本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，涉及duox1在腫瘤診斷、預測預后方面的應用。

背景技術：

肺癌是嚴重危害人類健康和生命的疾病，在世界范圍內其發(fā)病率和死亡率均已躍居至癌癥的首位。在中國，肺癌是發(fā)病率和死亡率上升速度最快的惡性腫瘤，已取代肝癌成為惡性腫瘤死亡的首要因素。腺癌是肺癌最主要的組織學類型，占所有病例的50％以上，是肺癌防治和研究的重點之一。與其他惡性腫瘤一樣，早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療是降低肺腺癌死亡率的關鍵。

雖然既往大量的研究意圖闡述和解釋肺腺癌患者致病的具體原因，但肺腺癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學機制目前仍不清楚。因此，探索肺腺癌細胞發(fā)生和發(fā)展中的分子生物學行為的變化，探尋新的有效的肺腺癌分子生物學診斷、治療和預后檢測標志物，闡明肺腺癌細胞侵襲和轉移的分子機制是當前肺腺癌臨床治療和研究中面臨和亟待解決的嚴峻課題。近年來，隨著分子生物學的不斷發(fā)展，一些新的生物標志物已經出現(xiàn)，申請?zhí)枮椋?01510220102.9、201510233085.2、201510243857、201610202285.6、201610200867、201610200574.2、201610200855.8、201610301281.3、201610201902專利文獻均披露了可以用于肺癌診斷的基因標志物。這些生物標志物的發(fā)現(xiàn)不僅對肺腺癌的病理診斷提供了很大的幫助，并為其預后判斷、治療方案的選擇提供了更全面的依據(jù)，在一定程度上發(fā)揮了獨特的作用。進一步尋找肺腺癌早期診斷和復發(fā)轉移的分子標志物，對肺腺癌的診斷和治療具有重要的理論意義和臨床應用價值。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明利用高通量測序技術篩選出了在肺腺癌組織中差異表達的基因并利用大樣本pcr進行驗證，獲得了可以用于肺腺癌診斷和治療的分子標志物-duox1。使用該基因進行肺腺癌的診斷能夠在癌癥早期即可進行判斷，新的診斷方法具有高效、特異的有益效果。

本發(fā)明提供了一種診斷肺腺癌的工具，所述工具能夠檢測duox1基因或duox1蛋白的表達水平。所述工具包括能夠結合duox1基因的核酸或者能夠結合duox1蛋白的物質(例如抗體)。所述核酸能夠檢測duox1基因的表達水平；所述物質能夠檢測duox1蛋白的表達水平。

進一步，所述診斷肺腺癌的工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高通量測序平臺；高通量測序平臺是一種特殊的診斷肺腺癌的工具，隨著高通量測序技術的發(fā)展，對一個人的基因表達譜的構建將成為十分便捷的工作。通過對比疾病患者和正常人群，或者癌癥組織和癌旁組織的基因表達譜，容易分析出哪個基因的異常與疾病相關。因此，在高通量測序中獲知duox1基因的異常與肺腺癌相關也屬于duox1基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護范圍之內。

本發(fā)明還提供了一種預測肺腺癌預后的工具，所述預測肺腺癌預后工具包括能夠結合duox1基因的核酸或者能夠結合duox1蛋白的物質(例如抗體)。所述核酸能夠檢測duox1基因的mrna水平；所述物質能夠檢測duox1蛋白的表達水平。

進一步，所述預測肺腺癌預后的工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高通量測序平臺；高通量測序平臺是一種特殊的診斷肺腺癌的工具，隨著高通量測序技術的發(fā)展，對一個人的基因表達譜的構建將成為十分便捷的工作。通過對比疾病患者和正常人群，或者癌癥組織和癌旁組織的基因表達譜，容易分析出哪個基因的異常與疾病相關。因此，在高通量測序中獲知duox1基因的異常與肺腺癌相關也屬于duox1基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護范圍之內。

本發(fā)明的檢測產品、診斷工具中使用的抗duox1抗體或其片段所識別的氨基酸的數(shù)目沒有特別限制，只要抗體能夠結合duox1即可。

本發(fā)明還提供了檢測duox1基因或duox1蛋白的產品在制備肺腺癌診斷工具中的用途。

本發(fā)明還提供了檢測duox1基因或duox1蛋白的產品在制備預測肺腺癌預后工具中的用途。

進一步，所述檢測duox1基因或duox1蛋白的產品包括檢測duox1基因或duox1蛋白的表達水平的產品。所述產品包括能夠結合duox1基因的核酸或者能夠結合duox1蛋白的物質(例如抗體)。所述核酸能夠檢測duox1基因的表達水平；所述物質能夠檢測duox1蛋白的表達水平。

本發(fā)明的檢測duox1基因的產品可基于使用核酸分子的已知方法來發(fā)揮其功能：如pcr、如southern雜交、northern雜交、點雜交、熒光原位雜交(fish)、dna微陣列、aso法、高通量測序平臺等。使用該產品可以定性地、定量地、或半定量地實施分析。

包含在上述產品中的核酸可以通過化學合成來獲得，或通過從生物材料制備含有期望核酸的基因，然后使用設計用于擴增期望核酸的引物擴增它來獲得。

進一步，所述pcr方法為已知方法，例如，arms(amplificationrefractorymutationsystem，擴增不應突變系統(tǒng))法、rt-pcr(逆轉錄酶-pcr)法、嵌套pcr法等等。擴增的核酸可以通過使用點印跡雜交法、表面等離子共振法(spr法)、pcr-rflp法、原位rt-pcr法、pcr-sso(序列特異性寡核苷酸)法、pcr-ssp法、ampflp(可擴增片段長度多態(tài)性)法、mvr-pcr法、和pcr-sscp(單鏈構象多態(tài)性)法來檢測。

上面所述的核酸包括擴增duox1基因的引物，產品中包括的引物可以通過通過化學合成來制備，通過使用本領域技術人員知道的方法參考已知信息來適當?shù)卦O計，并通過化學合成來制備。

在本發(fā)明的具體實施方案中，所述核酸為qpcr實驗中使用的擴增引物，所述引物的序列如seqidno.1(正向序列)和seqidno.2(反向序列)所示。

上面所述的核酸還可包括探針，所述探針可以通過化學合成來制備，通過使用本領域技術人員知道的方法參考已知信息來恰當設計，并通過化學合成來制備，或者可以通過從生物材料制備含有期望核酸序列的基因，并使用設計用于擴增期望核酸序列的引物擴增它來制備。

本發(fā)明的檢測duox1蛋白的產品可基于使用抗體的已知方法來發(fā)揮其功能：例如，可以包括elisa、放射免疫測定法、免疫組織化學法、western印跡等。

本發(fā)明的檢測duox1蛋白的產品包括特異性結合duox1蛋白的抗體或其片段?？梢允褂萌魏谓Y構、尺寸、免疫球蛋白類別、起源等的抗體或其片段，只要它結合靶蛋白質即可。本發(fā)明的檢測產品中包括的抗體或其片段可以是單克隆的或多克隆的?？贵w片段指保留抗體對抗原的結合活性的抗體一部分(部分片段)或含有抗體一部分的肽。抗體片段可以包括f(ab′)2、fab′、fab、單鏈fv(scfv)、二硫化物鍵合的fv(dsfv)或其聚合物、二聚化v區(qū)(雙抗體)、或含有cdr的肽。本發(fā)明的檢測duox1蛋白的產品可以包括編碼抗體或編碼抗體片段的氨基酸序列的分離的核酸，包含該核酸的載體，和攜帶該載體的細胞。

標記物與抗體或其片段的結合可以通過本領域普遍知道的方法來實施。例如，可以如下熒光標記蛋白質或肽：用磷酸鹽緩沖液清洗蛋白質或肽，添加用dmso、緩沖劑、等準備的染料，然后混合溶液，再于室溫放置10分鐘。另外，標記可使用商品化的標記試劑盒，諸如生物素標記試劑盒，如生物素標記試劑盒-nh2、生物素標記試劑盒-sh(dojindolaboratories)；堿性磷酸酶標記試劑盒諸如堿性磷酸酶標記試劑盒-nh2、堿性磷酸酶標記試劑盒-sh(dojindolaboratories)；過氧化物酶標記試劑盒諸如過氧化物酶標記試劑盒-nh2、過氧化物酶標記試劑盒-nh2(dojindolaboratories)；藻膽蛋白標記試劑盒諸如藻膽蛋白標記試劑盒-nh2、藻膽蛋白標記試劑盒-sh、b-藻紅蛋白標記試劑盒-nh2，b-藻紅蛋白標記試劑盒-sh、r-藻紅蛋白標記試劑盒-nh2、r-藻紅蛋白標記試劑盒sh(dojindolaboratories)；熒光標記試劑盒諸如熒光素標記試劑盒-nh2、hilytefluor(tm)555標記試劑盒-nh2、hilytefluor(tm)647標記試劑盒-nh2(dojindolaboratories)；及dylight547和dylight647(technochemicalcorp.)、zenon(tm)、alexafluor(tm)抗體標記試劑盒、qdot(tm)抗體標記試劑盒(invitrogencorporation)和ez-標記物蛋白質標記試劑盒(funakoshicorporation)。為了正確標記，可以使用適宜的儀器來檢測經過標記的抗體或其片段。

作為依照本發(fā)明的檢測產品的樣品，可以使用例如自活檢受試者獲得的組織樣品或流體。樣品不受特別限制，只要它適于本發(fā)明的測定；例如，它可以包括組織、血液、血漿、血清、淋巴液、尿液、漿膜腔液、脊髓液、滑液、房水、淚液、唾液、或其級分或經過處理的材料。

在本發(fā)明的具體實施方案中，所述樣品來自受試者的組織。

在本發(fā)明中，“預后”是指腫瘤患者在通過手術處理等抑制或緩解腫瘤生長后的過程或結果。在本說明書中，預后可以是通過手術處理抑制或緩解腫瘤生長后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20年或更久時的生機狀態(tài)。預后可以通過檢查生物標志物即duox1蛋白或編碼duox1蛋白的基因來預測。預后預測可以這樣進行：根據(jù)生物標志物的有或無，或者升高或降低，確定患者的預后是良好還是不良，或者確定良好預后或不良預后的概率。

在本發(fā)明中，“預后良好”是指在通過手術處理等為患者抑制或緩解腫瘤生長之后，患者長時期(例如3、5、6、7、8、9、10、15、20年或更長)沒有危急狀況?；蛘撸A后好可以意指在這樣長時間內存活、無轉移、無復發(fā)、或無再發(fā)。例如，預后良好可以意指至少3年或尤其是至少5年存活，優(yōu)選沒有轉移或復發(fā)。預后良好最優(yōu)選的狀態(tài)是長期無疾病的存活。如本文中所使用的，“預后良好”還可以包括任何這樣的狀態(tài)，其中可以發(fā)現(xiàn)疾病如轉移，但是惡性低且不嚴重地影響生存能力。

在本發(fā)明中，“預后不良”是指患者在通過手術處理等抑制或緩解腫瘤生長后的短時期(例如1、2、3、4、5年或更短)內發(fā)生致命狀況?；蛘?，預后差是指在這樣的短時期里死亡、轉移、復發(fā)、或再發(fā)。例如，預后差可以意指至少3年或尤其至少5年內復發(fā)、轉移、或死亡。

預測預后是指預測患者狀況的過程或結果，并不意味著能以100％的準確度預測患者狀況的過程或結果。預測預后是指確定某些過程或結果的可能性是否增加，而并不意味著通過與某些過程或結果不發(fā)生的情況比較來確定發(fā)生某些過程或結果的可能性。如本發(fā)明而言，本發(fā)明中duox1基因或duox1蛋白的水平降低的患者中，與不顯示該特征的患者相比，更有可能觀察到特定過程或結果。

進一步，所述檢測duox1基因或duox1蛋白的產品可以是檢測duox1基因或duox1蛋白的試劑、也可以是包含所述試劑的試劑盒、芯片、試紙等，也可以是使用所述試劑的高通量測序平臺。

本發(fā)明還提供了一種含有duox1基因或duox1蛋白的激活劑的藥物。

本發(fā)明還提供了上述激活劑在制備治療肺腺癌的藥物中的應用。

本發(fā)明的duox1基因或duox1蛋白的激活劑不受限制，只要是可以促進或者增強duox1或涉及duox1上游或下游途徑的物質的表達或活性，且對于治療腫瘤有效的藥物即可。

進一步，所述激活劑包括duox1基因、duox1蛋白、促進型mirna、促進型轉錄調控因子、或促進型靶向小分子化合物。

所述激活劑還包括包含攜帶duox1基因的載體或者宿主細胞。

本發(fā)明的激活劑一方面可以用于補充內源性的duox1蛋白的缺失或不足，通過提高duox1蛋白的表達，從而治療因duox1蛋白缺乏導致的肺腺癌。另一方面可以用于增強duox1蛋白的活性，從而治療肺腺癌。

本發(fā)明的藥物可以作為醫(yī)藥單獨施用或與其它藥物一起施用?？梢耘c本發(fā)明的藥物一起施用的其它藥物不受限制，只要它不損害本發(fā)明的治療性或預防性藥物的效果即可，優(yōu)選的是，用于治療或預防腫瘤的藥物可以包括例如烷化劑，諸如異環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺、達卡巴嗪、替莫唑胺、尼莫司汀、白消安、丙卡巴肼、美法侖、和雷莫司汀；抗代謝物，諸如依諾他濱、卡培他濱、卡莫氟、克拉屈濱、吉西他濱、阿糖胞苷、阿糖胞苷十八烷基磷酸鹽(cytarabineocfosfate)、替加氟、替加氟-尿嘧啶、替加氟吉美嘧啶奧替拉西鉀、去氧氟尿苷、羥基脲、氟尿嘧啶、氟達拉濱、培美曲塞、噴司他丁、巰嘌呤、和甲氨蝶呤；植物生物堿，諸如伊立替康、依托泊苷、索布佐生、多西他賽、nogitecan、帕利他賽、長春瑞濱、長春地辛、和長春堿；抗癌抗生素，諸如放線菌素d、阿柔比星、氨柔比星、伊達比星、表柔比星、凈司他丁stimalamer、柔紅霉素、多柔比星、吡柔比星、博來霉素、培洛霉素、絲裂霉素c、和米托蒽醌；基于鉑的藥物，諸如奧沙利鉑、卡鉑、順鉑、和奈達鉑；激素藥物，諸如阿那曲唑、依西美坦、雌莫司汀、炔雌醇、氯地孕酮、戈舍瑞林、他莫昔芬、地塞米松、托瑞米芬、比卡魯胺、氟他胺、潑尼松龍、磷雌酚、米托坦、甲睪酮、甲羥孕酮、美雄烷、亮丙瑞林、和來曲唑；生物反應修飾劑，諸如干擾素α、干擾素β、干擾素γ、白介素、烏苯美司、干bcg、和香菇多糖；和分子靶向藥物，諸如伊馬替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib)、吉姆單抗、奧佐米星、他米巴羅汀、曲妥單抗、維a酸、硼替佐米(bortezomib)、和利妥昔單抗等。

本發(fā)明的藥物可根據(jù)需要制備成各種劑型。包括但不限于，經皮、粘膜、鼻、口頰、舌下或經口使用的片劑、溶液劑、顆粒劑、貼劑、膏劑、膠囊劑、氣霧劑或栓劑。

本發(fā)明的藥物的施用途徑不受限制，只要它能發(fā)揮期望的治療效果或預防效果即可，包括但不限于靜脈內，腹膜內，眼內，動脈內，肺內，口服，小泡內，肌肉內，氣管內，皮下的，通過皮膚，通過胸膜，局部的，吸入，通過粘膜，皮膚，腸胃，關節(jié)內，心室內，直腸，陰道，顱骨內，尿道內，肝內，瘤內。在某些情況下，可以系統(tǒng)地給藥。在某些情況下是局部地給藥。

本發(fā)明的藥物的劑量不受限制，只要獲得期望的治療效果或者預防效果即可，可以依據(jù)癥狀、性別、年齡等來恰當?shù)拇_定。本發(fā)明的治療藥物或預防藥物的劑量可以使用例如對疾病的治療效果或者預防效果作為指標來確定。

本發(fā)明還提供了一種肺腺癌的治療方法，所述方法包括激活duox1基因或duox1蛋白。

進一步，所述方法包括促進duox1基因的表達，或促進duox1蛋白的表達或增強duox1蛋白的活性。

本發(fā)明還提供了一種腫瘤藥物的篩選方法，可以通過在對癌細胞添加測試藥物后或在對腫瘤模型動物施用測試藥物后的某個時期測量duox1基因或者duox1蛋白的表達水平來測定腫瘤藥物改善腫瘤預后的效果。更具體地說，當duox1基因或者duox1蛋白的表達水平在添加或施用測試藥物后升高時或者恢復正常水平時，可選擇該藥物作為改善腫瘤預后的治療藥物。

本發(fā)明還提供了一種診斷肺腺癌或預測肺腺癌預后的方法，所述方法包括如下步驟：

(1)獲取受試者的樣品；

(2)檢測受試者樣品中duox1基因或蛋白的表達水平；

(3)將測得的duox1基因或蛋白的表達水平與受試者的患病與否關聯(lián)起來。

(4)與對照相比，duox1基因或蛋白的表達水平降低，則該受試者被診斷為肺腺癌，或該受試者被確定為預后不良。

在本發(fā)明的上下文中，“診斷肺腺癌”既包括判斷受試者是否已經患有肺腺癌、也包括判斷受試者是否存在患有肺腺癌的風險。

本文所用的“治療”涵蓋患有相關疾病或病癥的哺乳動物例如人類中治療相關的疾病或疾病狀態(tài)，并且包括：

(1)預防疾病或疾病狀態(tài)在哺乳動物中發(fā)生，尤其是當該哺乳動物易感于所述疾病狀態(tài)，但尚未被診斷出患有這種疾病狀態(tài)時；

(2)抑制疾病或疾病狀態(tài)，即阻止其發(fā)生；或者

(3)緩解疾病或疾病狀態(tài)，即使疾病或疾病狀態(tài)消退。

術語“治療”通常涉及治療人類或動物(例如，被獸醫(yī)所應用)，其中可達到某些預期的治療效果，例如，抑制病癥的發(fā)展(包括降低發(fā)展速度、使發(fā)展停止)、改善病癥和治愈病癥。還包括作為預防措施(例如預防)的治療。對還沒有發(fā)展為病癥但有發(fā)展為該病癥危險的患者的用途，也包括在術語“治療”中。

本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果：

本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)了一種診斷肺腺癌的分子標志物，使用該分子標志物可以在肺腺癌發(fā)生的早期即可作為判斷，提供了患者的生存率。

另外，通過預測患者的預后，本發(fā)明能夠提供有意義的信息來為患者決定治療方案策略。

本發(fā)明的包括duox1基因或蛋白的激活劑的治療藥物可用作新的肺腺癌的治療藥物。

附圖說明

圖1顯示利用qpcr在mrna水平上檢測duox1基因過表達情況的統(tǒng)計圖；

圖2顯示利用免疫印跡在蛋白水平上檢測duox1基因過表達情況的統(tǒng)計圖；

圖3顯示duox1基因過表達對肺腺癌細胞增殖影響的統(tǒng)計圖。

具體的實施方式

下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實施例1篩選差異表達基因

1、取材：

8例原發(fā)肺腺癌患者的手術切除癌組織和癌旁組織作為實驗樣本。所有癌組織均術后病理證實為肺腺癌。全部原發(fā)肺腺癌患者術前均未行放、化療，全部病例臨床資料完整。

2、組織rna的獲取

從組織樣品中提取totalrna，利用nanodrop2000對所提rna的濃度和純度進行檢測，瓊脂糖凝膠電泳檢測rna完整性，agilent2100測定rin值。單次建庫要求rna總量5ug，濃度≥200ng/μl，od260/280介于1.8～2.2之間。

3、去除rrna

細胞內一部分(>24％)的長鏈非編碼rna都是缺少傳統(tǒng)polya尾的，因此采用去除rrna的方式建庫可以獲得更加全面的lncrna信息。

4、片段化rna

illumina平臺是針對短序列片段進行測序，去除rrna得到的mrna和lncrna是完整的rna序列，平均長度可能達幾kb，因此需要對其進行隨機打斷。利用金屬離子，可以將rna隨機斷裂成200bp左右的小片段。

5、反轉合成cdna

在逆轉錄酶的作用下，利用隨機引物，以mrna為模板反轉合成一鏈cdna，進行二鏈合成時，dntps試劑中用dutp代替dttp，使cdna第二鏈中堿基包含a/u/c/g。

6、連接adaptor

雙鏈的cdna結構為粘性末端，加入endrepairmix將其補成平末端，隨后在3’末端加上一個a堿基，用于連接y字形的接頭。

7、ung酶消化cdna二鏈

在pcr擴增前，用ung酶將cdna第二鏈消化，從而使文庫中僅包含cdna第一鏈。

8、illuminahiseq4000上機測序

文庫富集，pcr擴增15個cycles；

2％瓊脂糖膠回收目的條帶(certifiedlowrangeultraagarose)；

tbs380(picogreen)定量，按數(shù)據(jù)比例混合上機；

cbot上進行橋式pcr擴增，生成clusters；

hiseq4000測序平臺，進行2*150bp測序。

9、原始測序數(shù)據(jù)過濾

將序列末端(5’端和3’端)低質量(質量值小于20)的堿基修剪掉；

去除含n比率超過10％的reads；

10、mrna差異表達分析

分析軟件：cuffdiff:(http://cufflinks.cbcb.umd.edu/)

cuffdiff是cufflinks套件里用來計算差異表達的一個工具，cuffdiff利用tophat比對的結果，調用cufflinks計算每個基因/轉錄本的表達量。通常采用默認參數(shù)運行軟件，同時根據(jù)實際情況，如測序數(shù)據(jù)量，基因組情況對參數(shù)做適當?shù)恼{整。

顯著差異mrna篩選條件：p-value<0.05，兩組的count平均值之差大于10。

11、結果

測序結果顯示：與癌旁組織相比，肺腺癌組織中差異表達基因為1321個，其中上調的為587個，下調的為734個。

實施例2大樣本驗證篩選出的差異表達基因

基于前期高通量轉錄組深度測序的結果，根據(jù)pvalue的大小，我們選擇duox1基因進行驗證。

1、樣本收集

按照實施例1的方法收集肺腺癌組織及其對應的癌旁組織各45例。

2、在mrna水平上進行驗證

2.1提取組織rna

步驟同實施例1。

2.2逆轉錄

逆轉錄體系共20μl，包括細胞總rna2μg/2μl，50u/μlrnasin1μl，5×逆轉錄反應緩沖液4μl，10mmdntp2μl，50μg/ml隨機引物2μl(promega)，200u/μlm-mlv逆轉錄酶1μl，depc8μl。

37℃反應60分鐘，95℃5分鐘終止反應。cdna在-80℃保存或進行pcr擴增。

2.3pcr

反應體系按照realmastermix(sybrgreen)試劑盒(購自天根生化科技(北京)有限公司)配置，sybr反應體系共25μl，2.5×realmastermix10μl，20×sybrsolution1.25μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，去離子水10.75μl，cdna2μl。反應條件為94℃5min，94℃45s，60℃1min，30個循環(huán)，設空白對照。

pcr反應前10個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，調節(jié)基線至適宜處，各熒光曲線與基線交叉點的循環(huán)數(shù)即為ct值。根據(jù)δc(t)＝c(t)目的基因-c(t)β-actin，δδc(t)＝2^-δc(t)，計算目的基因與β-actin相對表達量。

pcr引物序列如下：

duox1基因：

5’-tgcttccagacttcagaa-3’(seqidno.1)；

5’-ccaacacacatacagacat-3’(seqidno.2)

β-actin：

5’-gtggggcgccccaggcacca-3’(seqidno.3)；

5’-ctccttaatgtcacgcacgattt-3’(seqidno.4)

結果顯示，與癌旁組織相比，肺腺癌組織中duox1基因的mrna相對表達量為0.21±0.012，表明肺腺癌組織中duox1基因的mrna水平明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。

3、在蛋白水平上進行驗證

3.1提取組織總蛋白

按照epiquik組織/細胞總蛋白提取試劑盒的說明書進行蛋白提取的操作。

3.2westernblot檢測

將提取的蛋白定量進行sds-page電泳，之后進行轉膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、顯色。

3.3統(tǒng)計學處理

將蛋白條帶的灰度值使用imagej軟件進行分析，以β-actin為內參，將duox1蛋白條帶的灰度值進行歸一化處理。結果數(shù)據(jù)都是以平均值±標準差的方式來表示，采用spss13.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗，認為當p<0.05時具有統(tǒng)計學意義。

3.4結果

結果顯示，與癌旁組織相比，肺腺癌組織中duox1蛋白的相對表達量為0.35±0.015，結果表明肺腺癌組織中duox1蛋白水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。

實施例3duox1基因過表達

1、質粒構建

根據(jù)duox1基因的編碼序列設計擴增引物，引物的設計為本領域技術人員所熟知。從成人胎腦的cdna文庫(clontech公司，貨號：638831)中擴增全長的duox1基因的編碼序列，上述cdna序列插入到真核細胞表達載體pcdna3.1中，連接獲得的重組載體pcdna3.1-duox1用于后續(xù)實驗。

2、肺腺癌細胞的培養(yǎng)與轉染

2.1細胞培養(yǎng)

將肺腺癌細胞株a549于rpmi1640培養(yǎng)基和10％胎牛血清中培養(yǎng)。

2.2細胞轉染

(1)轉染前一天將0.5-2*10⁵個腫瘤細胞懸浮于500μl不含抗生素的培養(yǎng)基，接種至24孔培養(yǎng)板。

(2)轉染當天細胞密度應達80％-90％，準備以下復合物a：將1μg質粒dna稀釋于無血清培養(yǎng)基中，輕輕混勻；復合物b：取4μllipofectamine2000稀釋于無血清培養(yǎng)基中，混勻。

(3)將復合物a和b混合，輕輕混勻，室溫孵育。

(4)將100μl脂質體復合體加入腫瘤細胞中，上下左右輕輕混勻，將細胞放入37℃含5％co2培養(yǎng)箱孵育5-7小時。

(5)加1ml含有2倍正常血清和抗生素濃度的生長培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)細胞18-24小時。

3、利用qpcr實驗檢測pcdna3.1-duox1的過表達情況

3.1提取細胞總rna利用常規(guī)方法進行操作。

3.2逆轉錄

步驟同實施例2。

3.3qpcr

步驟同實施例2。

3.4結果

結果如圖1所示，pcdna3.1-duox1能夠成功過表達，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。

3、westernblot實驗檢測pcdna3.1-duox1過表達情況

步驟同實施例2。

結果如圖2所示，與轉染pcdna3.1組相比，轉染pcdna3.1-duox1的細胞中duox1蛋白的含量明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。

實施例4duox1基因的表達對肺腺癌細胞增殖能力的測定

1、步驟：

將轉染24小時后的肺腺癌細胞a549接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔2*10³個細胞/孔/200μl，細胞分組如下：

實驗組1(對照組)：肺腺癌細胞轉染pcdna3.1；

實驗組2：肺腺癌細胞轉染pcdna3.1-duox1。

將細胞在37℃、5％co2培養(yǎng)箱再次孵育24小時后，根據(jù)brdu細胞增殖試劑盒(chemiconinternational)的說明書，測量細胞增殖速率。

2、統(tǒng)計學方法

實驗都是按照重復3次來完成的，結果數(shù)據(jù)都是以平均值±標準差的方式來表示，采用spss13.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗，認為當p<0.05時具有統(tǒng)計學意義。

3、結果

結果如圖3所示，相比于實驗組1，實驗組2的細胞增殖減緩，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。上述實驗結果表明，duox1表達可以抑制肺腺癌細胞增殖。

上述實施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應當指出，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也將落入本發(fā)明權利要求的保護范圍內。

sequencelisting

<110>河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院（河北省腫瘤醫(yī)院）

<120>duox1作為肺腺癌診治標志物的用途

<160>4

<170>patentinversion3.5

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<212>dna

<213>人工序列

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<212>dna

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<212>dna

<213>人工序列

<400>4

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