl下游引物(10μm)，0.3μl的rpanfo探針(10μm)，2μl的dna/rna模板，4.6μl的ddh2o以及1.25μl的醋酸鎂(magnesiumacetate，280mm)。

其中，所述的一對(duì)引物和一條探針的序列如下所示：

上游引物：5’-tactttatcgagtacgccgactgcgaccccaggca-3’(seqidno.1所示)

下游引物：5’-biotin-accatgaagtcggtgaggatgttcacgccgtcgac-3’(seqidno.2所示)

探針：5’-fam-gatgtggtggaccccgtccgcggactacat

-thf-ttccccacggaggac-p-3’(seqidno.4所示)。

反應(yīng)條件為39℃，反應(yīng)可在20min之內(nèi)完成。同時(shí)我們分別設(shè)計(jì)合成了三對(duì)上游引物和三對(duì)下游引物，并用該體系對(duì)引物與探針組合進(jìn)行評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)結(jié)果表明其中一對(duì)(fn1/rn3)能夠產(chǎn)生最強(qiáng)的擴(kuò)增信號(hào)，因此，該引物對(duì)與探針進(jìn)行組合應(yīng)用到本發(fā)明中。

隨后，我們測(cè)試了39℃條件下，不同孵育時(shí)間對(duì)于擴(kuò)增結(jié)果的影響，我們?cè)囼?yàn)了0min、1min、5min、10min、15min、20min、25min、30min的試驗(yàn)結(jié)果，在擴(kuò)增10min的時(shí)候，試驗(yàn)條帶上出現(xiàn)微弱的條帶，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間在15min-30min之間時(shí)試驗(yàn)條帶沒有出現(xiàn)可觀測(cè)的差異，因此，我們選擇20min作為該試驗(yàn)的孵育時(shí)間。

檢測(cè)結(jié)果判定：一個(gè)樣品在特定的條件下(37℃，20min)試紙條上控制線為陽性，并且試驗(yàn)線為陽性的樣品為陽性樣品；試紙條上控制線為陽性，而試驗(yàn)線為陰性的樣品為陰性樣品。

6、反應(yīng)靈敏度檢測(cè)

在進(jìn)行l(wèi)fsrpa方法的靈敏度檢測(cè)時(shí)，按照上述體系加入反應(yīng)物。使用模板為上述合成的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，通過核酸測(cè)定儀測(cè)定濃度計(jì)算出拷貝數(shù)，分別稀釋出濃度梯度為10⁶-10⁰拷貝/反應(yīng)的共計(jì)7個(gè)梯度作為模板。擴(kuò)增反應(yīng)在溫度設(shè)定為39℃的水浴鍋中進(jìn)行，時(shí)間設(shè)定為20min，通過試紙條終點(diǎn)檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。如圖3a所示，在6次重復(fù)性試驗(yàn)中，只有一次能夠檢測(cè)到10¹拷貝/反應(yīng)的質(zhì)粒dna，其余5次均不能檢測(cè)到10¹拷貝/反應(yīng)的質(zhì)粒dna，并且不能檢測(cè)10⁰拷貝/反應(yīng)的質(zhì)粒dna，因此該實(shí)驗(yàn)的敏感性被判定為10²拷貝/反應(yīng)。同時(shí)，該方法具有較廣的檢測(cè)范圍，至少在10⁶-10²拷貝/反應(yīng)范圍內(nèi)的樣品均能被檢測(cè)出來。

在進(jìn)行l(wèi)fsrpa方法的特異性的檢測(cè)時(shí)，按照上述體系加入反應(yīng)物。其中使用模板分別為豬偽狂犬病毒(prv)、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(hp-prrsv)、豬瘟病毒(csfv)、豬2型圓環(huán)病毒(pcv2)、豬細(xì)小病毒(ppv)以及口蹄疫病毒(fmdv)。反應(yīng)溫度設(shè)為39℃的水浴鍋中進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間設(shè)定為20min，結(jié)束后使用側(cè)流層析試紙條對(duì)結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，只有prv能夠很好的進(jìn)行擴(kuò)增，其他病毒均不能擴(kuò)增，因此，該方法具有很好的特異性，結(jié)果如圖3b及表5所示。

qpcr方法參照文獻(xiàn)(perez,l.j.,etal.,amultiplesybrgreeni-basedreal-time pcrsystemforthesimultaneousdetectionofporcinecircovirustype2,porcineparvovirus,pseudorabiesvirusandtorquetenosusvirus1and2inpigs.jvirolmethods,2012.179(1):p.233-41.)方法進(jìn)行。

表5評(píng)估lfsrpa方法的特異性

neg:代表陰性；pos:代表陽性。

7、lfsrpa方法檢測(cè)臨床樣品

首先，我們用lfsrpa方法測(cè)試qpcr確認(rèn)的10份陽性樣品和6份陰性樣品，lfsrpa試驗(yàn)結(jié)果表明：qpcr確認(rèn)的10份陽性樣品均為陽性，qpcr確認(rèn)的6份陰性樣品均為陰性，結(jié)果如圖4所示。

我們用建立的lfsrpa方法來檢測(cè)采集自山東省的臨床樣品(n＝36)以及健康豬的血清樣品(n＝12)，并將檢測(cè)結(jié)果與qpcr的檢測(cè)結(jié)果相比較。結(jié)果表明12份健康豬的血清樣品lfsrpa檢測(cè)結(jié)果和qpcr檢測(cè)結(jié)果一致，均都為陰性。在36份臨床樣品中，lfsrpa檢測(cè)結(jié)果為11份陽性樣品，這與qpcr檢測(cè)結(jié)果完全一致(ct值為18-30)。基于檢測(cè)的48份樣品，與qpcr檢測(cè)結(jié)果相比較，lfsrpa的敏感性和特異性均為100％，結(jié)果如表6所示。

qpcr方法參照文獻(xiàn)(perez,l.j.,etal.,amultiplesybrgreeni-basedreal-timepcrsystemforthesimultaneousdetectionofporcinecircovirustype2,porcineparvovirus,pseudorabiesvirusandtorquetenosusvirus1and2inpigs.jvirolmethods,2012.179(1):p.233-41.)方法進(jìn)行。

表6比較lfsrpa方法和qpcr方法的臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

綜上可見，本發(fā)明設(shè)計(jì)合成的一對(duì)引物和一條探針基因序列以及其形成的試紙條rpa(lfsrpa)方法可以快速診斷豬偽狂犬病毒，而且該檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、快速、檢測(cè)結(jié)果真實(shí)可靠。