本發(fā)明屬于基因工程及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及與甘肅高山細(xì)毛羊羊毛細(xì)度相關(guān)的遺傳標(biāo)記及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

甘肅高山細(xì)毛羊是甘肅省1981年培育而成的毛肉兼用細(xì)毛羊品種，屬于綿羊的一種，主要分布于祁連山高寒牧區(qū)的肅南裕固族自治縣和天祝藏族自治縣，現(xiàn)存欄量約200多萬只，是當(dāng)?shù)剞r(nóng)牧民賴以生存的主要生活資料和生產(chǎn)資料。甘肅高山細(xì)毛羊成年公、母羊的剪毛量為8.5kg和4.4kg，主體細(xì)度為18.1～23μm，凈毛率為43～45%。雖然甘肅高山細(xì)毛羊毛用性能良好，但與優(yōu)質(zhì)細(xì)毛羊品種的生產(chǎn)性能相比，還有較大差距。例如世界最著名的細(xì)毛羊品種澳洲美利奴，成年公、母羊的剪毛量為8～14kg和4.5～6.3kg，細(xì)度為17～23μm，凈毛率為60～70%。這對甘肅省細(xì)毛羊育種和生產(chǎn)工作提供了更高的要求，但也反映出甘肅高山細(xì)毛羊的毛用性能有較大的遺傳改良空間，凸顯了科技對于細(xì)毛羊產(chǎn)業(yè)的支撐作用。

羊毛性狀是重要的經(jīng)濟性狀，包括產(chǎn)毛量、細(xì)度、彎曲度、斷裂強度、伸度、凈絨率等多個指標(biāo)，其中產(chǎn)毛量和細(xì)度是2個最重要的指標(biāo)。羊毛性狀受到遺傳因素和非遺傳因素的影響。雖然產(chǎn)毛量和細(xì)度屬于中等遺傳力性狀，但也屬于不能早期度量以及度量難度較大、成本較高的性狀，因此，利用常規(guī)育種方法（表型選擇+后裔測定）對羊毛性狀的改良難以在短期內(nèi)取得良好效果。分子標(biāo)記輔助選擇是改良此類性狀的有效方法，可以明顯縮短世代間隔，達到“早選、準(zhǔn)選”目的，但前提是尋找到調(diào)控綿羊羊毛性狀的關(guān)鍵基因或與之相連鎖的分子遺傳標(biāo)記。

角蛋白（keratins）和角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白（keratin-associatedproteins，kaps）是羊毛纖維的主要蛋白成分，約占羊毛重量的90%。角蛋白聚集成束形成8～10nm的纖維細(xì)絲，即角蛋白中間絲（keratinintermediatefilaments，kifs），kaps通過大量的二硫鍵交聯(lián)形成一個半剛性基質(zhì)嵌入到kifs的半胱氨酸殘基中，從而形成羊毛纖維的主體結(jié)構(gòu)。因此，kaps蛋白在羊毛纖維中發(fā)揮了重要作用，決定了它的理化特性。目前為止，已在人類中鑒定出超過80個kaps蛋白質(zhì)的編碼基因krtaps基因和25個基因家族。krtaps基因結(jié)構(gòu)簡單，長度較小。它只包含一個開放閱讀框，沒有內(nèi)含子，長度約在600～1500bp之間。研究表明，已鑒別的所有krtaps基因都有多態(tài)性，且核苷酸序列變異影響了綿羊的羊毛用性狀。例如，wang等在11號染色體中離krtaps基因約30mb的位置上發(fā)現(xiàn)了影響綿羊卷曲度的qtl。在制毯光澤（feltinglustre）突變毛囊中，krtap6-1、krtap7-1和krtap8-1基因的表達明顯下調(diào)，而krtap2-12和krtap4-2基因的表達明顯上調(diào)。parson等報道krtap6基因的核苷酸變異顯著影響了美利奴羊的平均纖維直徑。roldan等在包含krtap6基因的區(qū)域內(nèi)，檢測到影響美利奴羊毛彎曲度和產(chǎn)毛量的一個qtl。zhou等進一步發(fā)現(xiàn)krtap6-1基因的序列變異與羊毛纖維直徑顯著相關(guān)（p<0.05），一個57-bp的核苷酸刪除引起了羊毛細(xì)度變細(xì)，即擁有這個突變的綿羊有較大的纖維直徑標(biāo)準(zhǔn)誤、纖維直徑變異系數(shù)和較差的手感。在綿羊半同胞家族中，iteege-mweza等發(fā)現(xiàn)krtap1-1基因的多態(tài)性明顯影響了綿羊的產(chǎn)毛量、毛叢長度和光澤度（p<0.05）。同時，krtap1-2的多態(tài)性與綿羊的凈毛重和污毛重密切相關(guān)。

鑒于kaps蛋白在羊毛纖維中的重要作用，以及編碼基因krtaps與羊毛性狀的高度相關(guān)性，krtaps基因可以作為研究綿羊羊毛性狀的重要候選基因。但是與人類相比，綿羊中只有11個krtaps基因家族（包含27個基因）被鑒別出來。這說明大量的綿羊krtaps基因有待鑒別和分離，例如人類和小鼠中已描述了krtap15-1基因及其編碼蛋白kap15-1的序列特征、表達特點和遺傳特征，但該基因在綿山羊中尚未被鑒別出來。

因此，本發(fā)明以甘肅高山細(xì)毛羊為研究對象，首先利用生物信息學(xué)技術(shù)鑒定綿羊的krtap15-1基因，進而利用pcr-sscp方法研究該基因的核苷酸序列變異和氨基酸特征，最后探討基因多態(tài)性對甘肅高山細(xì)毛羊羊毛性狀的影響，以期為甘肅高山細(xì)毛羊的遺傳改良提供理論基礎(chǔ)和指導(dǎo)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供與甘肅高山細(xì)毛羊羊毛細(xì)度相關(guān)的遺傳標(biāo)記及其應(yīng)用。

本發(fā)明的第一個目的是提供與甘肅高山細(xì)毛羊羊毛細(xì)度相關(guān)的遺傳標(biāo)記，其位于krtap15-1基因上，具體的核苷酸序列為序列表中seqidno.1；

在序列表seqidno.1的核苷酸序列中，其編碼區(qū)存在6個snps：c.133a/g、c.171c/t、c.229c/t、c.245t/c、c.323g/a和c.339t/c；等位基因為a時，羊毛較細(xì)；等位基因為b時，羊毛較粗；

所述等位基因a為：在序列表seqidno.2的核苷酸序列中，第133bp處的堿基為a，第171bp處的堿基為c，第229bp處的堿基為c，第245處的堿基為t，第323處的堿基為g，第339處的堿基為t；

所述等位基因b為：在序列表seqidno.3的核苷酸序列中，第133bp處的堿基為a，第171bp處的堿基為c，第229bp處的堿基為t，第245處的堿基為c，第323處的堿基為a，第339處的堿基為c。

本發(fā)明的第二個目的是提供用于檢測上述的與甘肅高山細(xì)毛羊羊毛細(xì)度相關(guān)的遺傳標(biāo)記的引物對，所述引物對為：

5'-gaactcaggaatcccaacag-3；

5'-taaccatgaggtgactggag-3。

本發(fā)明的第三個目的是提供上述遺傳標(biāo)記在鑒定甘肅高山細(xì)毛羊羊毛細(xì)度中的應(yīng)用，所述應(yīng)用包括以下步驟：

（1）提取待測羊的基因組dna；

（2）以待測羊的基因組dna為模板，利用權(quán)利要求2中所述的引物對進行pcr擴增；

（3）檢測pcr擴增產(chǎn)物，如果擴增序列的開放閱讀框區(qū)中，等位基因為a，羊毛較細(xì)；等位基因為b，羊毛較粗；

所述等位基因a為：在序列表seqidno.2的核苷酸序列中，第133bp處的堿基為a，第171bp處的堿基為c，第229bp處的堿基為c，第245處的堿基為t，第323處的堿基為g，第339處的堿基為t；

所述等位基因b為：在序列表seqidno.3的核苷酸序列中，第133bp處的堿基為a，第171bp處的堿基為c，第229bp處的堿基為t，第245處的堿基為c，第323處的堿基為a，第339處的堿基為c。

作為優(yōu)選，步驟（2）中，所述pcr反應(yīng)使用的擴增體系以20μl計為：dna模板1.0μl（約50ng/μl）、10×pcrbuffer2.0μl、上下游引物各0.5μl、150μmdntps0.3μl、0.5utaqdnapolymerase0.2μl和ddh2o15.5μl。

作為優(yōu)選，步驟（2）中，所述pcr反應(yīng)的條件為：94℃預(yù)變性2分鐘，94℃變性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35個循環(huán)，最后延伸5分鐘。

作為優(yōu)選，步驟（3）中，所述檢測pcr擴增產(chǎn)物采用sscp檢測，同時設(shè)置陽性對照，凝膠電泳后染色，得到sscp電泳帶型圖，根據(jù)圖譜中條帶的類型和陽性對照結(jié)果對待測樣本的羊毛細(xì)度性狀進行判斷。

步驟（3）中，也可以用其他方法來檢測pcr擴增產(chǎn)物，比如直接進行測序，并不限于本發(fā)明中所述方法。

本發(fā)明的第四個目的是提供含有上述的引物對的用于檢測甘肅高山細(xì)毛羊羊毛細(xì)度的試劑盒。

本發(fā)明的第五個目的是提供與甘肅高山細(xì)毛羊羊毛細(xì)度相關(guān)的遺傳標(biāo)記在甘肅高山細(xì)毛羊分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。

本發(fā)明以甘肅高山細(xì)毛羊為研究對象，首先利用生物信息學(xué)技術(shù)鑒定綿羊的krtap15-1基因，進而利用pcr-sscp方法研究該基因的核苷酸序列變異和氨基酸特征，最后探討了基因多態(tài)性對甘肅高山細(xì)毛羊羊毛性狀的影響，以期為甘肅高山細(xì)毛羊的遺傳改良提供理論基礎(chǔ)和指導(dǎo)。

附圖說明

附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與本發(fā)明的實施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中：

圖1為甘肅高山細(xì)毛羊krtap15-1（方框）和已鑒定的11個krtaps基因在綿羊1號染色體上的位置；

圖2為甘肅高山細(xì)毛羊krtap15-1基因的pcr-sscp檢測結(jié)果；

圖3為基于krtaps基因的核苷酸序列構(gòu)建的nj樹。

具體實施方式

以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為市售。

實施例1

1材料與方法

1.1實驗材料

在天?？h松山鎮(zhèn)明星養(yǎng)殖專業(yè)合作社，以5只甘肅高山細(xì)毛羊種公羊為父本，甘肅高山細(xì)毛羊為母本，采用人工授精方式配種。后代中選擇286只甘肅高山細(xì)毛周歲羊只，現(xiàn)場測定產(chǎn)毛量，在背中線處采集羊毛樣本用于實驗室測定細(xì)度和毛長。每只羊頸靜脈采血8ml，加入酸性檸檬酸葡萄糖（citricaciddextrose，acd）抗凝，-20℃凍存，用于基因組dna提取。

1.2基因組dna提取

采用常規(guī)的苯酚-氯仿法提取血液基因組dna。

1.3綿羊基因組生物信息學(xué)分析

以山羊krtap15-1基因的編碼區(qū)序列作為模板（genbank登錄號：ay510116.1），應(yīng)用genbank的blast程序在綿羊基因組v3.1（http://www.livestockgenomics.csiro.au/sheep/）中進行同源性搜索。搜索結(jié)果中，同源性最高的綿羊基因序列被假定為甘肅高山細(xì)毛羊krtap15-1基因的編碼區(qū)序列。

1.4引物設(shè)計和pcr擴增

根據(jù)假定的甘肅高山細(xì)毛羊krtap15-1基因序列，設(shè)計引物，擴增甘肅高山細(xì)毛羊該基因的編碼區(qū)和側(cè)翼調(diào)控區(qū)序列。兩對引物分別是5'-gaactcaggaatcccaacag-3'（oar1:123496812_123496793）和5'-taaccatgaggtgactggag-3（oar1:123496318_123496337）。引物由大連寶生物有限責(zé)任公司合成。

pcr擴增采用20μl體系，包括dna模板1.0μl（約50ng/μl）、10×pcrbuffer2.0μl、上下游引物各0.5μl、150μmdntps0.3μl、0.5utaqdnapolymerase0.2μl和ddh2o15.5μl。

pcr擴增條件：94℃預(yù)變性2分鐘，94℃變性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35個循環(huán)，最后延伸5分鐘。

pcr擴增結(jié)果用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5甘肅高山細(xì)毛羊krtap15-1基因的sscp多態(tài)性檢測

取0.7μlpcr產(chǎn)物加入7μl上樣緩沖液（98%甲酰胺、10mmedta、0.025%甲酰胺和0.025%二甲苯青）。95℃變性5分鐘后立即置于冰水混合物中，上樣于16×18cm、10%（acr：bis=37.5：1）的聚丙烯酰胺凝膠中，在0.5×tbe、15℃（恒溫）、250v電壓條件下電泳19小時。電泳結(jié)束后采用byun等的方法對聚丙烯酰胺凝膠進行銀染顯色。

1.6等位基因序列測定

凝膠銀染顯色后判定個體的基因型，測序方法因純合子和雜合子而異。如果個體的sscp條帶是純合子，用pcr擴增產(chǎn)物直接測序。如果sscp條帶是雜合子，按照gong等描述的方法切膠測序。序列測定由上海生工生物有限公司完成，每種基因型均選擇3個不同的綿羊個體進行測序，以確保測序結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.7序列分析

用dnaman（v5.2.10）軟件進行核苷酸序列的比對和翻譯；用popgene（v3.2）計算用hardy-weinberg平衡；用genbank的在線blast軟件（http://www.ncbi.nlm.nih.goc/）搜索同源性；用netphos2.0在線軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/netphos/）預(yù)測多肽鏈中潛在的磷酸化位點。

用mega（v4.0）構(gòu)建鄰接進化樹（neighbor-joining,nj），nj樹的置信度以1000次自展分析進行重復(fù)檢驗。用于構(gòu)建進化樹的序列包括本發(fā)明獲得的甘肅高山細(xì)毛羊krtap15-1基因的4條等位基因序列，genbank下載的人（nm_181623.1）、山羊（ay510116.1）、野牛（xm_010855855.1）和兔子（xm_002716683.2）的krtap15-1基因序列，以及綿羊其它的高硫krtaps基因序列，包括krtap1-1（nm_001159760.1）、krtap1-2（hq897975）、krtap1-3（nm_001159761.1）、krtap2-3（u60024）、krtap3-1（m21099）、krtap3-2（m21100）、krtap3-3（m21103）、krtap11-1（hq595352）、krtap13-3（jn377429）和krtap24-1（jx112014）。

1.8相關(guān)性分析

采用spss（20.0）軟件的一般線性混合效應(yīng)模型（generallinermixed-effectmodels，glmms）分析頻率大于5%的等位基因的狀態(tài)（存在或缺失）和基因型對甘肅高山細(xì)毛羊羊毛性狀（產(chǎn)毛量、細(xì)度和毛長）的影響。相關(guān)性分析表明，性別和父本（配種公羊）對羊毛性狀有極顯著的影響（p<0.01），出生等級（單羔和雙羔）對羊毛性狀沒有顯著影響（p>0.05）。因此在模型中，等位基因狀態(tài)（或基因型）和性別作為固定效應(yīng)，父本作為隨機效應(yīng)。由于所有甘肅高山細(xì)毛羊的羊毛性狀均在周歲時被測定，且在天?？h松山鎮(zhèn)同一環(huán)境條件下飼養(yǎng)，因此在模型中沒有考慮年齡和環(huán)境因素。

等位基因狀態(tài)對羊毛性狀影響的研究模型：y=μ+allele+gender+sire+e

基因型對羊毛性狀影響的研究模型：y=μ+genotype+gender+sire+e

其中，y為羊毛性狀表型值，μ為群體均值，allele為等位基因狀態(tài)（用0和1分別表示缺失和存在），genotype為基因型，gender為性別，sire為父本（配種公羊），e為隨機誤差。

2結(jié)果

2.1甘肅高山細(xì)毛羊krtap15-1基因的鑒定和核苷酸序列變異檢測

以山羊krtap15-1基因的編碼區(qū)序列作為模板（genbank登錄號：ay510116.1），應(yīng)用genbank的blast程序在綿羊基因組v3.1中進行同源性搜索。結(jié)果顯示，在綿羊1號染色體上發(fā)現(xiàn)了一個包含411bp開放閱讀框（oar1：123496381_123496791；e=0）的片段，這個片段與山羊krtap15-1基因有98%的序列同源性。同源性最高的綿羊基因序列被假定為甘肅高山細(xì)毛羊krtap15-1基因的編碼區(qū)序列。11個以前被鑒定的綿羊krtaps基因也分布在這個片段附近。從著絲粒著絲點開始，這些基因依次是krtap11-1、krtap7-1、krtap8-1、krtap8-2、krtap6-5、krtap6-2、krtap6-4、krtap6-1、krtap6-3、鑒定的krtap15-1、krtap13-3和krtap24-1（圖1）。

圖1為假定的甘肅高山細(xì)毛羊krtap15-1（方框）和已鑒定的11個krtaps基因在綿羊1號染色體上的位置；其中，加粗的豎線代表krtaps基因，箭頭代表轉(zhuǎn)錄方向，箭頭下的數(shù)值代表krtaps基因的名稱（例如11.1代表krtap11-1），基因間的空格代表基因在綿羊基因組v3.1中的距離。

經(jīng)pcr擴增和測序，得到包含開放閱讀框的495bp的擴增片段，與目的大小一致。495bp的擴增片段在綿羊基因組v3.1中的位置為123496318—123496812，開放閱讀框的位置為123496381—123496791；經(jīng)sscp分析，在286只甘肅高山細(xì)毛羊中，鑒定出a、b、c和d4個帶型（圖2）。blast比對顯示，4個帶型對應(yīng)的核酸序列之間有所差別，但它們與綿羊基因組v3.1的序列同源性均在95%以上。

圖2為甘肅高山細(xì)毛羊krtap15-1基因的pcr-sscp檢測結(jié)果。

nj進化樹顯示，這4個帶型對應(yīng)的核酸序列與已鑒定出的綿羊krtaps基因有較低的同源性（沒有聚為一支），但與山羊、人類、野牛和兔子的krtap15-1基因有最高的序列同源性（首先與這些物種的krtap15-1基因聚為一支）（圖3）。根據(jù)與綿羊基因組的高度同源性以及系統(tǒng)進化樹結(jié)果，這4個帶型對應(yīng)的核酸序列是甘肅高山細(xì)毛羊krtap15-1基因的等位基因，它們被錄入genbank中，序列號為kx817979-kx817982。

圖3為基于krtaps基因的核苷酸序列構(gòu)建的nj樹。

2.2甘肅高山細(xì)毛羊krtap15-1基因的snps

測序結(jié)果表明，4個等位基因在411bp的編碼區(qū)內(nèi)存在6個snps：c.133a/g、c.171c/t、c.229c/t、c.245t/c、c.323g/a和c.339t/c。其中c.133a/g、c.229c/t、c.245t/c和c.323g/a是非同義突變，它們分別導(dǎo)致了p.thr45ala、p.pro77ser、p.phe82ser和p.ser108asn的氨基酸改變，詳見下述序列和表1。

表1綿羊krtap15-1基因的snps

注：snps參照人類基因組突變學(xué)會（hgvs）制定的規(guī)則命名（http://www.hgvs.org/mutnomen/）；snps的位置指變異位點在krtap15-1基因cds編碼區(qū)中的位置，如c.133a/g指krtap15-1基因cds編碼區(qū)中的第133個核苷酸發(fā)生了a/g變異。

當(dāng)?shù)任换驗楸?中的a時，包含開放閱讀框的495bp的擴增片段的核苷酸序列為：

其中，cds編碼區(qū)的核苷酸序列為：

當(dāng)?shù)任换驗楸?中的b時，cds編碼區(qū)的核苷酸序列為：

當(dāng)?shù)任换驗楸?中的c時，cds編碼區(qū)的核苷酸序列為：

當(dāng)?shù)任换驗楸?中的d時，cds編碼區(qū)的核苷酸序列為：

其中，下劃線標(biāo)注部分為等位基因中發(fā)生的snps。

2.3氨基酸序列分析

甘肅高山細(xì)毛羊krtap15-1基因編碼含有136個氨基酸的多肽鏈。這條多肽鏈含有高含量的絲氨酸（20.59～21.32mol%），中等含量的甘氨酸（11.03mol%）、苯丙氨酸（8.82～9.56mol%）、蘇氨酸（7.35～8.09mol%）和半胱氨酸（7.35mol%），其它氨基酸的含量較低。4條多肽鏈的等電點均為8.36，它們有14～17個潛在的磷酸化位點。

2.4krtap15-1等位基因和基因型在甘肅高山細(xì)毛羊中的頻率

在286只甘肅高山細(xì)毛羊中，共鑒別出a、b、c和d4種等位基因，它們的頻率分別為77.97%、15.21%、5.95%和0.87%。存在8種基因型，其中優(yōu)勢基因型為aa、ab、bb和ac，它們的頻率分別為67.83%、12.23%、8.04%和6.99%；其余基因型bc、cc、ad和dd的頻率之和僅為4.91%。

2.5甘肅高山細(xì)毛羊3種羊毛性狀間的表型相關(guān)性

由表2可知，剪毛量與羊毛細(xì)度和毛長呈極顯著正相關(guān)（p<0.01），羊毛細(xì)度與毛長無相關(guān)性（p>0.05）。

表2甘肅高山細(xì)毛羊3種羊毛性狀間的表型相關(guān)性

注：^**表示p<0.01。

2.6krtap15-1基因多態(tài)性與甘肅高山細(xì)毛羊羊毛性狀的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果表明，性別和父本對甘肅高山細(xì)毛羊的剪毛量、細(xì)度和毛長有極顯著影響（p<0.01），出生等級對羊毛性狀沒有顯著影響（p>0.05）（表3）。因此，應(yīng)用一般線性混合效應(yīng)模型研究krtap15-1基因多態(tài)性對甘肅高山細(xì)毛羊羊毛性狀的影響時，性別作為固定效應(yīng)，父本作為隨機效應(yīng)，模型中沒有考慮出生等級。

表3性別、父本和出生等級對甘肅高山細(xì)毛羊羊毛性狀的影響

注：表格數(shù)字為p值，^**p<0.01。

在甘肅高山細(xì)毛羊上發(fā)現(xiàn)的8種基因型中，aa、ab、bb和ac的基因型頻率大于5%，其余4種基因型的頻率均小于5%。因此，比較了這4個基因型之間的羊毛性狀差異。結(jié)果顯示，基因型對甘肅高山細(xì)毛羊的剪毛量和毛長沒有顯著影響（p>0.05），但對細(xì)度有極顯著影響（p<0.01）。4個基因型個體間的羊毛細(xì)度大小順序為bb>ab>ac>aa，其中bb基因型個體的細(xì)度較ab基因型高0.8μm（p<0.05），較ac和aa基因型分別高2.2和2.5μm（p<0.01）；ab基因型個體的細(xì)度分別較ac和aa基因型高1.4和1.7μm（p<0.01）；ac和aa基因型個體之間的細(xì)度無顯著差異（p>0.05）（表4）。

表4krtap15-1基因型與甘肅高山細(xì)毛羊羊毛性狀的相關(guān)性

注：同行不同大、小寫字母分別表示差異極顯著（p<0.01）或顯著（p<0.05），無字母表示差異不顯著（p>0.05）。

在甘肅高山細(xì)毛羊上發(fā)現(xiàn)的4個等位基因中，等位基因a、b和c的頻率均大于5%，等位基因d的頻率小于5%，因此分析了前三個等位基因的存在或缺失對羊毛性狀的影響（表5）。結(jié)果表明，3個等位基因?qū)裘亢兔L均沒有顯著影響（p>0.05），等位基因a和b對細(xì)度有極顯著影響，等位基因c對細(xì)度沒有顯著影響（p>0.05）。含有等位基因a的個體的細(xì)度較缺失等位基因a的個體低2.3um（p<0.01），含有等位基因b的個體的細(xì)度較缺失等位基因b的個體高2.0um（p<0.01）。等位基因?qū)Ω拭C高山細(xì)毛羊羊毛細(xì)度的影響結(jié)果與基因型結(jié)果一致。

表5krtap15-1等位基因與甘肅高山細(xì)毛羊羊毛性狀的相關(guān)性

3結(jié)論

krtap15-1的基因型和等位基因?qū)Ω拭C高山細(xì)毛羊的細(xì)度有極顯著影響（p<0.01），4個基因型個體間的羊毛細(xì)度大小順序為bb>ab>ac>aa。含有等位基因a的個體的細(xì)度較缺失等位基因a的個體低2.3um（p<0.01），含有等位基因b的個體的細(xì)度較缺失等位基因b的個體高2.0um（p<0.01）。因此，對甘肅高山細(xì)毛羊的羊毛細(xì)度進行選種時，應(yīng)選留含有aa和ac基因型的個體，淘汰含有等位基因b的個體，以減低甘肅高山細(xì)毛羊的細(xì)度。

實施例2

甘肅高山細(xì)毛羊羊毛細(xì)度檢測試劑盒，包括：

1、引物對

5'-gaactcaggaatcccaacag-3；

5'-taaccatgaggtgactggag-3。

2、pcr檢測試劑

pcr擴增采用20μl體系，包括dna模板1.0μl（約50ng/μl）、10×pcrbuffer2.0μl、上下游引物各0.5μl、150μmdntps0.3μl、0.5utaqdnapolymerase0.2μl和ddh2o15.5μl。

3、陽性對照

陽性對照a：將序列表seqidno.1中的核苷酸序列；

陽性對照b：將序列表seqidno.1的等位基因換成表1中的b；

陽性對照c：將序列表seqidno.1的等位基因換成表1中的c；

陽性對照d：將序列表seqidno.1的等位基因換成表1中的d。

該試劑盒的使用方法參照實施例1。

最后應(yīng)說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細(xì)的說明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

序列表

<110>甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>與甘肅高山細(xì)毛羊羊毛細(xì)度相關(guān)的遺傳標(biāo)記及其應(yīng)用

<210>1

<211>495

<212>dna

<213>甘肅高山細(xì)毛羊krtap15-1核苷酸序列

<400>1

gaactcaggaatcccaacagcatgtctttcaactgtagcacgggaaacttctcccgttcc60

cttggaggttacttgggagtcccagtttccacctgtgattctttctaccccagcaatgtt120

gtctactcccccagcactttccagctgggctccactctctacagtgactgtcaggagaac180

ttctttaggcccgtcagcttccagacaccctgtgctgtgaccagatctttccagacatcc240

tgctcccatccacagaatttcatcttccgcagtccctgccagacaatttacactggatct300

ctagggtctggaaatattggccttgggtcttttggttgtggaagtactggcttccagtct360

ctgggctgtggatccaacttctgctccccaacgtacgtttcctccaggagttgccggtca420

tcttattactaaccagcctttagctcacgcttttgtgaatcaactttctgaaggactcca480

gtcacctcatggtta495

<210>2

<211>411

<212>dna

<213>甘肅高山細(xì)毛羊krtap15-1的等位基因a

<400>2

atgtctttcaactgtagcacgggaaacttctcccgttcccttggaggttacttgggagtc60

ccagtttccacctgtgattctttctaccccagcaatgttgtctactcccccagcactttc120

cagctgggctccactctctacagtgactgtcaggagaacttctttaggcccgtcagcttc180

cagacaccctgtgctgtgaccagatctttccagacatcctgctcccatccacagaatttc240

atcttccgcagtccctgccagacaatttacactggatctctagggtctggaaatattggc300

cttgggtcttttggttgtggaagtactggcttccagtctctgggctgtggatccaacttc360

tgctccccaacgtacgtttcctccaggagttgccggtcatcttattactaa411

<210>3

<211>411

<212>dna

<213>甘肅高山細(xì)毛羊krtap15-1的等位基因b

<400>3

atgtctttcaactgtagcacgggaaacttctcccgttcccttggaggttacttgggagtc60

ccagtttccacctgtgattctttctaccccagcaatgttgtctactcccccagcactttc120

cagctgggctccactctctacagtgactgtcaggagaacttctttaggcccgtcagcttc180

cagacaccctgtgctgtgaccagatctttccagacatcctgctcccattcacagaatttc240

atctcccgcagtccctgccagacaatttacactggatctctagggtctggaaatattggc300

cttgggtcttttggttgtggaaatactggcttccagtccctgggctgtggatccaacttc360

tgctccccaacgtacgtttcctccaggagttgccggtcatcttattactaa411

<210>4

<211>411

<212>dna

<213>甘肅高山細(xì)毛羊krtap15-1的等位基因c

<400>4

atgtctttcaactgtagcacgggaaacttctcccgttcccttggaggttacttgggagtc60

ccagtttccacctgtgattctttctaccccagcaatgttgtctactcccccagcactttc120

cagctgggctccgctctctacagtgactgtcaggagaacttctttaggcccgtcagcttc180

cagacaccctgtgctgtgaccagatctttccagacatcctgctcccattcacagaatttc240

atctcccgcagtccctgccagacaatttacactggatctctagggtctggaaatattggc300

cttgggtcttttggttgtggaaatactggcttccagtccctgggctgtggatccaacttc360

tgctccccaacgtacgtttcctccaggagttgccggtcatcttattactaa411

<210>5

<211>411

<212>dna

<213>甘肅高山細(xì)毛羊krtap15-1的等位基因d

<400>5

atgtctttcaactgtagcacgggaaacttctcccgttcccttggaggttacttgggagtc60

ccagtttccacctgtgattctttctaccccagcaatgttgtctactcccccagcactttc120

cagctgggctccactctctacagtgactgtcaggagaacttctttaggcctgtcagcttc180

cagacaccctgtgctgtgaccagatctttccagacatcctgctcccatccacagaatttc240

atcttccgcagtccctgccagacaatttacactggatctctagggtctggaaatattggc300

cttgggtcttttggttgtggaagtactggcttccagtctctgggctgtggatccaacttc360

tgctccccaacgtacgtttcctccaggagttgccggtcatcttattactaa411