本發(fā)明涉及遺傳生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種酵母雙雜交篩選與mkl-1蛋白質(zhì)相互作用蛋白質(zhì)的方法。

背景技術(shù)：

基因組計(jì)劃使大量的新基因不斷被發(fā)現(xiàn)，然而單純的基因組dna序列尚不能解決許多生命問題。基因是相對靜態(tài)的，而基因編碼的產(chǎn)物-蛋白質(zhì)則是動態(tài)的，蛋白質(zhì)的表達(dá)水平、存在方式以及相互作用等直接與生物的功能相關(guān)。生命活動過程與蛋白質(zhì)的相互作用也是密不可分的，如dna合成、基因轉(zhuǎn)錄激活、蛋白質(zhì)翻譯、細(xì)胞周期調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等重要的生命過程均涉及到蛋白質(zhì)復(fù)合體的作用。蛋白質(zhì)的各種相互作用的性質(zhì)有很大不同，有些聯(lián)系很強(qiáng)烈，例如結(jié)構(gòu)性的，有些則是很薄弱、時間有限的，比如在信號路徑上的信息傳遞，因此，各種蛋白質(zhì)相互作用的強(qiáng)弱和蛋白質(zhì)復(fù)合體的功能關(guān)系密切。

目前用于大規(guī)模研究蛋白質(zhì)之間相互作用的方法包括酵母雙雜交、串聯(lián)親和純化、質(zhì)譜鑒定、蛋白質(zhì)芯片以及基于生物信息學(xué)的分析方法等。酵母雙雜交系統(tǒng)是1989年由fields和song提出的，其作用原理基于真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子(如gal4和gcn4蛋白質(zhì))的結(jié)構(gòu)特性。轉(zhuǎn)錄因子通常含有兩個獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域：dna結(jié)合域(bd)和轉(zhuǎn)錄激活域(ad)，只有當(dāng)這兩種結(jié)構(gòu)域共同作用時才能使轉(zhuǎn)錄正常進(jìn)行。利用此特性，可以分別使bd與ad同“誘餌”蛋白(x)和“獵物”蛋白(y)形成融合蛋白，一般把用來進(jìn)行篩選的目的蛋白稱為“誘餌”蛋白，而篩到的陽性克隆稱為“獵物”蛋白。如果兩種蛋白x和y可以發(fā)生相互作用，就能使bd與ad在空間上充分接近，從而激活報告基因的轉(zhuǎn)錄；而單獨(dú)的bd與ad蛋白質(zhì)游離于細(xì)胞中不同的位置而分開，不能激活報告基因的轉(zhuǎn)錄。

目前公司開發(fā)出來的酵母雙雜交系統(tǒng)有很多種，比如clontech公司的matchmakergal4two-hybridsystem系列、invitrogen公司的proquesttwo-hybridsystem等。系統(tǒng)中對應(yīng)的酵母表達(dá)載體含有高拷貝的2u復(fù)制子(clontech)，或者是低拷貝的ars/cen6復(fù)制子(invitrogen)。其中的酵母菌種經(jīng)過了基因改造后既不能產(chǎn)生gal4，又不能合成亮氨酸(leu)、色氨酸(trp)、組氨酸(his)、腺嘌呤(ade)，因此，酵母在缺乏這些營養(yǎng)的培養(yǎng)基(sd-leu-trp-his-ade)上無法正常生長。當(dāng)所表達(dá)的融合蛋白能夠相互作用時，功能重建的反式作用因子能夠激活酵母基因組中的這些報告基因從而通過功能互補(bǔ)和顯色反應(yīng)篩選到陽性菌落。酵母雙雜交的文庫轉(zhuǎn)化方法有兩種，一種是直接將cdna文庫以質(zhì)粒的形式轉(zhuǎn)化到含有“誘餌”質(zhì)粒的酵母感受態(tài)細(xì)胞中；另外一種是根據(jù)酵母有性生殖的特點(diǎn)，事先將cdna文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化α接合型酵母細(xì)胞，將“誘餌”表達(dá)載體轉(zhuǎn)化a接合型細(xì)胞。α接合型和a接合型兩種單倍體之間接合(mating)能形成二倍體(bendixenc,etal.nucleicacidsres,1994,22(9):1778-9)。

酵母雙雜交系統(tǒng)主要應(yīng)用于快速驗(yàn)證已知蛋白之間的相互作用及尋找新的相互作用蛋白質(zhì)，尤其在尋找蛋白質(zhì)互作區(qū)域時相當(dāng)有優(yōu)勢。其優(yōu)點(diǎn)有:(1)采用高拷貝和強(qiáng)啟動子的表達(dá)載體使目的蛋白過量表達(dá)，方便復(fù)合物的形成；

(2)篩選過程在真核酵母活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，一定程度上反映了體內(nèi)的真實(shí)情況；

(3)檢測的結(jié)果是基因表達(dá)產(chǎn)物的級聯(lián)效應(yīng)，通過mrna產(chǎn)生多種穩(wěn)定的酶使信號放大，因而可檢測存在于蛋白質(zhì)之間的微弱的或暫時的相互作用，而細(xì)胞內(nèi)的免疫共沉淀依賴于兩個互作蛋白質(zhì)的解離程度，因?yàn)樵诿庖叱恋淼倪^程中通過洗滌的過程降低了互作信號；(4)通過激活區(qū)域與轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物蛋白的互作增強(qiáng)了雜交蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，提高了檢測靈敏度；(5)文庫來源廣泛，可采用不同組織、器官、細(xì)胞類型和特殊分化時期材料構(gòu)建成cdna文庫(lubanj,etal.curropin4biotechnol,1995,6(1):59-64)。根據(jù)不同基因和蛋白質(zhì)的特點(diǎn)，還可構(gòu)建很多適用于篩選某個特定蛋白質(zhì)的相互作用的酵母雙雜交載體和系統(tǒng)，如篩選激酶底物的酵母雙雜交系統(tǒng)(yangx,etal.science,1992,257(5070):680-2)、篩選藥物配體的酵母雙雜交系統(tǒng)(yangm,etal.nucleicacidsres,1995,23(7):1152-6)、篩選核糖體rna合成酶相互作用蛋白質(zhì)的酵母雙雜交系統(tǒng)等(nogiy,etal.procnatlacadsci,88(16):7026-38)。

目前的酵母雙雜交方法存在操作復(fù)雜，假陽性和假陰性多，結(jié)果主要為定性數(shù)據(jù)，不易精確判斷蛋白質(zhì)相互作用的強(qiáng)度等問題。

mkl-1是新近發(fā)現(xiàn)的血清反應(yīng)因子(srf)協(xié)同轉(zhuǎn)錄因子，在多種組織中廣泛表達(dá)，可以誘導(dǎo)多種類型的細(xì)胞分化，mkl-1基因還具有抗凋亡的作用。利用酵母雙雜交的方法篩選出白血病t淋巴細(xì)胞jurkat細(xì)胞中與mkl-1作用的所有蛋白，對闡明mkl-1在白血病發(fā)生發(fā)展過程中的功能及調(diào)控作用具有重要意義，為治療白血病提供理論基礎(chǔ)和可能的藥物作用靶點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供了一種酵母雙雜交篩選與mkl-1蛋白質(zhì)相互作用蛋白質(zhì)的方法，該方法簡單易行，不僅可以篩選出與mkl-1蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)，還可以判斷出mkl-1蛋白質(zhì)與靶蛋白相作用的強(qiáng)弱程度，為研究蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能提供依據(jù)。

本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：

一種酵母雙雜交篩選與mkl-1蛋白質(zhì)相互作用蛋白質(zhì)的方法，包括以下步驟：

(1)cdna文庫擴(kuò)增并提取文庫質(zhì)粒；

(2)誘餌蛋白的重組酵母菌制備：將編碼dna-bd的基因與mkl-1蛋白質(zhì)的基因構(gòu)建在同一個表達(dá)載體上，在酵母中表達(dá)兩者的融合蛋白bd-baitprotein；將融合蛋白bd-baitprotein表達(dá)質(zhì)粒直接加入酵母菌ah109感受態(tài)中并進(jìn)行熱激轉(zhuǎn)化以獲得含有能表達(dá)誘餌蛋白的重組酵母菌；

(3)cdna文庫轉(zhuǎn)化與準(zhǔn)陽性克隆的篩選：將步驟(2)中的能表達(dá)誘餌蛋白的重組酵母菌在缺陷培養(yǎng)基中培養(yǎng)后再轉(zhuǎn)接到豐富培養(yǎng)基中培養(yǎng)并達(dá)到一定的濃度，然后與步驟(1)中的cdna文庫質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染、涂sd-trp-leu-his板篩選準(zhǔn)陽性克隆；

(4)his、ade以及l(fā)acz顯色反應(yīng)篩選不同作用強(qiáng)度的陽性克?。豪胔is、ade兩種營養(yǎng)缺陷和顯色反應(yīng)單獨(dú)或者組合使用進(jìn)一步篩選得到與mkl-1蛋白質(zhì)不同作用強(qiáng)度的陽性克隆；

(5)陽性克隆dna提取和測序比對：將陽性克隆質(zhì)粒從酵母細(xì)胞中提取出來進(jìn)行dna測序，并與genbank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對分析；

(6)測序分析后的共轉(zhuǎn)化驗(yàn)證：測序并經(jīng)過分析后的獵物質(zhì)粒與誘餌質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到酵母菌ah109中以表達(dá)兩個融合蛋白質(zhì)，通過選擇篩選和β-半乳糖苷酶的活性測定進(jìn)一步排除假陽性以肯定蛋白質(zhì)相互作用的真實(shí)性。

進(jìn)一步地，所述的his、ade以及l(fā)acz顯色反應(yīng)篩選不同作用強(qiáng)度的陽性克隆的具體方法為：(1)使用ade2或his3兩者中的一種作為報告基因作為進(jìn)行營養(yǎng)缺陷篩選，得到與誘餌蛋白具有中等強(qiáng)度或較弱結(jié)合的蛋白，分離篩選出來的蛋白對應(yīng)的文庫質(zhì)粒；(2)同時使用ade2、his3兩種報告基因進(jìn)行營養(yǎng)缺陷篩選，得到與誘餌蛋白具有較強(qiáng)結(jié)合的蛋白，分離出這些蛋白對應(yīng)的文庫質(zhì)粒；(3)利用ade2，his3以及l(fā)acz三個報告基因同時篩選，得到與誘餌蛋白具有最強(qiáng)結(jié)合的蛋白，分離篩選出蛋白質(zhì)對應(yīng)的文庫質(zhì)粒。

本發(fā)明的有益效果：相發(fā)明提供一種酵母雙雜交篩選與mkl-1蛋白質(zhì)相互作用蛋白質(zhì)的方法，與相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明采用逐步增加選擇壓的方法，方便快速的篩選出與mkl-1蛋白質(zhì)不同作用程度的蛋白質(zhì)，并有利于后續(xù)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。可見，本發(fā)明所述的一種酵母雙雜交篩選與mkl-1蛋白質(zhì)相互作用蛋白質(zhì)的方法對進(jìn)一步闡明mkl-1在白血病發(fā)生發(fā)展過程中的功能及調(diào)控作用具有重要意義。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為本發(fā)明實(shí)施例2中mkl-1pcr擴(kuò)增結(jié)果示意圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中誘餌質(zhì)粒pgbkt7-mkl-1菌落pcr結(jié)果示意圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例3中mkl-1篩選文庫的轉(zhuǎn)化效率示意圖；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例4中his、ade以及l(fā)acz顯色反應(yīng)篩選不同作用強(qiáng)度的陽性克隆數(shù)柱狀圖。

具體實(shí)施方式

展示一下實(shí)例來具體說明本發(fā)明的某些實(shí)施例，且不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明的范圍。對本發(fā)明公開的內(nèi)容可以同時從材料、方法和反應(yīng)條件進(jìn)行改進(jìn)，所有這些改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明的的精神和范圍之內(nèi)。

實(shí)施例1：酵母雙雜交中文庫擴(kuò)增的優(yōu)化方案(以人胎腦的cdna文庫為例)

1.從原始購買的以大腸桿菌形式保存的文庫中吸取1μl菌液，進(jìn)行一系列的梯度稀釋，本實(shí)例中是將人胎腦cdna文庫以10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6進(jìn)行稀釋，根據(jù)梯度稀釋涂布的平板上的菌落數(shù)量準(zhǔn)確計(jì)算菌液的滴度。而一般采取2個梯度的稀釋進(jìn)行計(jì)算，由于實(shí)驗(yàn)過程中容易產(chǎn)生誤差導(dǎo)致計(jì)算的結(jié)果不一致，所以本實(shí)驗(yàn)中采取6個梯度稀釋來縮小誤差，本實(shí)例中文庫的滴度為2×10⁸。

2.一般涂布150μl菌體到直徑為15cm的lb平板上的平均菌落數(shù)為20000cfu/plate(克隆形成單位/平板)，如果我們打算用200μg文庫，(一般100-500μg文庫質(zhì)粒可以檢測大約1×106獨(dú)立克隆)那么篩選的文庫大小為2×106。

3.一般選擇3倍文庫大小的克隆數(shù)來進(jìn)行酵母雙雜交的篩選，即要求篩選的文庫能夠達(dá)到3×2×106＝6×106獨(dú)立克隆數(shù)，那么所需的文庫擴(kuò)增平板的數(shù)量n＝獨(dú)立克隆數(shù)/平均菌落數(shù)，即3×2×106/20000＝300塊平板。

4.計(jì)算文庫擴(kuò)增所需的菌液體積v1＝待檢測的獨(dú)立克隆數(shù)/文庫的滴度，即6×106/2×108＝30μl菌液，我們采用3倍計(jì)算體積的菌體即90μl菌液以獲得高覆蓋度的文庫。

5.計(jì)算總的用于稀釋文庫的培養(yǎng)基的體積v2＝300塊平板×150μl＝52.5μllb液體培養(yǎng)基。

6.吸取原始文庫90μl菌液稀釋于52.5mllb液體培養(yǎng)基，吸取150μl涂布300塊直徑為15cm的含氨芐抗生素的lb平板上，在30℃培養(yǎng)2天后用含氨芐的5mllb液體培養(yǎng)基將每塊平板上的菌刮洗下來，收集到一起，再在37℃搖床培養(yǎng)2-6個小時，菌體用quajian公司的試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒的提取，并測試質(zhì)粒的濃度。

實(shí)施例2：誘餌蛋白的重組酵母菌制備

為將mkl-1基因cdna克隆構(gòu)建到酵母雙雜交的誘餌載體上，需對含有目的基因的載體進(jìn)行擴(kuò)增、sfii酶切，獲得該克隆片段，并與sfii酶切的酵母雙雜交誘餌載體質(zhì)粒pgbkt7載體連接。

1.引物合成

根據(jù)mkl-1基因的cdna序列分別在其兩端添加sfii的酶切位點(diǎn)序列設(shè)計(jì)引物，用于擴(kuò)增mkl-1基因的cdna片段，引物序列如下：

mkl-1-f：aaggccattacggccatggcaagtaactgtgagaaaatg

mkl-1-r：ccggccgaggcggccttagaggttcccattttgtttg

2.目的基因擴(kuò)增

用于擴(kuò)增目的片段的熱聚合酶：全式金transstartfastpfudnapolymerase

如圖1所示，條帶m為dnamarker，條帶所對應(yīng)的濃度從上至下依次為3k、2k、1.5k、1k、750bp、500bp，泳帶1～3為擴(kuò)增的mkl-1產(chǎn)物。

3.mkl-1與誘餌載體質(zhì)粒pgbkt7的酶切和連接

酶切和連接反應(yīng)體系：

4.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌top10

向步驟3中連接反應(yīng)體系中加入100μl大腸桿菌top10感受態(tài)，冰浴30min；然后儀次42℃水浴熱激90s(45s-2min)和冰浴2min。冰浴結(jié)束后，向其中加入900μllb液體培養(yǎng)基，37℃，150rpm，孵育1h；離心收菌，棄上清液，留約100μl混勻后涂布含kan抗性的lb平板，恒溫培養(yǎng)過夜。

5.酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒pgbkt7-mkl-1的鑒定

從步驟4的連接體系轉(zhuǎn)化平板上，隨機(jī)挑取8個大腸桿菌轉(zhuǎn)化子接種于帶卡那抗性的液體lb培養(yǎng)基，于37℃，250rpm振蕩培養(yǎng)16h(過夜)后，用質(zhì)粒引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，并對擴(kuò)增得到陽性條帶的克隆選取兩個(編號為1、2)進(jìn)行質(zhì)粒抽提(axygen質(zhì)粒小量抽提試劑盒)和測序。插入片段測序結(jié)果經(jīng)比對確認(rèn)正確后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

如圖2所示，m為dnamarker，條帶所對應(yīng)的濃度由上至下依次為：3k、2k、1.5k、1k、750bp、500bp，泳帶1～8為pgbkt7-mkl-1轉(zhuǎn)化子pcr產(chǎn)物。選取泳帶1和2進(jìn)行質(zhì)粒抽取和測序，結(jié)果顯示插入片段測序正確，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

6.mkl-1自激活檢測

pgbkt7-mkl-1+pgadt7共轉(zhuǎn)化ah109長出的酵母轉(zhuǎn)化子隨機(jī)挑取了6個菌落進(jìn)行自激活檢測，以pgadt7-larget/pgbkt7-p53為陽性對照、pgadt7-larget/pgbkt7-laminc為陰性對照。包括his3、ade2和lacz共3個報告基因的檢測。

his3和ade2的檢測采用點(diǎn)板培養(yǎng)的方法，將轉(zhuǎn)化子點(diǎn)板至sd-tlha平板，30℃恒溫培養(yǎng)4天，觀察其生長狀態(tài)。

以pgadt7-t+pgbkt7-53(已經(jīng)明確t蛋白和53蛋白是在酵母細(xì)胞內(nèi)能夠發(fā)生結(jié)合并啟動報告基因表達(dá)的兩種蛋白)為陽性對照，pgadt7-t+pgbkt7-lam(已經(jīng)明確t蛋白和lam蛋白在酵母細(xì)胞內(nèi)不能發(fā)生結(jié)合)為陰性對照，lacz報告基因的檢測方法如下：

1)從轉(zhuǎn)化平板隨機(jī)挑取6個菌落于濾紙片上；

2)將濾紙完全浸于液氮中90s，取出常溫放置2min晾干；

3)在培養(yǎng)皿中加入新鮮配制的顯色液，一般9cm培養(yǎng)皿用2-3ml顯色液。顯色液配方：

4)將顯色液加入培養(yǎng)皿中，再放入一張干凈的濾紙，讓其完全浸濕，將凍溶后的濾紙放在最上面，使顯色液浸透表層，蓋上皿蓋。30℃避光培養(yǎng)，20min后開始觀察，一般2h后可開始看到顏色變化，4-5h拍照記錄結(jié)果。結(jié)果表明，對照菌株在sd-tl缺陷平板上都能正常生長，而僅有陽性對照可在sd-tlha缺陷平板生長，pgbkt7-mkl-1+pgadt7轉(zhuǎn)化子中隨機(jī)挑選的6個菌落在sd-tlha缺陷平板上不能生長，生長狀態(tài)與陰性對照相同，lacz檢測結(jié)果也與陰性對照相同，因此mkl-1誘餌克隆沒有自激活作用。

實(shí)施例3：cdna文庫轉(zhuǎn)化與準(zhǔn)陽性克隆的篩選

用含有正確pgbkt7-mkl-1誘餌質(zhì)粒的ah109酵母轉(zhuǎn)化子作為受體菌制備感受態(tài)，將文庫質(zhì)粒pgadt7--cdna轉(zhuǎn)入其中，涂sd-trp-leu-his+5mm3at平板。

1)從sd-t平板挑取單克隆菌種接于液體sd-t培養(yǎng)基50ml，30℃，225rpm，振蕩培養(yǎng)18h；

2)轉(zhuǎn)接于ypda液體500ml，使初始o(jì)d600＝0.2，30℃，225rpm，振蕩培養(yǎng)4-5h，至od600＝0.6；

3)離心收菌，室溫，4000rpm，5min；

4)用30ml無菌水重懸菌體，混勻，離心收菌，室溫，4000rpm，5min，棄上清；

5)用20ml0.1mliac重懸菌體，混勻，離心收菌，室溫，4000rpm，5min，棄上清；

6)用10ml0.1mliac重懸菌體，混勻，離心收菌，室溫，4000rpm，5min，棄上清；

7)向離心管中依次加入如下試劑，用槍頭吹打混勻，或劇烈振蕩1min左右，至完全混勻；

8)30℃水浴孵育，30min；

9)42℃水浴熱激，25min；

10)30℃水浴復(fù)蘇1h；

11)離心收菌，室溫，4000rpm，5min，棄上清，用8ml無菌水重懸菌體，盡量溫和地混勻，從中取20μl培養(yǎng)物經(jīng)梯度稀釋后涂sd-tl平板3塊，用于檢測文庫轉(zhuǎn)化效率。其余涂sd-tlh+5mm3at平板，每塊200μl，共40塊；

12)30℃恒溫培養(yǎng)3-4天，觀察轉(zhuǎn)化結(jié)果，記錄轉(zhuǎn)化效率，結(jié)果如圖3所示，計(jì)算出的轉(zhuǎn)化總數(shù)為(27/0.2+118/2+340/20)×1/3×8000＝5.6×10⁵，轉(zhuǎn)化效率為5.6×10⁵/25μg＝2.25×10⁴/μg。

實(shí)施例4：his、ade以及l(fā)acz顯色反應(yīng)篩選不同作用強(qiáng)度的陽性克隆

1.陽性克隆his報告基因的檢測

以pgadt7-t+pgbkt7-53(已經(jīng)明確t蛋白和53蛋白是在酵母細(xì)胞內(nèi)能夠發(fā)生結(jié)合并啟動報告基因表達(dá)的兩種蛋白)為陽性對照，pgadt7-t+pgbkt7-lam(已經(jīng)明確t蛋白和lam蛋白在酵母細(xì)胞內(nèi)不能發(fā)生結(jié)合)為陰性對照，將實(shí)施例3中初始陽性克隆轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接到sd-tl缺陷型平板中繼續(xù)培養(yǎng)2-3天，然后將此sd-tl缺陷型平板上長出的72個初始陽性克隆轉(zhuǎn)化子分別用無菌水稀釋后點(diǎn)種至sd-tl和sd-tlh缺陷平板，30℃恒溫培養(yǎng)3-4天，在his3報告基因的檢測結(jié)果中，可以看到，陽性對照在sd-tl和sd-tlh都能正常生長，而陰性對照由于不會激活his3報告基因，在sd-tl可以正常生長，但在缺少his這種氨基酸的sd-tlh平板上不能生長。因此，在72個初始陽性克隆中，能在sd-tlh生長的是激活了his報告基因質(zhì)粒，從而篩選出與40種能與誘餌蛋白具有中等強(qiáng)度或較弱結(jié)合的蛋白。

2.陽性克隆his和ade報告基因的檢測

以pgadt7-t+pgbkt7-53(已經(jīng)明確t蛋白和53蛋白是在酵母細(xì)胞內(nèi)能夠發(fā)生結(jié)合并啟動報告基因表達(dá)的兩種蛋白)為陽性對照，pgadt7-t+pgbkt7-lam(已經(jīng)明確t蛋白和lam蛋白在酵母細(xì)胞內(nèi)不能發(fā)生結(jié)合)為陰性對照，將實(shí)施例3中初始陽性克隆轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接到sd-tl缺陷型平板中繼續(xù)培養(yǎng)2-3天，然后將此sd-tl缺陷型平板上長出的72個初始陽性克隆轉(zhuǎn)化子分別用無菌水稀釋后點(diǎn)種至sd-tl和sd-tlha缺陷平板，30℃恒溫培養(yǎng)3-4天，在ade2和his3報告基因的檢測結(jié)果中，可以看到，陽性對照在sd-tl和sd-tlha都能正常生長，而陰性對照由于不會激活his3和ade2報告基因，在sd-tl可以正常生長，但在缺少his和ade這種氨基酸的sd-tlh平板上不能生長。因此，在72個初始陽性克隆中，能在sd-tlha生長的是激活了his和ade報告基因質(zhì)粒，從而篩選出23種能與誘餌蛋白具有較強(qiáng)結(jié)合的蛋白。

3.陽性克隆lacz報告基因檢測

以pgadt7-t+pgbkt7-53(已經(jīng)明確t蛋白和53蛋白是在酵母細(xì)胞內(nèi)能夠發(fā)生結(jié)合并啟動報告基因表達(dá)的兩種蛋白)為陽性對照，pgadt7-t+pgbkt7-lam(已經(jīng)明確t蛋白和lam蛋白在酵母細(xì)胞內(nèi)不能發(fā)生結(jié)合)為陰性對照，將篩選出的與誘餌蛋白具有較強(qiáng)結(jié)合的蛋白質(zhì)粒用無菌水重懸后點(diǎn)于濾紙片上進(jìn)行l(wèi)acz報告基因檢測，結(jié)果顯示，上述陽性克隆中共有9個沒能通過lacz報告基因的檢測，即篩選出14種能與誘餌蛋白具有最強(qiáng)結(jié)合的蛋白。

如圖4所示，在72種準(zhǔn)陽性克隆中，使用his3作為報告基因進(jìn)行營養(yǎng)缺陷篩選，得到40種與誘餌蛋白具有中等強(qiáng)度或較弱結(jié)合的蛋白，同時使用ade2、his3兩種報告基因進(jìn)行營養(yǎng)缺陷篩選，得到23種與誘餌蛋白具有較強(qiáng)結(jié)合的蛋白，利用ade2，his3以及l(fā)acz三個報告基因同時篩選，得到14種與誘餌蛋白具有最強(qiáng)結(jié)合的蛋白，分別分離篩選出蛋白質(zhì)對應(yīng)的文庫質(zhì)粒。

實(shí)施例5：陽性克隆dna提取和測序比對

將實(shí)施例4中的陽性克隆菌株分別接入sd-tl液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)過夜后采用酵母小量抽提試劑盒(索萊寶公司)抽提酵母質(zhì)粒。然后，將抽提得到的酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌top10新鮮感受態(tài)進(jìn)行擴(kuò)增。

大腸桿菌top10新鮮感受態(tài)制備步驟：

1)種子液：接種top10單克隆至3mllb液體培養(yǎng)基，37℃，220rpm，振蕩培養(yǎng)16h(過夜)；

2)轉(zhuǎn)接1ml種子液至100mllb液體培養(yǎng)基，37℃，220rpm，振蕩培養(yǎng)2h；

3)待菌液降至室溫后離心收菌，或冰浴一段時間后離心收菌，離心：4℃，5000rpm，5min，棄上清；

4)用0.1mmgcl2懸浮菌體，100ml菌液用10ml0.1mmgcl2，輕輕吹打，充分混勻，冰浴10min-1h；

5)離心收菌，4℃，5000rpm，5min，棄上清；

6)用0.1mcacl2懸浮菌體，100ml菌液用4mlcacl2。輕輕吹打，充分懸??；

7)冰浴30min后可用于質(zhì)粒擴(kuò)增，每個酵母抽提產(chǎn)物用100μl的感受態(tài)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

將含有陽性克隆的top10轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接含有amp的lb液體培養(yǎng)擴(kuò)增后抽提質(zhì)粒(axygen質(zhì)粒小量抽提試劑盒)，對質(zhì)粒進(jìn)行dna測序和blast比對。

本實(shí)驗(yàn)篩選到與mkl-1蛋白質(zhì)相互作用的72個準(zhǔn)陽性克隆質(zhì)粒和與mkl-1蛋白質(zhì)不同作用強(qiáng)度的陽性克隆質(zhì)粒，經(jīng)過balst比對，分別屬于40種不同的蛋白編碼基因。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。