本發(fā)明涉及一種snp標記，尤其涉及一種與大口黑鱸生長性狀相關(guān)從而進一步與易于馴食人工配合飼料相關(guān)的snp標記及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

大口黑鱸(micropterussalmoides)，俗稱加州鱸，是一種原產(chǎn)于北美的廣溫性肉食性魚類，1983年引進到中國大陸，由于其具有生長快、肉質(zhì)鮮美和易捕撈等特點，目前已成為我國主要淡水養(yǎng)殖品種之一。

但是，大口黑鱸作為肉食性魚類，在養(yǎng)殖過程中需要利用冰鮮魚或活魚作為飼料的主要蛋白源，而這些冰鮮魚或活魚只能依靠海洋捕撈加工，這使得近幾年魚粉價格快速上升，并且供不應(yīng)求。

目前，在大口黑鱸養(yǎng)殖領(lǐng)域，研究人員一直致力于開發(fā)與大口黑鱸成份相似的人工配合飼料。但是，由于大口黑鱸為肉食性魚類，以食冰鮮魚和活魚為主，并不能很好的適應(yīng)目前所開發(fā)的人工配合飼料，所以，投喂人工配合飼料的大口黑鱸會出現(xiàn)生長緩慢的現(xiàn)象，這一現(xiàn)象嚴重制約大口黑鱸養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。

對大口黑鱸的人工配合飼料投喂進行研究發(fā)現(xiàn)，在投喂飼料的養(yǎng)殖過程中，從魚苗開始，大口黑鱸存在著食性轉(zhuǎn)化的過程，通常過程如下：魚苗開口第1個星期，每天喂4次熟蛋黃，逐日有所增加；1星期后加喂劍水蚤；10天后又加入少量水蚯蚓，減少劍水蚤；20天后當魚苗平均全長2.5厘米時，在水蚯蚓團中混入少量鮮魚漿，以后逐日增加鮮魚漿比例，直至全部便用魚漿為止；大約需10天左右，開始投喂顆粒大小適口的人工配合飼料。在這過程中，由于大口黑鱸有同類相食的特點，在投喂人工配合飼料初期，快速的生長對于大口黑鱸的存活及養(yǎng)殖產(chǎn)量具有至關(guān)重要的意義。

為了解決上述問題，可以對大口黑鱸進行食性改良，通過選擇育種，培育出對人工配合飼料具有良好消化能力和食欲的快長魚類新品系。

在開展常規(guī)選育研究的同時，開發(fā)和應(yīng)用分子標記輔助育種技術(shù)可使親魚的遺傳選擇更加準確有效，加快大口黑鱸良種的進一步選育。

snp是單核苷酸多態(tài)的簡稱，是指在生物體的基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的dna序列多態(tài)性。單個核苷酸的變化可能會引起基因所編碼蛋白氨基酸的變化或基因表達調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)構(gòu)域和結(jié)合能力的變化，進而影響蛋白結(jié)構(gòu)、功能和蛋白合成量的變化，最終引起生物體表型的變化。這些snp位點的基因型有可能與生物體的表型相關(guān)聯(lián)。另外，snp是可以從親代遺傳給子代的分子標記，可以通過選擇含有目的性狀相關(guān)的snp標記的親本，進行繁殖，以期獲得含有這一性狀的子代，以加快選育的進程。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

在本發(fā)明的第一方面，提供一種與大口黑鱸生長性狀相關(guān)的snp標記，所述snp標記為seqidno.1序列2533bp處的堿基多態(tài)位點。

應(yīng)該理解，所述snp標記也可以為seqidno.4序列上89bp處的堿基多態(tài)位點。

進一步地，上述堿基多態(tài)位點為t(胸腺嘧啶)。

進一步地，所述snp標記在seqidno.1序列的2533bp處或seqidno.4序列的89bp處為t堿基的是優(yōu)勢等位基因，當大口黑鱸個體只含有該snp位點為t的純合基因型(即t/t基因型)時為目標選擇個體。

更進一步地，所述snp標記可以包括上述基因序列，例如包括上述2533bp處為t的seqidno.1序列；或者例如還可以包括通過seqidno.2序列和seqidno.3序列的所擴增得到的序列(seqidno.4序列)，這樣的序列可以為seqidno.4本身，也可以為包括seqidno.4序列的seqidno.1序列。

更進一步地，所述snp標記還可以包括2533bp處為t的seqidno.1序列，還可以為2533bp處為t的seqidno.1序列本身。

申請人研究發(fā)現(xiàn)，在大口黑鱸acsll基因序列seqidno.1的2533bp處有一個t(胸腺嘧啶)-c(胞嘧啶)型snp，該snp位于基因編碼區(qū)的3’端，命名為acsll-t2533csnp位點。

申請人進一步研究發(fā)現(xiàn)，對大口黑鱸仔魚進行馴食人工配合飼料的實驗表明，acsll基因中2533bp處的snp位點與馴食后階段幼魚的生長性狀有明顯的相關(guān)性，該位點對應(yīng)基因型為t/t基因型的個體在體質(zhì)量、全長及體高性狀上顯著高于t/c基因型或c/c基因型的個體。

在本發(fā)明的第二方面，提供一種上述snp標記在篩選和/或檢測快速生長大口黑鱸中的應(yīng)用，特別是馴食人工配合飼料后的快速生長。

?；o酶a合成酶長鏈家族成員是將長鏈游離脂肪酸轉(zhuǎn)化成乙酰coa的一個酶類家族成員，受過氧化體增殖物激活型受體α的調(diào)節(jié)，與脂蛋白脂肪酶等脂代謝關(guān)鍵酶共同作用，實現(xiàn)對體內(nèi)三酰甘油代謝的調(diào)節(jié)。?；o酶a合成酶長鏈家族成員1(acyl-coasynthetaselong-chainfamilymember1，acsll)是這個家族的成員之一，在動物體內(nèi)促進肝臟攝取經(jīng)脂蛋白脂肪酶解生成的長鍵游離脂肪酸，并催化合成脂酰coa，是哺乳動物利用脂肪酸的第一步反應(yīng)，在脂肪代謝中起著重要作用。

申請人得到了上述大口黑鱸?；o酶a合成酶長鏈家族成員1(acsll)基因序列即seqidno.1的序列，研究證明了該序列的2533bp處的snp位點與大口黑鱸的生長性狀的相關(guān)性，研究證實，序列acsll基因序列(seqidno.1序列)的5’端的2533bp(即3’端的741bp)對應(yīng)基因型為t/t基因型的大口黑鱸個體在體質(zhì)量、全長及體高性狀上顯著高于t/c基因型或c/c基因型個體。

通過檢測大口黑鱸的上述snp標記對應(yīng)的基因型，可有效篩選和/或檢測得到快速生長的大口黑鱸，檢測得到上述seqidno.1的序列的2533bp處對應(yīng)基因型為t/t基因型的大口黑鱸為快速生長的大口黑鱸或大口黑鱸親本。

進一步地，通過檢測上述snp標記的大口黑鱸，還可選擇在大口黑鱸馴食階段能快速適應(yīng)人工配合飼料的大口黑鱸或親本。

另外，snp是可以從親代遺傳給子代的分子標記，可以通過選擇含有目的性狀相關(guān)的snp標記的親本，進行繁殖，以期獲得含有這一性狀的子代，加快選育的進程。

本發(fā)明中優(yōu)選的t/t基因型為純合體，在后代個體遺傳中不會發(fā)生分離。大口黑鱸為種內(nèi)相食的魚類，在馴食階段能快速生長的大口黑鱸可提高其存活率，并為其在接下來繼續(xù)用人工配合飼料喂食的養(yǎng)殖條件下能快速地生長奠定良好的基礎(chǔ)。因此，馴食階段能快速生長的大口黑鱸可視為易于馴食人工配合飼料的優(yōu)良個體。因此，通過篩選/檢測本發(fā)明的snp標記，能夠用于適合馴食人工配合飼料的大口黑鱸的育種之中，可根據(jù)候選親本在該snp標記位點上的基因型對大口黑鱸親本進行選擇，挑選含有t/t基因型大口黑鱸親本進行繁殖，可以獲得適合食人工配合飼料大口黑鱸后代魚苗，加快培育適合食人工配合飼料大口黑鱸，促進大口黑鱸食性轉(zhuǎn)化進程，節(jié)約育種時間，保護環(huán)境，降低養(yǎng)殖成本。

由此，本發(fā)明還提供一種上述snp標記用于鑒定和/或篩選易于馴食人工配合飼料的大口黑鱸親本的應(yīng)用，為篩選和建立大口黑鱸易馴食人工配合飼料新品系提供可靠的遺傳數(shù)據(jù)。

在本發(fā)明的第三方面，提供一種檢測上述snp標記的引物對。

可以理解的是，在本發(fā)明提供的上述snp標記的基礎(chǔ)上，例如在上述seqidno.1的基礎(chǔ)上，依據(jù)分子技術(shù)手段，可以篩選得到多對能夠檢測上述snp標記的引物對，例如，所述引物對包括seqidno.2序列和seqidno.3序列。經(jīng)研究證明，本發(fā)明提供的該對引物對，特異性好，擴增效率高。

本發(fā)明的引物對，可以用于擴增snp標記或含有該標記的序列，或用于檢測是否具有上述snp標記的大口黑鱸，從而進一步地篩選和/或檢測快速生長大口黑鱸，或進一步地用于鑒定和/或篩選易于馴食人工配合飼料的大口黑鱸親本。

在本發(fā)明的第四方面，提供一種篩選和/或檢測快速生長大口黑鱸的方法，通過檢測上述的snp標記，選擇具有上述snp標記的大口黑鱸作為快速生長大口黑鱸，進一步地，選擇具有seqidno.1序列的2533bp處堿基多態(tài)位點對應(yīng)基因型為t/t基因型或seqidno.4序列的89bp處堿基多態(tài)位點對應(yīng)基因型為t/t基因型的大口黑鱸作為快速生長大口黑鱸或親本。本發(fā)明還提供一種用于鑒定和/或篩選易于馴食人工配合飼料的大口黑鱸親本的方法，通過檢測上述的snp標記，選擇具有上述snp標記的大口黑鱸作為馴食人工配合飼料的大口黑鱸親本，進一步地，選擇具有seqidno.1序列的2533bp處堿基多態(tài)位點對應(yīng)基因型為t/t基因型或seqidno.4序列的89bp處堿基多態(tài)位點對應(yīng)基因型為t/t基因型的大口黑鱸作為馴食人工配合飼料的大口黑鱸或親本。

在分子技術(shù)領(lǐng)域，具有多種檢測上述snp標記的方法，例如pcr后直接測序的方法等。

進一步地，可以采用seqidno.2序列和seqidno.3序列的引物對進行snp標記檢測，檢測snp標記的基因型。

進一步地，上述檢測snp標記的方法包括：提取大口黑鱸dna、采用seqidno.2序列和seqidno.3序列的引物對進行pcr擴增，選擇具有seqidno.1序列的2533bp處堿基多態(tài)位點對應(yīng)基因型為t/t基因型或seqidno.4序列的89bp處堿基多態(tài)位點對應(yīng)基因型為t/t基因型的大口黑鱸作為快速生長大口黑鱸或親本，或作為馴食人工配合飼料的大口黑鱸或親本。

在一個優(yōu)選的實施例中，提供一種檢測該snp標記的方法，包括：

(1)提取檢測樣本dna，例如剪取檢測樣品的魚鰭進行樣本dna提??；

(2)利用下面兩對引物對，對提取的dna進行pcr擴增，獲取具有snp位點的目標片段；

引物1：5’-ctgccatcactggcttattag-3’(seqidno.2)

引物2：5’-ctttctgaccatgacatagtca-3’(seqidno.3)

(3)可選地對上述pcr產(chǎn)物進行純化后，進行目標片段的測序比對，分析檢測樣本的snp標記位點的基因型，確定檢測樣本是否具有本發(fā)明所述的優(yōu)選的snp標記；

具體地，例如檢測出大口黑鱸個體的snp位點堿基多態(tài)位點只有t時，即標記位點對應(yīng)基因型為t/t基因型，則判定該檢測樣本為生長快速的大口黑鱸，適合馴食人工配合飼料，可選做親本。

在另一個優(yōu)選的實施例中，上述方法中的pcr擴增反應(yīng)體系為可以為25μl的反應(yīng)體系，例如：

在另一個優(yōu)選的實施例中，上述方法中的pcr擴增反應(yīng)條件可以為：94℃預變性2min；94℃變性30秒，55℃退火20秒，72℃延伸30秒，32個循環(huán)；72℃延伸7min。

在本發(fā)明的第五方面，提供一種篩選和/或檢測快速生長大口黑鱸或親本的試劑盒，所述試劑盒包括檢測具有上述的snp標記的試劑，這樣的試劑可以包括例如包括引物對在內(nèi)的pcr擴增試劑、樣本dna提取試劑等，這樣的試劑還可以考慮為實現(xiàn)上述篩選和/或檢測快速生長大口黑鱸或親本的方法的任何試劑及其組合，可以考慮為鑒定和/或篩選易于馴食人工配合飼料的大口黑鱸或親本的方法的任何試劑及其組合。

本發(fā)明創(chuàng)造性地提供了一種與大口黑鱸的生長性狀相關(guān)的snp標記，不同的基因型與大口黑鱸的生長性狀的相關(guān)性已經(jīng)得到證實，在此基礎(chǔ)上，利用該snp標記，可以進行大口黑鱸的篩選或檢測，或大口黑鱸的人工養(yǎng)殖過程中易于馴食人工配合飼料的大口黑鱸或其親本的篩選或檢測，在大口黑鱸的養(yǎng)殖或選育領(lǐng)域，都具有積極的效果，及在此基礎(chǔ)上，開發(fā)了一系列的引物對、方法及相應(yīng)試劑盒，具有很大的科學價值和商業(yè)價值。

具體實施方式

以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步說明。

實施例1本發(fā)明snp標記的作用研究

對大口黑鱸催產(chǎn)和人工繁育，將大口黑鱸仔魚從3-5cm左右的魚苗開始馴食人工飼料，全程投喂市售大口黑鱸配合飼料。在2周的馴食人工配合飼料后，隨機取97尾大口黑鱸魚苗測定其體質(zhì)量、全長、體高等生長指標，并取魚鰭提取基因組dna，檢測seqidno.1的2533bp處的snp位點的等位基因和基因型頻率見表1，snp位點的幾種基因型及相應(yīng)的體重、體長、體高指標見表2。

表197尾大口黑鱸仔魚acsll-t741csnp位點在的等位基因和基因型頻率

表2acsll-t741csnp位點與大口黑鱸仔魚生長性狀的相關(guān)關(guān)系

注：表中上標為平均值的差異顯著性(最小顯著差數(shù)法，lsd)，同一列數(shù)值中，上標含相同字母表示兩種基因型之間差異不顯著(p>0.05)，不同小寫字母代表差異顯著(p≤0.05)。

從以上結(jié)果可以看出，acsll-t2533csnp位點與大口黑鱸生長形狀關(guān)系密切，該位點對應(yīng)基因型是t/t基因型時為優(yōu)勢基因型，是t/c基因型和c/c基因型時為劣勢基因型。

因此，acsll-t2533c(seqidno.1的2533bp)snp位點僅檢測出t時，也就是其對應(yīng)的基因型為t/t基因型為生長性狀更快速的大口黑鱸，而acsll-t2533csnp(seqidno.1的2533bp)snp位點不止為t，還包括c，或者只有c時，也就是說其對應(yīng)基因型為t/c、c/c基因型時，為生長性狀更緩慢的大口黑鱸。

此外，對于投喂冰鮮雜魚的大口黑鱸的上述snp位點基因型和生長性狀進行同樣的試驗，得到了相似的結(jié)果。

實施例2本發(fā)明snp標記的篩選研究

本實施例對大口黑鱸的snp標記進行篩選/檢測：

(一)樣品dna的提取

(1)取待檢測樣本大口黑鱸的鰭條組織3mg，剪碎后，加入0.5ml的裂解液(10mmol/ltris-hcl；0.1mol/ledta；0.5％sds；30mg/lrnase；100mg/l蛋白酶k，ph8.0)，55℃消化1小時；

(2)加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(體積比25：24：1)混合物，混勻，室溫下靜置5分鐘后，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取上清液，再用氯仿抽提一次，室溫下靜置5分鐘后，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取上清液；

(3)加入2倍體積的無水乙醇，室溫靜置10分鐘沉淀dna，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，得到沉淀；

(4)將沉淀用70％乙醇洗滌1次，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘，吸去上清，室溫靜置干燥10分鐘，加入50μlte(10mmol/ltris－h(huán)cl；1mmol/ledta，ph8.0)溶解，得到dna液，可4℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

(二)引物的設(shè)計與合成

根據(jù)大口黑鱸acsll基因序列(seqidno.1)設(shè)計并合成一對引物，用于擴增seqidno.1的2533bp或seqidno.4的89bp位置的snp位點，引物序列如下：

引物1：5’-ctgccatcactggcttattag-3’(seqidno.2)

引物2：5’-ctttctgaccatgacatagtca-3’(seqidno.3)

(三)pcr反應(yīng)：

反應(yīng)體系(25μl體系)

pcr反應(yīng)條件為：94℃預變性2min；94℃變性30秒，55℃退火20秒，72℃延伸30秒，32個循環(huán)；72℃延伸7min。

(四)大口黑鱸的基因型分析(篩選/檢測)

測序步驟(三)得到的pcr擴增產(chǎn)物(即seqidno.4序列)，查看測序峰圖，分析每尾大口黑鱸的基因型，根據(jù)seqidno.1序列或seqidno.4與測得序列的比較結(jié)果，在seqidno.1序列的2533pb為t單峰的個體是t/t基因型個體，tc雙峰的個體是t/c基因型個體，c單峰的個體是c/c基因型個體。

以上所述，僅為本發(fā)明的較佳的具體實施例，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。

<110>中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所公司

<120>一種與大口黑鱸生長性狀相關(guān)的snp標記及其應(yīng)用

<160>4

<210>1

<211>3273

<212>dna

<213>大口黑鱸(micropterussalmoides)

<220>

<223>snp標記序列

<400>1

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<210>4

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<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>snp標記序列

<400>4

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