本發(fā)明屬于醫(yī)藥化工領域，具體涉及一種利用炭黑曲霉轉(zhuǎn)化黃芪甲苷制備6-o-葡萄糖-環(huán)黃芪醇的方法。
背景技術：
黃芪是一味傳統(tǒng)中藥，其藥用迄今已有2000多年的歷史，具有增強機體免疫功能、保肝、利尿、抗衰老、抗應激、降壓和較廣泛的抗菌作用；環(huán)黃芪醇類皂苷是黃芪中藥中的主要活性成分，屬于環(huán)阿爾廷烷四環(huán)三萜類皂苷，具有加強免疫力、增加能量、抵抗疲勞、保護肝臟、清除自由基和抑制破骨細胞的作用，有很高的藥用價值。
6-o-葡萄糖-環(huán)黃芪醇(cmg)屬于環(huán)黃芪醇類皂苷，其結(jié)構(gòu)由isaokitagawa于1983年首次報道，是通過橙皮苷酶水解黃芪甲苷得到。
中國已公開的專利申請中(中國專利申請公開號：cn1809364a)是以溫和酸水解黃芪甲苷得到6-o-葡萄糖-環(huán)黃芪醇，但是反應得到的cmg的收率很低，僅有21％。且酸法制備的副產(chǎn)物多，其結(jié)構(gòu)和大小與cmg類似，后期分離困難，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。天津醫(yī)科大學的夏廣萍等人利用β-葡萄糖苷酶水解黃芪甲苷的到6-o-葡萄糖-環(huán)黃芪醇，轉(zhuǎn)化率達到90％以上，但是相較于微生物轉(zhuǎn)化法，酶法制備的成本較高，且商品化的β-葡萄糖苷酶也并非黃芪甲苷特異性水解酶(夏廣萍,劉鵬,等.β-葡萄糖苷酶水解黃芪甲苷的研究[j].中草藥,2012,43(6):1112－1114.
6-o-葡萄糖-環(huán)黃芪醇(cmg)結(jié)構(gòu)
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于選擇采用一種微生物轉(zhuǎn)化的方法來轉(zhuǎn)化黃芪甲苷得到6-o-葡萄糖-環(huán)黃芪醇，克服現(xiàn)有6-o-葡萄糖-環(huán)黃芪醇制備技術中副產(chǎn)物多，轉(zhuǎn)化率效率低，成本高，污染環(huán)境等缺點。本發(fā)明根據(jù)現(xiàn)有技術的不足作出創(chuàng)新和改進，提供一種高效的生物法制備6-o-葡萄糖-環(huán)黃芪醇的方法。
為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，所采用的技術方案是：
a.種子液制備
將炭黑曲霉凍干粉經(jīng)試管斜面活化培養(yǎng)后轉(zhuǎn)移至pda平面培養(yǎng)基中，再向平面培養(yǎng)基中加入無菌水制成孢子濃度為6×108個/ml炭黑曲霉孢子懸浮液。
b.發(fā)酵轉(zhuǎn)化
將步驟a中的炭黑曲霉孢子懸浮液接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于搖床溫度為28～30℃、搖床轉(zhuǎn)速為180r/min的條件下培養(yǎng)6天，獲得發(fā)酵液。
c.分離純化
將步驟b中的發(fā)酵液經(jīng)由水飽和正丁醇萃取三次后真空濃縮蒸干得到萃取產(chǎn)品，進一步利用硅膠柱層析分離純化，最終通過乙醇重結(jié)晶將產(chǎn)品的純度提高到95％以上，得到6-o-葡萄糖-環(huán)黃芪醇產(chǎn)品。
上述步驟b中的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：底物黃芪甲苷的濃度為1mg/ml，黃芪粉濃度為2g/l，酵母粉濃度為10g/l，硫酸銨濃度為2g/l，kh2po4濃度為4g/l，mgso4·7h2o濃度為1g/l，吐溫80體積百分比為0.1％，初始ph值為4.5，接種量和發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為1:100。
上述步驟b中的黃芪粉為80目的黃芪粉，是直接將洗凈的黃芪根莖粉碎制成，在發(fā)酵過程中主要用來誘導炭黑曲霉產(chǎn)酶。
上述步驟b中的底物黃芪甲苷的質(zhì)量百分比是10％。
上述步驟c中的硅膠柱層析的填料為100～200目的硅膠粉。
上述步驟c中硅膠柱層析的洗脫劑為體積比例為26:13:4的甲醇-氯仿-水的下層溶液。
本發(fā)明的特點是利用微生物轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化黃芪甲苷制備6-o-葡萄糖-環(huán)黃芪醇。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明顯著的有益效果是：
炭黑曲霉轉(zhuǎn)化黃芪甲苷制備6-o-葡萄糖-環(huán)黃芪醇的過程中不會產(chǎn)生任何的副產(chǎn)物，提高了轉(zhuǎn)化效率。
與現(xiàn)有技術相比，炭黑曲霉轉(zhuǎn)化黃芪甲苷的轉(zhuǎn)化率高，底物黃芪甲苷幾乎全部轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物6-o-葡萄糖-環(huán)黃芪醇，且終產(chǎn)品的純度高，降低了生產(chǎn)成本。
與傳統(tǒng)化學法相比，微生物轉(zhuǎn)化法是一種清潔的生物法轉(zhuǎn)化，其制備條件溫和，能耗降低，制備過程中對環(huán)境的傷害大大降低，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
附圖說明
圖1是炭黑曲霉轉(zhuǎn)化路徑圖。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的描述，但這些實施例的目的并不在于限制本發(fā)明的保護范圍。
實施例1
取炭黑曲霉凍干粉置于含有pda培養(yǎng)基的試管斜面上活化培養(yǎng)，后再轉(zhuǎn)移至pda平面培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待炭黑曲霉完全長出孢子后向平面培養(yǎng)基中加入無菌水制成孢子濃度為6×108個/ml的炭黑曲霉孢子懸浮液，即為菌種發(fā)酵的種子液(所有操作均在超凈臺中無菌操作)。
發(fā)酵液體培養(yǎng)基配方：底物為10％質(zhì)量百分比的黃芪甲苷，濃度為1mg/ml，黃芪粉濃度為2g/l，酵母粉濃度為10g/l，硫酸銨濃度為2g/l，kh2po4濃度為4g/l，mgso4·7h2o濃度為1g/l，吐溫80體積百分比為0.1％，初始ph值為4.5。按照培養(yǎng)基的配方配制液體發(fā)酵培養(yǎng)基。
取1ml孢子濃度為6×108個/ml炭黑曲霉孢子懸浮液接種至含有100ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml的搖瓶中，并將搖瓶置于28℃的恒溫搖床中培養(yǎng)，調(diào)節(jié)搖床轉(zhuǎn)速為180r/min，在此條件下發(fā)酵培養(yǎng)6天。收集得到95ml的發(fā)酵液。
向發(fā)酵液中加入50ml水飽和正丁醇萃取，連續(xù)萃取三次后將得到萃取液經(jīng)真空濃縮蒸干得到粗產(chǎn)品0.16g。后用10ml的甲醇將粗產(chǎn)品完全溶解，取1ml溶液過0.22μm有機濾膜，于高效液相色譜-蒸發(fā)光檢測下測定，經(jīng)計算粗產(chǎn)品的純度為4.68％。
取上述純度的粗產(chǎn)品1g于硅膠柱層析分離純化，填料為100～200目的硅膠粉，采用干法上樣，洗脫劑為體積比例為26:13:4的甲醇-氯仿-水的下層溶液。收集其中含有產(chǎn)品的餾分并于液相檢測濃度，后將所有的餾分收集旋干并稱量干重，經(jīng)計算得到50.32mg純度為88.36％產(chǎn)品。
將硅膠柱層析后的產(chǎn)品通過乙醇重結(jié)晶后，最終將6-o-葡萄糖-環(huán)黃芪醇產(chǎn)品的純度提高到了95％以上。
實施例2
取炭黑曲霉凍干粉置于含有pda培養(yǎng)基的試管斜面上活化培養(yǎng)，后再轉(zhuǎn)移至pda平面培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待炭黑曲霉完全長出孢子后向平面培養(yǎng)基中加入無菌水制成孢子濃度為6×108個/ml的炭黑曲霉孢子懸浮液，即為菌種發(fā)酵的種子液(所有操作均在超凈臺中無菌操作)。
發(fā)酵液體培養(yǎng)基配方：底物為10％質(zhì)量百分比的黃芪甲苷，濃度為1mg/ml，黃芪粉濃度為2g/l，酵母粉濃度為10g/l，硫酸銨濃度為2g/l，kh2po4濃度為4g/l，mgso4·7h2o濃度為1g/l，吐溫80的體積百分比為0.1％，初始ph值為4.5。按照培養(yǎng)基的配方配制液體發(fā)酵培養(yǎng)基。
取1ml孢子濃度為6×108個/ml炭黑曲霉孢子懸浮液接種至含有100ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml的搖瓶中，并將搖瓶置于30℃的恒溫搖床中培養(yǎng)，調(diào)節(jié)搖床轉(zhuǎn)速為180r/min，在此條件下發(fā)酵培養(yǎng)6天。收集得到91ml的發(fā)酵液。
向發(fā)酵液中加入50ml水飽和正丁醇萃取，連續(xù)萃取三次后將得到萃取液經(jīng)真空濃縮蒸干得到粗產(chǎn)品0.157g。后用10ml的甲醇將粗產(chǎn)品完全溶解，取1ml溶液過0.22μm有機濾膜，于高效液相色譜-蒸發(fā)光檢測下測定，經(jīng)計算粗產(chǎn)品的純度為4.72％。
取上述純度的粗產(chǎn)品1g于硅膠柱層析分離純化，填料為100～200目的硅膠粉，采用干法上樣，洗脫劑為甲醇-氯仿-水的下層溶液，其比例為26:13:4。收集其中含有產(chǎn)品的餾分并于液相檢測濃度，后將所有的餾分收集旋干并稱量干重，經(jīng)計算得到52.86mg純度為87.36％產(chǎn)品。
將硅膠柱層析后的產(chǎn)品通過乙醇重結(jié)晶后，最終將6-o-葡萄糖-環(huán)黃芪醇產(chǎn)品的純度提高到了95％以上。
實施例3
取炭黑曲霉凍干粉置于含有pda培養(yǎng)基的試管斜面上活化培養(yǎng)，后再轉(zhuǎn)移至pda平面培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待炭黑曲霉完全長出孢子后向平面培養(yǎng)基中加入無菌水制成孢子濃度為6×108個/ml的炭黑曲霉孢子懸浮液，即為菌種發(fā)酵的種子液(所有操作均在超凈臺中無菌操作)。
發(fā)酵液體培養(yǎng)基配方：底物為10％質(zhì)量百分比的黃芪甲苷，濃度為1mg/ml，黃芪粉濃度為2g/l，酵母粉濃度為10g/l，硫酸銨濃度為2g/l，kh2po4濃度為4g/l，mgso4·7h2o濃度為1g/l，吐溫80體積百分比為0.1％，初始ph值為4.5。按照培養(yǎng)基的配方配制液體發(fā)酵培養(yǎng)基。
取10ml孢子濃度為6×108個/ml炭黑曲霉孢子懸浮液接種至含有1000ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基的2500ml的搖瓶中，并將搖瓶置于30℃的恒溫搖床中培養(yǎng)，調(diào)節(jié)搖床轉(zhuǎn)速為180r/min，在此條件下發(fā)酵培養(yǎng)6天。收集得到980ml的發(fā)酵液。
向發(fā)酵液中加入500ml水飽和正丁醇萃取，連續(xù)萃取三次后將得到萃取液經(jīng)真空濃縮蒸干得到粗產(chǎn)品1.82g。取0.2g的粗產(chǎn)品于10ml的甲醇中充分溶解，取1ml溶液過0.22μm有機濾膜，于高效液相色譜-蒸發(fā)光檢測下測定，經(jīng)計算粗產(chǎn)品的純度為4.12％。
取上述純度的粗產(chǎn)品10g于硅膠柱層析分離純化，采用干法上樣，洗脫劑為甲醇-氯仿-水的下層溶液，其比例為26:13:4。收集其中含有產(chǎn)品的餾分并于液相檢測濃度，后將所有的餾分收集旋干并稱量干重，經(jīng)計算得到464.5mg純度為84.26％產(chǎn)品。
后將硅膠柱層析后的產(chǎn)品通過乙醇重結(jié)晶后，最終將6-o-葡萄糖-環(huán)黃芪醇產(chǎn)品的純度提高到了95％以上。