本申請涉及基因檢測領(lǐng)域,特別涉及一種檢測肺結(jié)節(jié)為良性或惡性的試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù):
:肺癌是世界上發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤,每年死亡人數(shù)約140萬,占所有惡性腫瘤死亡人數(shù)的18%。英國著名腫瘤學(xué)家peto教授預(yù)言:如果中國不及時控制吸煙和治理空氣污染,到2025年每年新發(fā)肺癌患者將超過100萬。以現(xiàn)有的檢測手段,約75%的肺癌患者在診斷時已屬晚期,5年生存率約為15.6%。大眾缺乏篩查意識,同時缺乏科學(xué)鑒別肺結(jié)節(jié)的方法,使肺癌發(fā)病率居高不下。肺癌是以肺結(jié)節(jié)形式表現(xiàn)出來,因此,肺癌早篩關(guān)鍵在于肺結(jié)節(jié)精確診斷。肺結(jié)節(jié)為小的局灶類、類圓形、影像學(xué)表現(xiàn)密度增高的陰影,可為單發(fā)或多發(fā)。彌漫性或多發(fā)性結(jié)節(jié),一般有胸外惡性腫瘤轉(zhuǎn)移或活動性感染導(dǎo)致,原發(fā)性肺癌可能性相對較小。孤立性肺結(jié)節(jié)無典型癥狀,常為單個、邊界清楚、密度增高、直徑≤3cm且周圍被含有氣肺組織包繞的軟組織影。隨著肺癌中ct檢查的普及和廣泛應(yīng)用以及近年來開展的低劑量ct篩查肺癌,使肺結(jié)節(jié)的檢出率逐漸升高,它們可能代表惡性腫瘤,如原位腺癌及浸潤性腺癌;或?yàn)榘┣安∽?如aah;或?yàn)榱夹圆∽?包括局灶性間質(zhì)纖維化或機(jī)化性肺炎、炎癥及出血等。良、惡性病變的ct表現(xiàn)非常相似。有回顧性研究表明,通過ct影像進(jìn)行8個大的肺癌篩查項(xiàng)目顯示,肺結(jié)節(jié)的患病率是8%-51%,惡性腫瘤發(fā)病率為1.1%-12%。然而,ct僅僅是影像學(xué)結(jié)果,僅能確定結(jié)節(jié)的大小、形狀等基本信息,需要經(jīng)過醫(yī)生肉眼觀察,下定結(jié)論,依賴于醫(yī)生的專業(yè)的知識和經(jīng)驗(yàn),并不能作為確診的結(jié)果為了對肺結(jié)節(jié)進(jìn)行確診,目前臨床上的做法是:在無法對影像學(xué)進(jìn)行判斷的情況下,進(jìn)行手術(shù)取組織或穿刺活檢對結(jié)節(jié)組織進(jìn)行病理診斷。組織活檢能夠從細(xì)胞層面診斷結(jié)節(jié)是否癌變,是目前肺結(jié)節(jié)診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。但是,由于肺結(jié)節(jié)的組織活檢診斷在臨床中并不提倡,有兩方面原因:①肺結(jié)節(jié)大小一般小于3cm,需要憑借醫(yī)生豐富的經(jīng)驗(yàn)才能準(zhǔn)確的穿刺取到結(jié)節(jié)組織;②手術(shù)是一種侵入性的手段,有一定的并發(fā)癥風(fēng)險。臨床上還有另一種輔助檢測手段,即腫瘤標(biāo)志物。腫瘤標(biāo)志物一般是與癌癥相關(guān)蛋白標(biāo)志物。由于這種蛋白標(biāo)志物會受到受檢者自身的影響,會影響結(jié)果的解讀。因此,腫瘤標(biāo)志物對癌癥的診斷只能起輔助作用,并且靈敏度較低。臨床上需要一種能夠無創(chuàng),高靈敏度診斷肺結(jié)節(jié)的檢測手段。液體活檢(liquidbiopsy)是mittechnologyreview雜志發(fā)布的2015年度十大突破技術(shù)之一,是當(dāng)前轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究的熱門新興領(lǐng)域,有望用于疾病的療效評估和預(yù)后判斷。早期研究表明循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulatingtumorcell,ctc)捕獲分析技術(shù)作為腫瘤基因分型的潛在生物標(biāo)志物,但是這項(xiàng)技術(shù)在臨床發(fā)展相當(dāng)緩慢。超靈敏度的基因檢測試驗(yàn)?zāi)軌蛟谀[瘤患者的血漿游離dna(cellfreedna,cfdna)中檢測到突變的dna,即循環(huán)腫瘤dna(circulatingtumordna,ctdna)。ctdna是一種無細(xì)胞狀態(tài)的胞外dna,腫瘤細(xì)胞脫落或者凋亡后釋放進(jìn)入血液循環(huán)。在癌癥患者血漿cfdna中,ctdna僅占1%,甚至0.01%。隨著疾病進(jìn)展,在血液中的ctdna也隨之變化。在疾病進(jìn)展過程中實(shí)時動態(tài)監(jiān)測血液中的ctdna,獲得與腫瘤相關(guān)的變異信息,進(jìn)行癌癥早期篩查,指導(dǎo)臨床用藥,這對于癌癥的診療至關(guān)重要。ctdna作為來源于腫瘤細(xì)胞的遺傳信息,含有腫瘤的突變信息,隨著組織癌變進(jìn)程,基因的突變頻率發(fā)生變化,通過測序技術(shù)分析出癌癥相關(guān)基因突變信息,實(shí)現(xiàn)癌癥的檢測和監(jiān)控。約翰霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院的evgenyizumchenko等研究發(fā)現(xiàn),肺結(jié)節(jié)從腺瘤樣增生(aah),發(fā)展到原位癌(ais),再到浸潤性腺癌(mia),隨著細(xì)胞癌變的不斷發(fā)生基因的突變率不斷升高,一些基因如tp53和egfr突變率顯著上升。組織病變和組織癌變基因突變情況的差異化,可以在診斷時區(qū)別病人組織是否癌變,確保不出現(xiàn)誤診的情況,達(dá)到精確診斷的目的。而作為來源于腫瘤組織的外周血ctdna,亦可通過檢測肺結(jié)節(jié)患者外周血的不同基因突變情況,區(qū)分出肺結(jié)節(jié)是否癌變。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種以外周血為樣本,通過高通量測序以檢測肺結(jié)節(jié)為良性或惡性的試劑盒及其應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:一種檢測肺結(jié)節(jié)為良性或惡性的試劑盒,其特征在于:包括以下組分:(a)一種檢測試劑,該檢測試劑是鏈霉親和素處理的磁珠;(b)第一種檢測組分,該檢測組分是自主設(shè)計的adapter;(c)第二種檢測組分,該檢測組分是針對肺結(jié)節(jié)相關(guān)的358個基因設(shè)計的引物;(d)第三種檢測組分,該檢測組分是針對肺結(jié)節(jié)相關(guān)的358個基因設(shè)計的75642條捕獲探針。上述技術(shù)方案的(a)中,采用鏈霉親和素處理的磁珠對樣品以及pcr產(chǎn)物進(jìn)行純化。上述技術(shù)方案的(b)中,所述的adapter中部分的核苷酸序列為:5’-p-actgnnnnnnnnnnnnagatcggaagagcacacgtctgaactccagtcacxxxxxxtagagcatacggcagaagacgaacuaatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatct-3’。該序列中,由5’端開始,p為磷酸化標(biāo)記,“actg”為tag序列,“nnnnnnnnnnnn”為polyn序列,n表示隨機(jī)堿基,“agatcggaagagcacacgtctgaactccagtcac”為發(fā)夾序列,“xxxxxxxx”為第一索引序列,同樣的x表示隨機(jī)序列,即第一索引序列為隨機(jī)生成的8bp的序列,這是測序時區(qū)分不同樣本的標(biāo)記,“tagagcatacggcagaagacgaac”為第一通用引物結(jié)合序列,“u”為dutp,“aatgatacggcgaccaccgag”為第二通用引物結(jié)合序列,“atctacactctttccctacacgacgctcttccgatct”為發(fā)夾序列,前后兩個發(fā)夾序列在退火時形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。上述技術(shù)方案的(c)中,所述針對肺結(jié)節(jié)相關(guān)的358個基因設(shè)計的引物包括針對egfr基因l858r位點(diǎn)設(shè)計的正向引物和反向引物,具體如下:egfr基因l858r位點(diǎn)的正向引物:cataccgcagcatgtcaactag;egfr基因l858r位點(diǎn)的反向引物:gagccctggtccctggtggact。上述技術(shù)方案的(d)中,所述針對肺結(jié)節(jié)相關(guān)的358個基因設(shè)計的75642條捕獲探針包括egfr基因18號外顯子上游探針和下游探針,具體如下:egfr基因18號外顯子上游探針:5’-cgcagcatgtcaagatcacagattttgggc-3’;egfr基因18號外顯子下游探針:5’-ggccaaactgctgggtgcggaagagaaaga-3’。使用上述試劑盒進(jìn)行肺結(jié)節(jié)診斷的方法,包括以下步驟:(1)獲得患者提供的外周血樣本,并進(jìn)行血清和血細(xì)胞的分離;(2)提取分離獲得血清的dna,并對樣本dna進(jìn)行建庫、雜交、捕獲;捕獲采用本申請所述的試劑盒;(3)將步驟(2)捕獲的文庫進(jìn)行測序,數(shù)據(jù)分析,確定發(fā)生突變的基因和突變頻率。本申請針對肺結(jié)節(jié)相關(guān)的358個基因自主設(shè)計了75642條捕獲探針,用于血漿中的cfdna的區(qū)域捕獲,從而獲得區(qū)域信息。優(yōu)選的,捕獲探針的3’端具有生物素標(biāo)記。需要說明的是,這種生物素標(biāo)記能夠與鏈霉親和素結(jié)合,從而篩選出ctdna中目的片段,去除其他不必要的cfdna片段,捕獲目的基因。本申請所述的試劑盒只需要外周血樣本進(jìn)行檢測,不需要進(jìn)行手術(shù)或穿刺獲得肺結(jié)節(jié)組織,減少了手術(shù)風(fēng)險,實(shí)現(xiàn)了無創(chuàng)檢測。同時,本申請設(shè)計了針對肺結(jié)節(jié)相關(guān)的358個基因的75642條捕獲探針對血漿中的cfdna進(jìn)行區(qū)域捕獲,經(jīng)第二代測序技術(shù),將產(chǎn)生的數(shù)據(jù)進(jìn)行大數(shù)據(jù)分析,從而獲得肺結(jié)節(jié)相關(guān)基因的突變情況。本申請中,涉及的肺結(jié)節(jié)相關(guān)的358個基因包括:與肺癌細(xì)胞生長增殖相關(guān)的驅(qū)動基因,抑制細(xì)胞生長增殖的抑癌基因,信號通路中的相關(guān)基因,肺部其他腫瘤(如肺泡細(xì)胞癌,類癌等)相關(guān)基因,與良性腫瘤(如錯構(gòu)瘤,結(jié)核瘤等)相關(guān)的基因。上述基因雖然不能直接導(dǎo)致細(xì)胞的癌變,但間接影響著細(xì)胞的增殖分化,因此,這些基因的信息是判斷肺結(jié)節(jié)良性惡性的重要參考依據(jù)。優(yōu)選的,肺結(jié)節(jié)相關(guān)的358個基因包括:35個肺癌細(xì)胞增殖分化驅(qū)動基因、41個肺癌細(xì)胞增殖分化抑癌基因、89個肺癌信號通路相關(guān)基因,124個肺部其他腫瘤相關(guān)基因,以及69個良性腫瘤相關(guān)基因。本申請所述的試劑盒,是以血漿中的超微量cfdna為檢測對象,由于cfdna反映的是當(dāng)前的基因狀態(tài),因此能夠?qū)崟r反映出肺結(jié)節(jié)患者的基因突變狀況,從而可以判斷當(dāng)前患者是良性肺結(jié)節(jié)還是惡性肺結(jié)節(jié)(肺癌)。需要說明的是,本申請所述試劑盒的檢測結(jié)果,僅僅用于分析和判斷良性肺結(jié)節(jié)和肺癌基因的生物學(xué)信息,為肺結(jié)節(jié)良性惡性區(qū)分提供判斷依據(jù)。本申請所述的試劑盒檢測受檢者外周血中超微量的ctdna突變信息,包括:肺部腫瘤相關(guān)基因的點(diǎn)突變、基因重排、擴(kuò)增、缺失、插入等,從而為受檢者病情診斷提供重要的分析依據(jù)。還需要說明的是,本申請中,cfdna是指外周血中游離的dna片段,這些片段包括ctdna,ctdna是一種無細(xì)胞狀態(tài)的胞外dna,腫瘤細(xì)胞脫落或者凋亡后ctdna被釋放,從而進(jìn)入血液循環(huán)。在癌癥患者血漿cfdna中,ctdna僅占1%,甚至0.01%。因此,本申請首次提出了針對肺結(jié)節(jié)相關(guān)的358個基因設(shè)計了75642條捕獲探針,利用該探針對cfdna文庫進(jìn)行大范圍的捕獲,充分保證能夠捕獲到超微量的ctdna,獲得重要的信息。優(yōu)選的,數(shù)據(jù)分析包括去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)、對數(shù)據(jù)進(jìn)行剪裁,以及去除polyn誤差信息;去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)包括去除mapping質(zhì)量為q10的數(shù)據(jù);對數(shù)據(jù)進(jìn)行剪裁包括剪裁去除barcode數(shù)據(jù),以及barcode后面7-10nt,以及reads最后8-10nt;去除polyn誤差信息包括去除數(shù)據(jù)中連續(xù)20個以上polyn的數(shù)據(jù)。與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明的有益效果在于:1、本發(fā)明試劑盒以外周血中ctdna為檢測對象,并針對肺結(jié)節(jié)相關(guān)的358個基因設(shè)計了75642條捕獲探針,通過高通量測序平臺讀取ctdna基因信息,獲得全面、準(zhǔn)確、實(shí)時的反映肺結(jié)節(jié)相關(guān)基因的變異情況。并且,以ctdna為檢測對象,不需經(jīng)過組織活檢,只需要少量的外周血即可完成檢測,真正實(shí)現(xiàn)了無創(chuàng)檢測。2、本發(fā)明檢測試劑盒針對ctdna中關(guān)于肺部良性、惡性肺結(jié)節(jié)的重要基因進(jìn)行捕獲測序分析,為肺癌早期進(jìn)行疾病篩查,區(qū)分出良性和惡性肺結(jié)節(jié)提供重要依據(jù)。附圖說明圖1是本申請實(shí)施例2中l(wèi)n201601(圖中用“1”表示)和ln201602(圖中用“2”表示)提取的cfdna的質(zhì)控檢測結(jié)果凝膠圖;圖2是本申請實(shí)施例2中l(wèi)n201601提取的cfdna的質(zhì)控分析圖;圖3是本申請實(shí)施例2中l(wèi)n201602提取的cfdna的質(zhì)控分析圖;圖4是本申請實(shí)施例2中l(wèi)n201601(圖中用“a4”表示)和ln201602(圖中用“a5”表示)構(gòu)建的cfdna文庫的質(zhì)控檢測結(jié)果凝膠圖;圖5是本申請實(shí)施例2中l(wèi)n201601的cfdna文庫的質(zhì)控分析圖;圖6是本申請實(shí)施例2中l(wèi)n201602的cfdna文庫的質(zhì)控分析圖;圖7是本申請實(shí)施例2中ctdna雜交文庫的質(zhì)控檢測結(jié)果凝膠圖;圖8是本申請實(shí)施例2中ctdna雜交文庫質(zhì)控分析圖;圖9是本申請實(shí)施例2中編號為ln201601(nocancer)和ln201602(cancer)樣本的突變檢測結(jié)果圖。具體實(shí)施方式肺癌是世界上發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤,我國約75%的肺癌患者在診斷時已屬晚期,5年生存率約為15.6%,這一現(xiàn)狀不但與缺乏篩查有關(guān),更與缺乏科學(xué)鑒別肺結(jié)節(jié)的方法有關(guān)。隨著低劑量ct的普遍應(yīng)用,肺結(jié)節(jié)的發(fā)現(xiàn)率成倍上升,傳統(tǒng)的影像學(xué)診斷方法已不能滿足醫(yī)生和患者的精確診斷的要求。因此,對肺結(jié)節(jié)進(jìn)行全面的基因組分析,將為早期肺癌的篩查提供重要依據(jù)。本申請正是針對這一現(xiàn)象,結(jié)合本申請人現(xiàn)有的技術(shù)優(yōu)勢,以及市場上對肺癌早篩,肺結(jié)節(jié)診斷的迫切需求,創(chuàng)新性的提出了無創(chuàng),精準(zhǔn),實(shí)時的肺結(jié)節(jié)診斷基因檢測試劑盒。相比于通過手術(shù)或穿刺活檢這種有創(chuàng)且有風(fēng)險的檢測手段,本申請的檢測對象是外周血中微量ctdna,實(shí)現(xiàn)了無創(chuàng)的檢測方法,大大降低檢測對象的風(fēng)險。并且,本申請的檢測試劑盒中的探針組分,涵蓋了目前已明確肺結(jié)節(jié)相關(guān)的358個基因包括,35個肺癌細(xì)胞增殖分化驅(qū)動基因、41個肺癌細(xì)胞增殖分化抑癌基因、89個肺癌信號通路相關(guān)基因,124肺部其他腫瘤相關(guān)基因,以及69個良性腫瘤相關(guān)的基因。本申請檢測對象為ctdna,由于早期癌癥細(xì)胞產(chǎn)生的游離循環(huán)腫瘤dna量非常低,甚至低于總cfdna的0.01%,而對于良性的肺結(jié)節(jié)這一比例更低,并且cfdna的半衰期一般只有兩小時,所以對于cfdna的捕獲有一定的困難。本申請通過優(yōu)化從cfdna的提取,到文庫構(gòu)建,再到雜交,超微量捕獲擴(kuò)增目的cfdna,放大信號,實(shí)現(xiàn)目的基因的精確檢測,保證低起始量也有非常高的靈敏度和準(zhǔn)確性。本申請的一種實(shí)現(xiàn)方式中,cfdna的測序深度達(dá)到10,000x以上,平均有效測序深度達(dá)到2000x,使得測序的靈敏度能夠達(dá)到0.1%。本申請中涉及的名詞解釋如下:捕獲探針,是指與肺結(jié)節(jié)相關(guān)的358個基因的的75642條短核苷酸序列,確保能夠覆蓋到跟良性肺結(jié)節(jié)和惡性肺結(jié)節(jié)相關(guān)的所有基因,進(jìn)行高靈敏度,高特異性的捕獲。雜交捕獲,是指利用設(shè)計的358基因的探針從大量的cfdna中結(jié)合目的cfdna片段,去除多余cfdna的過程。pcr擴(kuò)增,是指利用pcr技術(shù)對dna片段進(jìn)行擴(kuò)增,使得超微量的dna片段擴(kuò)增為一定量的dna片段,滿足實(shí)驗(yàn)要求。下面通過具體實(shí)施例和附圖對本申請作進(jìn)一步詳細(xì)說明。以下實(shí)施例僅對本申請進(jìn)行進(jìn)一步說明,不應(yīng)理解為對本申請的限制。實(shí)施例1:檢測肺結(jié)節(jié)為良性或惡性的試劑盒的組成表1:檢測肺結(jié)節(jié)為良性或惡性的試劑盒的組成編號名稱體積規(guī)格a鏈霉親和素磁珠5ml24次badapter120μl24次cpcr引物2od24次d肺結(jié)節(jié)358基因探針24μl24次eh2o2ml上述表1限定了檢測肺結(jié)節(jié)為良性或惡性的試劑盒的組成,以下對試劑盒內(nèi)部分成分進(jìn)行進(jìn)一步說明:a)本申請的試劑盒內(nèi)的鏈霉親和素磁珠是采用鏈霉親和素處理的磁珠吸附法對樣品以及pcr產(chǎn)物進(jìn)行純化??膳c探針3’端生物素進(jìn)行特異性結(jié)合,起到純化富集pcr產(chǎn)物的效果。b)本申請試劑盒內(nèi)的adapter為本申請人自行設(shè)計,adapter中部分的核苷酸序列為:5’-p-actgnnnnnnnnnnnnagatcggaagagcacacgtctgaactccagtcacxxxxxxtagagcatacggcagaagacgaacuaatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatct-3’(seqidno:1)。該序列中,由5’端開始,p為磷酸化標(biāo)記,“actg”為tag序列,“nnnnnnnnnnnn”為polyn序列,n表示隨機(jī)堿基,“agatcggaagagcacacgtctgaactccagtcac”為發(fā)夾序列,“xxxxxxxx”為第一索引序列,同樣的x表示隨機(jī)序列,即第一索引序列為隨機(jī)生成的8bp的序列,這是測序時區(qū)分不同樣本的標(biāo)記,“tagagcatacggcagaagacgaac”為第一通用引物結(jié)合序列,“u”為dutp,“aatgatacggcgaccaccgag”為第二通用引物結(jié)合序列,“atctacactctttccctacacgacgctcttccgatct”為發(fā)夾序列,前后兩個發(fā)夾序列在退火時形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。本例的adapter序列由lifetechnology公司合成。c)本申請試劑盒內(nèi)與肺結(jié)節(jié)相關(guān)的358個基因設(shè)計的引物,包括針對egfr基因l858r位點(diǎn)設(shè)計的正向引物和反向引物,具體如下:egfr基因l858r位點(diǎn)的正向引物:cataccgcagcatgtcaactag(seqidno:2);egfr基因l858r位點(diǎn)的反向引物:gagccctggtccctggtggact(seqidno:3)。d)本申請試劑盒內(nèi)針對肺結(jié)節(jié)相關(guān)的358個基因設(shè)計的75642條捕獲探針,其中egfr基因18號外顯子上游探針和下游探針具體如下:egfr基因18號外顯子上游探針:5’-cgcagcatgtcaagatcacagattttgggc-3’(seqidno:4);egfr基因18號外顯子下游探針:5’-ggccaaactgctgggtgcggaagagaaaga-3’(seqidno:5)。本申請試劑盒內(nèi)針對肺結(jié)節(jié)相關(guān)的358個基因設(shè)計的引物的檢測組分,涉及的肺結(jié)節(jié)相關(guān)的358個基因包括:與肺癌細(xì)胞生長增殖相關(guān)的驅(qū)動基因,抑制細(xì)胞生長增殖的抑癌基因,信號通路中的相關(guān)基因,肺部其他腫瘤(如肺泡細(xì)胞癌,類癌等)相關(guān)基因,與良性腫瘤(如錯構(gòu)瘤,結(jié)核瘤等)相關(guān)的基因。具體為35個肺癌細(xì)胞增殖分化驅(qū)動基因、41個肺癌細(xì)胞增殖分化抑癌基因、89個肺癌信號通路相關(guān)基因,124個肺部其他腫瘤相關(guān)基因,以及69個良性腫瘤相關(guān)基因。肺結(jié)節(jié)相關(guān)基因篩選方法:(1)整合現(xiàn)有針對肺結(jié)節(jié)病例樣本測序的文獻(xiàn)和報道,對每篇文獻(xiàn)中的體細(xì)胞突變基因進(jìn)行整合;(2)將各個文獻(xiàn)中整合出的優(yōu)先篩選基因整合到一起,并進(jìn)行篩選,去除重復(fù)基因。上述基因雖然不能直接導(dǎo)致細(xì)胞的癌變,但間接影響著細(xì)胞的增殖分化,因此,這些基因的信息是判斷肺結(jié)節(jié)良性惡性的重要參考依據(jù)。實(shí)施例2:兩例患者的肺結(jié)節(jié)基因檢測(兩個樣本分別為編號ln201601的良性肺結(jié)節(jié)和ln201602的惡性肺結(jié)節(jié)樣本)檢測方法包括以下步驟:1.采集患者的血液樣本并進(jìn)行分離,血液分離詳情如下:抽取的外周血需要保存在4℃條件下,兩個小時內(nèi)進(jìn)行處理。(1)在4℃條件下1600g離心10min,離心后將上清(血漿)分裝到多個2.0ml的離心管中。下層血細(xì)胞分裝到2ml凍存管中,即為所需血細(xì)胞;(2)在4℃條件下以16000g離心10min去除殘余細(xì)胞,將上清轉(zhuǎn)入新的2.0ml者離心管中,即得到所需的血漿。而后將樣品保存到-80℃冰箱中或干冰中待測定。2.將分離獲得的血清進(jìn)行cfdna的提取,本實(shí)驗(yàn)采用寧波市重鼎生物技術(shù)有限公司核酸提取或純化試劑盒,按照試劑盒說明書操作提取cfdna。cfdna質(zhì)控:使用qubit2.0測定每個樣本的濃度,利用agilent2100檢測cfdna的片段大小。結(jié)果顯示,ln201601和ln201602樣本都收集到了約10ml外周血,分離出的血漿分別為4.5ml和5ml,cfdna濃度分別為2.1ng/μl和3.6ng/μl;提取的cfdna的片段大小跑膠圖如圖1所示,經(jīng)過檢測儀器自帶軟件分析,兩個樣本的cfdna片段大小分布如圖2和圖3所示,在180bp有一個明顯的峰,并且在320bp有一個小峰,符合cfdna的特征,說明cfdna的質(zhì)控合格。3.白細(xì)胞dna(gdna)提取及片段化需要指出的是gdna的測序、分析,是為cfdna后續(xù)分析作為對照,過濾掉cfdna中遺傳性突變,為本申請的必要分析。3.1血細(xì)胞中的白細(xì)胞dna提取采用天根生化科技(北京)有限公司的血液基因組dna提取試劑盒進(jìn)行,按照試劑盒說明書操作提取gdna。3.2提取的白細(xì)胞gdna采用nebnextdsdnafragments酶切打斷,然后經(jīng)過omegagelextractionkit回收純化,收集100-250bp左右的片段。經(jīng)qubit2.0測定回收的片段化dna的濃度。結(jié)果顯示,ln201601和ln201602樣本回收后的片段化gdna。總量分別為242ng和158ng,滿足文庫構(gòu)建起始量要求。4.提取獲得cfdna和片段化的gdna進(jìn)行末端修復(fù),a-tialing連接adapter,構(gòu)建pre-pcr反應(yīng)體系dna的文庫構(gòu)建采用kapabiosystems公司kapahtplibrarypreparationkit試劑盒,其操作流程參照說明書,涉及到的反應(yīng)組分均按照說明書配置;需要注意的是其中pcr所用的引物和連接的adapter為本申請的試劑盒組分。文庫的質(zhì)控:qubit2.0對文庫進(jìn)行定量,測定每個樣本的濃度,利用agilent2100檢測dna文庫的片段大小。結(jié)果顯示,ln201601和ln201602樣本cfdna文庫濃度分別為53.2ng/μl和65.2ng/μl,各25μl體積。cfdna文庫的片段大小跑膠圖如圖4所示,經(jīng)過檢測儀器自帶軟件分析,兩個樣本的cfdna文庫片段大小分布如圖5和圖6所示,在300bp左右有一個明顯的峰,這是由于兩端接頭加起來有120bp,與目的片段加在一起,大概有300bp,這說明了構(gòu)建的cfdna文庫合格。5.目的片段的雜交捕獲,dna的測序捕獲是利用roche的雜交試劑盒seqcapezlibrarykit進(jìn)行,具體操作按照roche雜交試劑盒說明書進(jìn)行,其中dna目標(biāo)片段的捕獲探針為本申請的試劑盒組分。dna文庫質(zhì)控:配置qubit濃度測定試劑,測定每個樣本的濃度,利用agilent2100檢測dna文庫的片段大小。結(jié)果顯示,ln201601和ln201602樣本雜交后的濃度為24ng/μl,共25μl。兩樣本的ctdna雜交后文庫的片段大小跑膠圖如圖7所示,經(jīng)過檢測儀器自帶軟件分析,兩個樣本雜交后的cfdna文庫片段大小分布如圖8所示,在300bp左右有一個明顯的峰。由于探針捕獲的區(qū)域是目的片段和接頭區(qū)域,片段大小沒有變化,所以雜交后片段大小沒有變化,符合要求。6.將捕獲的dna文庫進(jìn)行測序,并對測序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析,取變異信息,基因型信息,snp和indel等,變異信息會進(jìn)一步地進(jìn)行校正和過濾,以獲得更高質(zhì)量的變異信息。7.結(jié)果分析:圖9為ln201601和ln201602兩個樣本的突變檢測結(jié)果圖。ln201601和ln201602樣本經(jīng)過濾后的平均測序深度超過2000x,滿足了數(shù)據(jù)分析的要求,經(jīng)分析ln201601樣本檢測的基因總突變數(shù)有12個,而ln201602樣本的基因總突變數(shù)達(dá)到134個,超過ln201601樣本的10倍以上,由此判定,ln201601樣本為良性肺結(jié)節(jié),ln201602樣本為惡性肺結(jié)節(jié)。由于良性肺結(jié)節(jié)細(xì)胞還沒有癌變,理論上基因突變較少,而由于多種因素形成的細(xì)胞癌變,是有多數(shù)的基因突變共同產(chǎn)生,一般的惡性肺結(jié)節(jié)樣本基因突變數(shù)相對較多。并且經(jīng)過病理檢測結(jié)果也驗(yàn)證了肺結(jié)節(jié)基因檢測的正確性。說明了本檢測試劑盒來區(qū)分良性肺結(jié)節(jié)和惡性肺結(jié)節(jié)的可靠性。以上內(nèi)容是結(jié)合具體的實(shí)施方式對本申請所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明,不能認(rèn)定本申請的具體實(shí)施只局限于這些說明。對于本申請所屬
技術(shù)領(lǐng)域:
的普通技術(shù)人員來說,在不脫離本申請構(gòu)思的前提下,還可以做出若干簡單推演或替換,都應(yīng)當(dāng)視為屬于本申請的保護(hù)范圍。sequencelisting<110>深圳市海普洛斯生物科技有限公司<120>一種檢測肺結(jié)節(jié)為良性或惡性的試劑盒及其應(yīng)用<160>5<170>patentinversion3.5<210>1<211>139<212>dna<213>人工序列<400>1actgnnnnnnnnnnnnagatcggaagagcacacatctgaactccagtcacxxxxxxtaga60gcataggcagaagacgaacuaatgatacggcgaccaccgagatctacactctttcccta120cacgacgctcttccgatct139<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列<400>2cataccgcagcatgtcaactag22<210>3<211>22<212>dna<213>人工序列<400>3gagccctggtccctggtgact22<210>4<211>30<212>dna<213>人工序列<400>4cgcagctgtcaagatcacagattttgggc30<210>5<211>30<212>dna<213>人工序列<400>5ggccaaactgctgggtgcgggaagagaaaga30當(dāng)前第1頁12