本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及白菜持綠性基因brnye1及其分子標(biāo)記與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

持綠性是指植株衰老后，葉片仍保持綠色而不變黃的性狀，對于以葉片為產(chǎn)品器官的白菜具有特殊重要的意義。

持綠在自然界中普遍存在，在作物中具體表現(xiàn)為，在干旱、高溫等環(huán)境條件下，作物在籽粒灌漿期或生育晚期，其葉片能夠保持較長時間的綠色并且能夠進行光合作用；在一些模式植物中，持綠主要表現(xiàn)為葉片光合功能喪失，葉片中的葉綠素不降解或者降解過程受阻，植物的葉片、果皮、果莢、種皮等部位表現(xiàn)持綠。持綠突變體是研究葉綠素代謝、植物衰老進程、植物應(yīng)對激素響應(yīng)、植物抗逆性(抗旱,鹽脅迫,耐高溫等)等一系列生理代謝過程的理想材料(田風(fēng)霞等,2010)。對農(nóng)作物中的功能性持綠突變體進行研究，有助于發(fā)現(xiàn)和鑒定一些抗性(抗旱,抗高溫和抗病等)新品種，可以豐富作物抗逆基因資源，對于作物遺傳育種和品種改良具有重要意義。研究模式植物中非功能性持綠突變體的持綠機理，可以發(fā)現(xiàn)參與葉綠素分解代謝過程的新酶及相關(guān)酶的催化特性，同時有助于揭示葉綠素降解新途徑。

目前，有研究獲得具有持綠性的白菜育種材料，由于該材料的持綠性狀在生育后期植株衰老時才表現(xiàn)，開發(fā)與該持綠性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記，對于實現(xiàn)在苗期進行鑒定選擇有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的是提供indel片段的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了indel片段在檢測或輔助檢測待測白菜的持綠表型中的應(yīng)用；

或indel片段在檢測或輔助檢測待測白菜是否為持綠白菜中的應(yīng)用；

所述indel片段為如下1)或2)或3)：

1)核苷酸序列為序列1的dna分子；

2)與1)所示的dna分子同源性大于95％、98％或99％的dna分子；

3)在嚴格條件下與1)或2)限定的dna序列雜交且編碼具有相同功能多肽的dna分子。

本發(fā)明另一個目的是提供一種檢測待測白菜是否為持綠白菜的方法。

本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：檢測待測白菜兩條同源染色體的基因組中是否均含有indel片段,若所述待測白菜兩條同源染色體的基因組中均含有indel片段，則所述待測白菜為候選為持綠白菜，若所述待測白菜兩條同源染色體的基因組中不是均含有indel片段，則所述待測白菜為或候選為非持綠白菜；

所述indel片段為如下1)或2)或3)：

1)核苷酸序列為序列1的dna分子；

2)與1)所示的dna分子同源性大于95％、98％或99％的dna分子；

3)在嚴格條件下與1)或2)限定的dna序列雜交且編碼具有相同功能多肽的dna分子。

上述方法中，所述檢測待測白菜兩條同源染色體的基因組中是否均含有indel片段的方法為如下1)或2)：

1)直接測序；

2)用擴增所述indel片段的引物對擴增，電泳檢測擴增產(chǎn)物，若pcr擴增產(chǎn)物僅含有465-475bp(實施例為471bp)的產(chǎn)物，則待測白菜兩條同源染色體的基因組中均含有indel片段，若不是僅含有465-475bp的產(chǎn)物，則待測白菜兩條同源染色體的基因組中不均含有indel片段。

上述方法中，所述引物對由序列表中序列2所示的單鏈dna分子和序列表中序列3所述的單鏈dna分子組成。

本發(fā)明第3個目的是提供一種選育持綠表型白菜的方法。

本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：培育兩條同源染色體的基因組中均含有indel片段的白菜，得到持綠表型白菜；

本發(fā)明第4個目的是提供本發(fā)明提供了一種選育非持綠表型白菜的方法。

本發(fā)明提供的一種選育非持綠表型白菜的方法，包括如下步驟：培育兩條同源染色體的基因組中不均含有indel片段的白菜，得到非持綠表型白菜。

本分目的5個目的是提供一種dna片段。

本發(fā)明提供的dna片段，為如下1)或2)或3)：

1)核苷酸序列為序列1的dna分子；

2)與1)所示的dna分子同源性大于95％、98％或99％的dna分子；

3)在嚴格條件下與1)或2)限定的dna序列雜交且編碼具有相同功能多肽的dna分子；

本發(fā)明第6個目的是提供檢測待測白菜兩條同源染色體的基因組中是否含有indel片段的物質(zhì)的用途。

本發(fā)明提供了檢測待測白菜兩條同源染色體的基因組中是否含有indel片段的物質(zhì)在檢測待測白菜是否為持綠白菜中的應(yīng)用。

上述應(yīng)用中，所述檢測待測白菜兩條同源染色體的基因組中是否含有indel片段的物質(zhì)為所述擴增所述indel片段的引物對或含有所述引物對的pcr試劑或試劑盒。

本發(fā)明第7個目的是提供一種檢測待測白菜是否為持綠白菜的產(chǎn)品。

本發(fā)明提供的產(chǎn)品，為檢測待測白菜兩條同源染色體的基因組中是否含有indel片段的物質(zhì)。

上述產(chǎn)品中，所述物質(zhì)為引物對或含有引物對的試劑或含有引物對的試劑盒；

所述引物對由序列表中序列2所示的單鏈dna分子和序列表中序列3所述的單鏈dna分子組成。

本發(fā)明第8個目的是提供一種檢測待測白菜是否為持綠白菜的方法。

本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：用上述物質(zhì)對所述待測白菜的基因組dna進行pcr擴增，檢測pcr擴增產(chǎn)物，若pcr擴增產(chǎn)物僅含有465-475bp的產(chǎn)物，則所述待測白菜為候選為持綠白菜，若pcr擴增產(chǎn)物不是僅含有465-475bp的產(chǎn)物，則所述待測白菜為或候選為非持綠白菜。

上述中，所述待測白菜為持綠表型親本或非持綠表型親本或者二者雜交后代。

含持綠基因brnye1的白菜自交系‘13a516’于2017年4月26日，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱cgmcc，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號)，菌株保藏編號為cgmccno.13795，分類命名為brassicacampestrisspp.pekinensis.

本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了位于編碼白菜不黃化蛋白基因brnye1/bra019346的外顯子區(qū)內(nèi)存在的1個與白菜持綠性連鎖的indel標(biāo)記，通過對該共顯性pcr特異性引物的擴增，可得到變異位點的序列信息，鑒定材料持綠與否以及純合與否，可用于持綠性育種材料的輔助選擇。該indel分子標(biāo)記在白菜持綠性狀鑒別上具有較重要的使用價值，可有效運用于白菜分子輔助選擇育種。目前由于持綠性狀在白菜生育后期才有明顯表現(xiàn)，表型觀察判斷費工費時，該indel分子標(biāo)記及其檢測方法替代生育末期以表型觀察判斷的方法，使得篩選可以在苗期和室內(nèi)進行，可用于大規(guī)模篩選育種材料，加快育種進程。

附圖說明

圖1為持綠基因brnye1初步定位結(jié)果。

圖2為持綠基因brnye1/bra019346在持綠性和非持綠性材料中基因表達結(jié)果。

圖3為持綠性材料和非持綠性材料pcr擴增序列比對及indel標(biāo)記；

其中，bra019346為大白菜數(shù)據(jù)庫參考基因序列；13a516為持綠親本基因序列；13a510為非持綠親本基因序列。

圖4為indelgfl在親本及f2代個體上的擴增結(jié)果；

其中，p1:非持綠親本自交系13a510

p2:持綠親本自交系13a516

m：為d2000dnamaker，共有6條條帶，大小依次為2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp，擴增產(chǎn)物對應(yīng)的條帶為431bp，471bp。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例1、白菜持綠性基因brnye1及其indel標(biāo)記的獲得

一、分離群體的構(gòu)建及遺傳分析

含持綠基因brnye1的白菜自交系‘13a516’于2017年4月26日，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱cgmcc，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號)，菌株保藏編號為cgmccno.13795，分類命名為brassicacampestrisspp.pekinensis.

以含持綠基因brnye1的白菜自交系‘13a516’為母本，非持綠白菜自交系‘13a510’(日本武藏野公司品種華冠)為父本雜交得到f1，即為正交，再配制反交組合，即‘13a510’ב13a516’，植株全部種植于沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)遺傳育種溫室基地。正反交所得f1代植株表型全部為非持綠。表明其持綠性狀受隱性核基因控制。選擇正交得到的5株f1植株自交構(gòu)建f2代作圖群體，并分別與父母本進行回交，經(jīng)調(diào)查f2代及回交群體表型，發(fā)現(xiàn)73株f1ב13a510’后代均表現(xiàn)為非持綠性狀，而f1ב13a516’后代中，47株表現(xiàn)為非持綠，42株表現(xiàn)為持綠，分離比例符合孟德爾1:1分離比率(χ2＝0.18<χ20.05＝3.84)。播種正交f1代自交后的f2代作圖群體數(shù)為14870株，在播種的全部f2群體中，非持綠8964株，3058表現(xiàn)為持綠，符合孟德爾3:1分離比(χ2＝1.13<χ20.05＝3.84)。由此，得出結(jié)論：持綠突變性狀是由一對隱性核基因控制。采用bsa-seq技術(shù)，即bsa分池結(jié)合測序(sequencing)進行定位。在f2代作圖群體中選擇持綠與非持綠典型極端表型的植株各25株，建立持綠與非持綠混池。剩余1000株表現(xiàn)典型的母本持綠表型的植株用于連鎖分析。

二、dna的提取及極端混池的構(gòu)建

1、dna的提取

a.稱取0.2g白菜持綠與非持綠材料的幼嫩葉片加入滅菌處理的2.0ml離心管中，放入液氮速凍，同時用研磨棒研磨葉片至粉末；

b.立即向上述粉末中加入700ulctab裂解液(30g/lctab，100mmol/ltris-hcl，20mmol/ledta，1.4mol/lnacl，)以及14ulβ-巰基乙醇，充分搖勻，放入65℃水浴鍋中一小時，期間每隔20分鐘，反轉(zhuǎn)搖勻一次；

c.取出離心管，冷卻至室溫后再加入與ctab等體積的700ul體積比為24:1的氯仿：異戊醇，充分顛倒搖晃3分鐘，約300下；

d.常溫離心(21-24℃)，12000rpm，5分鐘；

e.事先先把無水乙醇放到-20℃冰箱里；

f.吸取450ul上清液入新的1.5ml已滅菌的離心管，加入2倍體積預(yù)先-20℃冷凍的無水乙醇，充分混勻，于-20℃靜置0.5-1小時或-80℃靜置8-10分鐘；

g.常溫離心，12000rpm離心10分鐘；

h.棄上清液，加入1ml70％乙醇(700ul無水乙醇+300ul滅菌超純水)；

i.常溫離心，12000rpm離心1分鐘；

j.棄上清，室溫放置至完全晾干；

k.加入50ul，1倍te溶解或用100ul滅菌超純水溶解，短暫離心收集。

2.dna濃度的檢測

(1).稱取0.2g瓊脂糖，量取2ml10×tbe(硼酸緩沖液)，18ml蒸餾水，于三角瓶中混勻。

(2).用封口膜封口，于微波爐中加熱30秒，充分溶解。

(3).在充分溶解并降溫至50℃后的混合液中加入1ul1mg/ml的eb。

(4).將混合液倒入膠盒中，插好梳子，趕走氣泡，靜置室溫凝結(jié)。

(5).取1ul10×loadingbuffer指示劑，與9uldna樣混合，將混合液點入瓊脂糖凝膠膠孔中。

(6).120v電壓電泳20分鐘，帶的走向是負極向正極。

(7).取1uldna原液用酶標(biāo)儀(thermo，germany)測定濃度及od260/od280，od260/od280比值小于1.8或大于2.0的進行重新純化，將純化后的dna稀釋到50ng/μl，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.混池的構(gòu)建

選擇f2代中具有持綠極端表型的25份dna，各等量吸取1μl于已滅菌的新1.5離心管中，吸打混勻，短暫離心收集，構(gòu)建持綠混池；等量吸取1μl非持綠極端表型的25份dna構(gòu)建非持綠混池。

三、brnye1基因的初步定位

采用bsa分池結(jié)合測序(bsa-seq)的方法，對持綠、非持綠親本以及如前所述的兩極端混池進行測序，所得reads經(jīng)質(zhì)控比對后，經(jīng)snp-index進行劃窗分析，將brnye1基因初步定位與白菜第3號染色體23m-26mb范圍內(nèi)(如圖1所示)。

四、分子標(biāo)記的獲得

根據(jù)bsa-seq初步定位及精細定位結(jié)果，定位區(qū)間內(nèi)，brnye1候選基因bra019346功能注釋信息為擬南芥葉綠體不黃化基因atnye1，atnye1是擬南芥持綠性狀的決定基因；此外，brnye1候選基因bra019346在持綠材料與非持綠材料中的基因表達水平存在顯著差異(如圖2所示)，以上結(jié)果表明，brnye1基因為白菜持綠性狀的決定基因。

利用持綠與非持綠親本材料在定位區(qū)間的重測序信息，結(jié)合brassica_database(http://brassicadb.org)參考基因序列對該區(qū)間進行比對，發(fā)現(xiàn)定位區(qū)間內(nèi)3號染色體一處indel與持綠性狀連鎖。比較非持綠材料中該位點序列，在持綠材料中該位點有40bp的序列插入(如圖3所示)。由此獲得與持綠性狀完全符合的indel片段，該片段的核苷酸序列為序列1(40bp的序列g(shù)agaaatagctgcttcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa)。

自brassica_database(http://brassicadb.org)下載序列，利用primer5.0軟件，針對上述indel位點設(shè)計與白菜持綠基因brnye1連鎖的indel分子標(biāo)記indelgfl，indelgflf：5’-agccttcaacacctgacaat-3’(上游引物序列2)。

indelgflr：5’-tccaccaacgctccca-3’(下游引物序列3)。該分子標(biāo)記的擴增產(chǎn)物的為431bp(序列4)或471bp(序列5)，二者僅差序列1所示的40bp片段。

上述引物由蘇州金維智生物科技有限公司合成。

分子標(biāo)記擴增產(chǎn)物僅為471bp，基因型記做b基因型(2條同源染色體均含有indel片段)，表型為持綠；

分子標(biāo)記的擴增產(chǎn)物僅為431bp，基因型記做a基因型(同源染色體均不含有indel片段)，表型為非持綠；

分子標(biāo)記擴增產(chǎn)物為431bp和471bp，基因型記做h基因型(1條同源染色體含有indel片段，且另一條不含有indel片段)，表型為非持綠。

五、分子標(biāo)記鑒定白菜是否持綠表型的方法

為了驗證分子標(biāo)記的可靠性，對父本13a510，母本13a516及二者雜交得到f1代的自交后代f2代150株(已經(jīng)鑒定出是否為持綠株系)個體進行了檢測，檢查indelgfl分子標(biāo)記的兩種基因型(a代表母本帶型，持綠基因純合型，b代表父本非持綠基因純合型，h代表雜合基因型)在150個f2群體中的分布情況。

1、基因組dna的提取

提取待測樣本：父本、母本及f2代150株的基因組dna。

2、pcr擴增

以上述各株基因組dna為模板，用上述四獲得的分子標(biāo)記indelgfl中的indelgflf和indelgflr進行pcr擴增，擴增條件和體系如下：

a.反應(yīng)體系：10μl體系，各組分物質(zhì)的含量分別為：25ng基因組dna；0.5μmolindelgflf0.5μl；0.5μmolindelgflr0.5μl；2.5mmdntp0.8μl；10×pcrbuffer1μl；taqdnapolymerase0.5u；ddh2o補至10μl，吸打混勻，離心；

b.擴增程序：預(yù)變性95℃/5min；95℃/30s；56℃/30s；72℃/1min；35個循環(huán)后；72℃延伸5min；最后4℃保存。

3、電泳檢測擴增產(chǎn)物

將10ul上述pcr擴增產(chǎn)物與5ul的溴酚蘭變性buffer(980ml/lformamide，3.72g/ledta，2.5g/lbromphenolblue，2.5g/lxylenecyanol)混勻，95℃變性5min，7ul上樣量點入5％變性聚丙烯酰胺凝膠中，在2000v，75w條件下電泳1h20min，電泳結(jié)束后，進行銀染。經(jīng)銀染后讀帶判斷。其中，銀染包括：①固定，1l蒸餾水+100ml無水乙醇+5ml冰醋酸混合液中固定7min；②染色，1l蒸餾水+2g硝酸銀+2ml甲醛混合液中染色10min；③漂洗，用1l蒸餾水漂洗3-4秒；④顯影，最后于1l蒸餾水+15g氫氧化鈉+2ml甲醛中顯影10min。

部分電泳結(jié)果如圖4所示。

統(tǒng)計結(jié)果如表1所示，可以看出，

35份待測樣本pcr擴增產(chǎn)物大小為471bp,為b基因型，2條同源染色體均含有indel片段，其中32份為持綠表型，3份為非持綠表型，鑒定表型準(zhǔn)確率為91％；

85份待測樣本pcr擴增產(chǎn)物大小為431bp,為a基因型，2條同源染色體均不含有indel片段，均為非持綠表型，鑒定表型準(zhǔn)確率為100％；

30份待測樣本pcr擴增產(chǎn)物大小為431bp和471bp,為h基因型，1條同源染色體含有indel片段，另一條同源染色體不含有indel片段，均為非持綠表型，鑒定表型準(zhǔn)確率為100％。

上述結(jié)果表明，該indelgfl分子標(biāo)記或其對應(yīng)的indel片段可用于輔助檢測待測白菜是否為持綠株系，檢測方法如下：

檢測待測白菜兩條同源染色體的基因組中是否均含有indel片段(序列1),若兩條同源染色體的基因組中均含有indel片段，則待測白菜為候選為持綠白菜，若兩條同源染色體的基因組中不是均含有indel片段，則待測白菜為或候選為非持綠白菜。

檢測待測白菜兩條同源染色體的基因組中是否均含有indel片段(序列1)的方法為用indelgfl分子標(biāo)記擴增待測白菜的基因組dna，若pcr擴增產(chǎn)物僅含有471bp的產(chǎn)物(序列5)，則待測白菜兩條同源染色體的基因組中均含有indel片段，若pcr擴增產(chǎn)物不是僅含有471bp的產(chǎn)物，則待測白菜兩條同源染色體的基因組中不均含有indel片段。

表1為indelgfl在f2群體中的鑒定和驗證

實施例2、白菜持綠性基因brnye1的indel片段在輔助選擇中的應(yīng)用

1、基因組dna的提取

按照實施例1的五的1方法提取部分f2代單株基因組dna。

2、pcr擴增

按照實施例1的五的2方法用indel標(biāo)記中的indelgflf和indelgflr對基因組dna進行pcr擴增。

3、電泳檢測擴增產(chǎn)物

按照實施例1的五的3方法對上述pcr擴增產(chǎn)物進行電泳檢測。

若pcr擴增產(chǎn)物中僅含有471bp的擴增產(chǎn)物，則兩條同源染色體均含有indel片段，則待測樣本為或候選為持綠白菜，若pcr擴增產(chǎn)物中不僅含有471bp的擴增產(chǎn)物，則兩條同源染色體不是均含有indel片段，則待測樣本為或候選為非持綠白菜；

結(jié)果如表2所示，

表2

上述結(jié)果表明，該indel標(biāo)記可有效運用于白菜分子輔助選擇育種。

序列表

<110>沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>白菜持綠性基因brnye1及其分子標(biāo)記與應(yīng)用

<160>5

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

gagaaatagctgcttcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa40

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

agccttcaacacctgacaat20

<210>3

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

tccaccaacgctccca16

<210>4

<211>431

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

agccttcaacacctgacaattaacattttgtaatgaaaccaagaaacaaataaataatta60

ttttattttttacttacaacaggtagttctttggaaaagatgtagtatcgtaactttggg120

aagagatctaagaggaaatggccaccgctaatgtggcagtggacgtgaagagacatgtcc180

cctttcactttcttccattctgctaccacttcatctctgtatagcctatttgcccatcct240

tccaactataatataacataaatctatacacatcagcctctatattttctaaaaccgttc300

ttcagtggcactcagaaacgtatagacgcatacatacctgagagttgttaatagagtgag360

aaatagctaaggttagtttagctgtaatgtcactgtgagtgagagtatacgttcttggga420

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<210>5

<211>471

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

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agagaaatagctgcttcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaatagctaaggttagttta420

gctgtaatgtcactgtgagtgagagtatacgttcttgggagcgttggtgga471