本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)白木香愈傷細(xì)胞產(chǎn)生2-(2-苯乙基)色酮化合物的方法，一種誘導(dǎo)白木香愈傷細(xì)胞產(chǎn)生2-(2-苯乙基)色酮化合物生產(chǎn)培養(yǎng)基，以及一種白木香愈傷細(xì)胞繼代培養(yǎng)基。

背景技術(shù)：

白木香(aquilariasinensis)別名土沉香，為瑞香科沉香屬植物，主要分布于我國的海南、廣東、云南、福建、廣西和臺灣等省，是一種珍貴的藥用植物。白木香以其含有樹脂的木材入藥，因系木的心材、體重、置水中則沉、氣香，故名沉香。沉香是我國、日本、印度、中東及東南亞國家的傳統(tǒng)名貴藥材和名貴的天然香料。沉香具有行氣鎮(zhèn)痛、溫中止嘔、納氣平喘等功效，對于胸腹脹悶疼痛、胃寒嘔吐、腎虛氣逆喘急有顯著療效。臨床實驗證明，沉香是胃癌的特效藥和很好的鎮(zhèn)痛藥。沉香臨床應(yīng)用廣泛，具有消化系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)等藥理作用。

健康的白木香植物并不產(chǎn)生沉香，只有通過自然因素(雷劈、火燒、蟲蛀等)或者人為因素(砍傷、打洞、接菌等)的作用，沉香才會在白木香植物中逐漸形成。但由于天然沉香形成緩慢，資源匱乏，因而極其珍貴。加上沉香香味獨特，為名貴香料，因而市場上供不應(yīng)求。我國的藥用沉香主要依賴進(jìn)口，價格昂貴(目前特級沉香奇楠香的價格達(dá)到數(shù)萬元/克)。由于沉香價值高，而且國際市場需求極大,長期以來沉香屬(aquilaria)物種遭到掠奪式砍伐，其原始林已經(jīng)破壞殆盡，被列入《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》(cites)附錄ⅱ和我國二級保護(hù)植物。為了促使產(chǎn)香植物能夠快速結(jié)香，人們采用了多種人工結(jié)香方法，如砍傷、打洞、通體結(jié)香等，但其結(jié)香效率仍然有待提高，目前方法生產(chǎn)的沉香遠(yuǎn)遠(yuǎn)無法滿足市場需要。因此，從分子水平闡明沉香形成的分子機制，建立有針對性的快速高效的結(jié)香技術(shù)，才能生產(chǎn)高質(zhì)量、高產(chǎn)率的沉香，根本上解決沉香的資源問題。2-(2-苯乙基)色酮化合物是沉香的主要化學(xué)成分和特征性成分，具有抗炎、神經(jīng)保護(hù)等多種藥理活性，也是沉香產(chǎn)生獨特香氣的主要化學(xué)成分。目前自然界中發(fā)現(xiàn)的2-(2-苯乙基)色酮化合物有一百余個，絕大部分是從沉香中分離得到。2015年《中華人民共和國藥典》中沉香的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，也明確以2-(2-苯乙基)色酮類成分作為評價沉香真?zhèn)蝺?yōu)劣的指標(biāo)。由于只有在受到外界刺激后，白木香才能夠形成沉香，并產(chǎn)生2-(2-苯乙基)色酮化合物，因此，揭示2-苯乙基色酮化合物的生物合成途徑和調(diào)控機制對白木香結(jié)香機理的研究具有重大意義，其中關(guān)于2-苯乙基色酮類物質(zhì)的生物合成和調(diào)控機制的研究至關(guān)重要。

然而，在自然條件下和人工條件下的形成周期比較長，而研究2-苯乙基色酮合成機制及調(diào)控機制需要不斷的提供新鮮材料，難以滿足白木香結(jié)香機制的研究需求。愈傷組織和懸浮細(xì)胞能夠為白木香機制研究提供源源不斷的新鮮材料，利用不同的誘導(dǎo)方法能夠產(chǎn)生2-苯乙基色酮類物質(zhì)，因此構(gòu)建穩(wěn)定高效的產(chǎn)生2-苯乙基色酮化合物的愈傷組織體系和懸浮細(xì)胞體系對其機理研究尤為重要。

關(guān)于采用白木香的愈傷組織和懸浮細(xì)胞能夠快速產(chǎn)生結(jié)香物質(zhì)-2苯乙基色酮的研究并不多見。cn104593443a公開了一種沉香色酮類成分的制備方法，利用未結(jié)香的白木香木屑，通過內(nèi)生真菌b.rhodinaa13的接種、固體發(fā)酵即可獲得含沉香特征成分——5個2-(2-苯乙基)色酮化合物的沉香藥材。再如，在白木香的懸浮細(xì)胞或者愈傷組織中添加黃綠墨耳真菌的粗提物誘導(dǎo)，鑒定出4個2-苯乙基色酮化合物。該方法由于黃綠墨耳真菌提取物的成分難以確定，因此，可控性不足，不利于2-(2-苯乙基)色酮化合物的生物合成調(diào)控機理研究。又如，文獻(xiàn)報道在白木香的懸浮細(xì)胞及愈傷組織中加入信號分子水楊酸及茉莉酸甲酯，成功地誘導(dǎo)生成少量2-(2-苯乙基)色酮化合物，而白木香愈傷組織和懸浮細(xì)胞或懸浮細(xì)胞本身就是一種逆境脅迫狀態(tài)下生長的細(xì)胞，不經(jīng)誘導(dǎo)也會產(chǎn)生少量的2-(2-苯乙基)色酮化合物，而茉莉酸甲酯，水楊酸等激素誘導(dǎo)產(chǎn)生的2-苯乙基色酮與未經(jīng)誘導(dǎo)的愈傷組織和懸浮細(xì)胞中的2-苯乙基色酮種類和產(chǎn)量很相似，因此，對于誘導(dǎo)效果的判斷有很大的干擾，不利于研究該類成分的生物合成機制，進(jìn)而難以滿足白木香結(jié)香機制的研究需要。

因此，需要一種能夠有效誘導(dǎo)白木香愈傷細(xì)胞產(chǎn)生2-(2-苯乙基)色酮化合物的方法，為闡明該類成分生物合成機制奠定基礎(chǔ)，為闡明沉香形成的分子機制，進(jìn)而為大規(guī)模、產(chǎn)業(yè)化人工生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)沉香提供基礎(chǔ)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了有效誘導(dǎo)白木香愈傷細(xì)胞產(chǎn)生2-(2-苯乙基)色酮化合物，發(fā)明人針對多種作用機制的多種物質(zhì)對白木香愈傷細(xì)胞的誘導(dǎo)作用進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加適當(dāng)濃度的氯化鈉，能夠使白木香愈傷細(xì)胞中2-(2-苯乙基)色酮化合物的種類和產(chǎn)量明顯提高。培養(yǎng)基中添加的氯化鈉的濃度是影響2-(2-苯乙基)色酮的產(chǎn)生的重要因素，nacl的濃度太高或者太低都對2-(2-苯乙基)色酮化合物的產(chǎn)生有不利的影響。發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加氯化鈉的基礎(chǔ)上，再添加活性氧抑制劑，不僅能夠進(jìn)一步提高2-(2-苯乙基)色酮化合物的產(chǎn)量，同時能夠更好地保持細(xì)胞活性。

因此，本發(fā)明的目的在于提供一種誘導(dǎo)白木香愈傷細(xì)胞產(chǎn)生2-(2-苯乙基)色酮化合物的方法，通過該方法，白木香愈傷細(xì)胞能夠產(chǎn)生更多種類和更高產(chǎn)量的2-(2-苯乙基)色酮化合物。

本發(fā)明的另一目的是提供一種適合白木香愈傷細(xì)胞繼代培養(yǎng)的繼代培養(yǎng)基。

本發(fā)明的再一目的是提供一種誘導(dǎo)白木香愈傷細(xì)胞產(chǎn)生2-(2-苯乙基)色酮化合物的生產(chǎn)培養(yǎng)基。

本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的。

一種誘導(dǎo)白木香愈傷細(xì)胞產(chǎn)生2-(2-苯乙基)色酮化合物的方法，將白木香愈傷細(xì)胞接種于生產(chǎn)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)；以所述生產(chǎn)培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，所述生產(chǎn)培養(yǎng)基含有75mm～300mm的氯化鈉。

根據(jù)本發(fā)明的方法，優(yōu)選地，以所述生產(chǎn)培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，所述生產(chǎn)培養(yǎng)基還含有如下組分：3.5～7.0g/l的ms鹽、5～15mg/l的kh2po4、80～120mg/l的肌醇、0.5～2mg/l的萘乙酸，0.5～2.0mg/l的6-芐氨基嘌呤、0.5～2.0mg/l的2,4-二氯苯氧乙酸、0.5～2.0mg/l的6-糠氨基嘌呤、0.5～2mg/l的維生素b5和20～40g/l的蔗糖。

根據(jù)本發(fā)明的方法，優(yōu)選地，所述生產(chǎn)培養(yǎng)基中進(jìn)一步含有活性氧抑制劑，所述活性氧抑制劑選自二苯基氯化碘鹽、過氧化氫酶、二甲基硫脲中的至少一種。

根據(jù)本發(fā)明的方法，優(yōu)選地，所述活性氧抑制劑為二苯基氯化碘鹽；以所述生產(chǎn)培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，二苯基氯化碘鹽的添加量為10μm～100μm。

根據(jù)本發(fā)明的方法，優(yōu)選地，所述白木香愈傷細(xì)胞是通過在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)白木香材料得到的，所述白木香材料選自白木香的新鮮的莖或葉，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為含有0.5～2.0mg/l的萘乙酸和0.5～2.0mg/l的6-芐氨基嘌呤的ms培養(yǎng)基。

根據(jù)本發(fā)明的方法，優(yōu)選地，所述白木香愈傷細(xì)胞是通過在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)白木香材料、并將誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷細(xì)胞接種于繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)得到的；所述白木香材料選自白木香的新鮮的莖或葉，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為含有0.5～2.0mg/l的萘乙酸和0.5～2.0mg/l的6-芐氨基嘌呤的ms培養(yǎng)基。

根據(jù)本發(fā)明的方法，優(yōu)選地，以繼代培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，所述繼代培養(yǎng)基含有如下組分：3.5～7.0g/l的ms鹽、5～15mg/l的kh2po4、80～120mg/l的肌醇、0.5～2mg/l的萘乙酸，0.5～2.0mg/l的6-芐氨基嘌呤、0.5～2.0mg/l的2,4-二氯苯氧乙酸、0.5～2.0mg/l的6-糠氨基嘌呤、0.5～2mg/l的維生素b5和20～40g/l的蔗糖。

本發(fā)明還提供一種白木香愈傷細(xì)胞繼代培養(yǎng)基，所述繼代培養(yǎng)基含有如下組分：ms鹽3.5～7.0g/l、kh2po45～15mg/l、肌醇80～120mg/l、萘乙酸0.5～2mg/l，6-芐氨基嘌呤0.5～2.0mg/l、2,4-二氯苯氧乙酸0.5～2.0mg/l、6-糠氨基嘌呤0.5～2.0mg/l、維生素b50.5～2mg/l、蔗糖20～40g/l。

本發(fā)明還提供一種誘導(dǎo)白木香愈傷細(xì)胞產(chǎn)生2-(2-苯乙基)色酮化合物的生產(chǎn)培養(yǎng)基，所述生產(chǎn)培養(yǎng)基含有如下組分：ms鹽3.5～7.0g/l、kh2po45～15mg/l、肌醇80～120mg/l、萘乙酸0.5～2mg/l，6-芐氨基嘌呤0.5～2.0mg/l、2,4-二氯苯氧乙酸0.5～2.0mg/l、6-糠氨基嘌呤0.5～2.0mg/l、維生素b50.5～2mg/l、蔗糖20～40g/l、氯化鈉75mm～300mm，可選地，所述生產(chǎn)培養(yǎng)基進(jìn)一步包含活性氧抑制劑。所述活性氧抑制劑選自二苯基氯化碘鹽、過氧化氫酶(cat)、二甲基硫脲(dmtu)中的一種或幾種。優(yōu)選地，所述活性氧抑制劑為二苯基氯化碘，添加量為10μm～100μm，更優(yōu)選為10μm～45μm。

采用本發(fā)明的方法，添加氯化鈉這樣簡單的化合物來控制白木香愈傷細(xì)胞產(chǎn)生2-(2-苯乙基)色酮化合物，方法簡便、可控，且產(chǎn)生的2-(2-苯乙基)色酮類種類更多，產(chǎn)量更大。這對于研究該類成分的生物合成途徑和調(diào)控機制、進(jìn)而研究沉香的結(jié)香機制提供了十分有利的工具。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實施方式，通過在含有氯化鈉的培養(yǎng)基中添加活性氧抑制劑，進(jìn)一步增加了2-(2-苯乙基)色酮化合物的產(chǎn)量，同時有效地降低了誘導(dǎo)方法所產(chǎn)生的脅迫對于白木香細(xì)胞的傷害，對于2-(2-苯乙基)色酮化合物的人工合成具有重要意義。

附圖說明

圖1為實施例3中不同濃度nacl誘導(dǎo)白木香愈傷組織產(chǎn)生2-(2-苯乙基)色酮化合物的基峰圖。

圖2為實施例3中不同濃度nacl誘導(dǎo)白木香愈傷組織產(chǎn)生ah6，ah8的定量分析。

圖3為實施例4中添加dpi前后產(chǎn)生2-(2-苯乙基)色酮變化的hplc圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于此。

本發(fā)明中，所述白木香的原植物為aquilariasinensis(lour.)gilg。

本發(fā)明中，mm表示mmol/l，即毫摩爾/升。

本發(fā)明中，所述“2-(2-苯乙基)色酮”，或者“2-(2-苯乙基)色酮化合物”是指具有如下式ⅰ、式ⅱ或式ⅲ母體結(jié)構(gòu)的化合物：

式中，r1和r2均表示苯環(huán)上任意取代的基團(tuán)，r1和r2各自獨立地選自烷基、烷氧基、羥基、鹵素，優(yōu)選為c1-c6的烷基、c1-c6的烷氧基或羥基。本發(fā)明所述的2-(2-苯乙基)色酮化合物的實例包括但不限于5,8-二羥基-2-(2-對甲氧基苯乙基)色酮，6,7-二甲氧基-2-(2-對甲氧基苯乙基)色酮，5,8-二羥基-2-(2-苯乙基)色酮，6-羥基-7-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮，6,7-二甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮，(5s,6r,7s,8r)-2-(2-苯乙基)-5e′,6e,7e,8e′-四羥基-5,6,7,8-四羥基色酮，6-羥基-2-(2-苯乙基)色酮和4'-羥基-2-(2-苯乙基)色酮等。

本發(fā)明中，naa表示萘乙酸；6-ba表示6-芐氨基嘌呤；kt表示6-糠氨基嘌呤，又稱激動素；2,4-d表示2,4-二氯苯氧乙酸；vb5表示維生素b5；dpi表示二苯基氯化碘鹽；cat表示過氧化氫酶；dmtu表示二甲基硫脲；ttc表示2,3,5-三苯基氯化四氮唑。為了表述方便，本申請中部分采用了簡寫形式。

本發(fā)明的生產(chǎn)2-(2-苯乙基)色酮化合物的方法，包括如下步驟：將白木香愈傷細(xì)胞置于生產(chǎn)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)；從生產(chǎn)培養(yǎng)基獲得的愈傷細(xì)胞中提取2-(2-苯乙基)色酮化合物。可選地，該方法還包括構(gòu)建愈傷體系的方法，構(gòu)建方法包括將誘導(dǎo)愈傷的步驟，可選地，和愈傷繼代培養(yǎng)步驟，得到白木香愈傷細(xì)胞。

<白木香愈傷組織的誘導(dǎo)>

將白木香外植體材料接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織。所述白木香外植體材料可以采用白木香的新鮮的根、莖段、葉片、子葉、胚軸等。所述白木香的新鮮的根、莖段或葉片可以采集自白木香植物，也可以由白木香種子在無菌培養(yǎng)得到的實生苗獲得。根據(jù)本發(fā)明的一種實施方式，所述白木香外植體材料采用白木香種子在無菌培養(yǎng)得到的實生苗獲得。根據(jù)本發(fā)明一種優(yōu)選的實施方式，所述外植體材料采用莖段或葉片，更優(yōu)選為葉片。

本發(fā)明可以采用已知的能夠誘導(dǎo)白木香愈傷組織產(chǎn)生的培養(yǎng)基來誘導(dǎo)白木香材料產(chǎn)生愈傷組織。根據(jù)本發(fā)明一種優(yōu)選的實施方式，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為含有naa0.2～2.0mg/l、6-ba0.2～2.0mg/l的ms培養(yǎng)基。優(yōu)選地，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為含有naa0.2～1.5mg/l、6-ba0.5～1.2mg/l的ms培養(yǎng)基；更優(yōu)選地，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為含有naa0.2～0.8mg/l、6-ba0.8～1.2mg/l的ms培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明一種特別優(yōu)選的實施方式，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為含有naa0.5mg/l、6-ba1.0mg/l的ms培養(yǎng)基。需要說明的是，上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，除了naa和6-ba，可以另外含有或者不含有另外的植物激素。根據(jù)本發(fā)明的一種實施方式，上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，除了naa和6-ba，不含有另外的植物激素。采用本發(fā)明的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，能夠容易地誘導(dǎo)得到健康的白木香愈傷組織，得到的白木香愈傷組織更容易存活和繼代培養(yǎng)。上述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用固體培養(yǎng)基，即在上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方基礎(chǔ)上添加瓊脂或其他種類固化劑制成，固化劑的用量采用常規(guī)用量即可。上述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中還含有蔗糖，含量為20～40mg/l，優(yōu)選為25～35mg/l。

根據(jù)本發(fā)明的方法，所述愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)溫度為23～28℃，優(yōu)選為24～26℃；誘導(dǎo)時間為20～40天，優(yōu)選為25～35天，更優(yōu)選為27～33天。

<白木香愈傷組織繼代培養(yǎng)>

通過誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)得到的白木香愈傷組織可以直接接種至生產(chǎn)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)產(chǎn)生2-(2-苯乙基)色酮化合物；也可以接種于繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行多次繼代培養(yǎng)后，獲得更穩(wěn)定的白木香愈傷細(xì)胞再接種于生產(chǎn)培養(yǎng)基中，用以培養(yǎng)得到2-(2-苯乙基)色酮化合物。優(yōu)選地，將誘導(dǎo)得到的白木香愈傷組織進(jìn)行多次繼代培養(yǎng)后，再接種于生產(chǎn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所述繼代培養(yǎng)基可以是已知的白木香愈傷繼代培養(yǎng)基。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有的白木香愈傷繼代培養(yǎng)基多是在ms基礎(chǔ)培養(yǎng)基上添加不同種類和含量的植物激素，雖然能夠使愈傷細(xì)胞存活和生長，但細(xì)胞生長速度較慢，且愈傷組織形態(tài)大多較為緊密，同時容易褐化，不利于細(xì)胞懸浮培養(yǎng)。通過大量實驗篩選發(fā)現(xiàn)，采用本發(fā)明的繼代培養(yǎng)基能夠使愈傷組織生長旺盛，且愈傷組織形態(tài)松散，不褐化，十分適合懸浮培養(yǎng)，效果顯著優(yōu)于目前文獻(xiàn)中報道的白木香愈傷組織繼代培養(yǎng)基。本發(fā)明優(yōu)選的繼代培養(yǎng)基，含有ms鹽3.5～7.0g/l、kh2po45～15mg/l、肌醇80～120mg/l、naa0.5～2mg/l，6-ba0.5～2.0mg/l、2,4-d0.5～2.0mg/l、kt0.5～2.0mg/l、vb50.5～2mg/l、蔗糖20～40g/l。優(yōu)選地，所述繼代培養(yǎng)基含有如下組分：ms鹽4.0g～6.3g/l、kh2po48～12mg/l、肌醇90～110mg/l、naa0.5～2mg/l，6-ba0.5～1.0mg/l、2,4-d0.5～2.0mg/l、kt0.5～2.0mg/l、vb50.5～2mg/l、蔗糖25～35g/l。根據(jù)本發(fā)明的方法一種特別優(yōu)選的實施方式，所述繼代培養(yǎng)基含有如下組分：ms鹽4.3g/l、kh2po410mg/l、肌醇100mg/l、naa2mg/l、6-ba1mg/l、2,4-d1mg/l、kt1mg/l、vb51mg/l、蔗糖30g/l。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實施方式，本發(fā)明的繼代培養(yǎng)基由上述組分配制而成，而不含有其他植物激素和其他大量、微量組分。

所述繼代培養(yǎng)基優(yōu)選采用固體培養(yǎng)基，也可以直接采用液體培養(yǎng)基。本發(fā)明中，采用上述繼代培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)2次以上，更優(yōu)選為繼代培養(yǎng)5代以上，以使得愈傷細(xì)胞形態(tài)趨于穩(wěn)定。

上述愈傷組織繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為25～28℃，培養(yǎng)周期為20～40天，優(yōu)選為25～35天，更優(yōu)選為28～32天，再優(yōu)選為30天。當(dāng)采用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)時，轉(zhuǎn)速180～220rpm。

<培養(yǎng)基中添加氯化鈉產(chǎn)生2-(2-苯乙基)色酮化合物>

將誘導(dǎo)產(chǎn)生或再經(jīng)繼代培養(yǎng)得到的白木香愈傷細(xì)胞接種于生產(chǎn)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)產(chǎn)生2-(2-苯乙基)色酮化合物。所述生產(chǎn)培養(yǎng)基可以是在已知的白木香愈傷繼代培養(yǎng)基或本發(fā)明的上述白木香愈傷繼代培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，額外添加一定濃度的氯化鈉。

所述生產(chǎn)培養(yǎng)基可以采用固體或液體培養(yǎng)基的方式。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實施方式，所述生產(chǎn)培養(yǎng)基采用液體培養(yǎng)基對白木香愈傷細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。

發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在本發(fā)明的繼代培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加氯化鈉后，愈傷組織能夠產(chǎn)生可觀的2-(2-苯乙基)色酮化合物，同時愈傷細(xì)胞的形態(tài)、細(xì)胞活性和生長量仍然保持了較好的水平且較為穩(wěn)定。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，氯化鈉的濃度對于白木香愈傷細(xì)胞產(chǎn)生2-(2-苯乙基)色酮化合物是至關(guān)重要的，濃度過低或過高都不適合2-(2-苯乙基)色酮化合物的產(chǎn)生。當(dāng)采用氯化鈉濃度為75mm～300mm時，白木香愈傷細(xì)胞能夠有效產(chǎn)生2-(2-苯乙基)色酮化合物。而當(dāng)氯化鈉濃度約在75mm～225mm之間，更優(yōu)選在100mm～200mm之間，最優(yōu)選為120mm～170mm之間，則更有利于2-(2-苯乙基)色酮化合物的生成。根據(jù)本發(fā)明一種特別優(yōu)選的實施方式，當(dāng)氯化鈉濃度約為150mm時，2-(2-苯乙基)色酮化合物的含量最高。

上述添加氯化鈉生產(chǎn)白木香愈傷細(xì)胞的培養(yǎng)溫度為25～28℃；培養(yǎng)周期為10～60天，優(yōu)選為20～50天，更優(yōu)選為25～40天。當(dāng)采用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)時，轉(zhuǎn)速180～220rpm。

采用本發(fā)明的含有氯化鈉的生產(chǎn)培養(yǎng)基時，與背景技術(shù)中提到的現(xiàn)有文獻(xiàn)的誘導(dǎo)方法相比，白木香愈傷細(xì)胞產(chǎn)生的2-(2-苯乙基)色酮的種類更多。

<培養(yǎng)基中添加氯化鈉和活性氧抑制劑產(chǎn)生2-(2-苯乙基)色酮化合物>

經(jīng)過進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在添加有氯化鈉的生產(chǎn)培養(yǎng)基上培養(yǎng)白木香愈傷細(xì)胞時，有活性氧的產(chǎn)生，而在添加有氯化鈉的生產(chǎn)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，再添加一定量的活性氧抑制劑，能夠獲得更高含量的2-(2-苯乙基)色酮化合物，且愈傷細(xì)胞具有良好的細(xì)胞活性。所述活性氧抑制劑例如為二苯基氯化碘鹽(dpi，英文名稱diphenyleneiodoniumchloride)、過氧化氫酶(cat)、二甲基硫脲(dmtu)等。根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選的實施方式，所述活性氧抑制劑采用二苯基氯化碘鹽，其有效添加量在10μm～100μm，優(yōu)選為10μm～45μm，更優(yōu)選為15μm～40μm，最優(yōu)選為22μm～28μm。本發(fā)明中，相比于只添加氯化鈉的生產(chǎn)培養(yǎng)基，在同時添加有氯化鈉和活性氧抑制劑的生產(chǎn)培養(yǎng)基上培養(yǎng)白木香愈傷細(xì)胞時，2-(2-苯乙基)色酮的種類和產(chǎn)量有了相當(dāng)顯著地增加；同時，白木香愈傷細(xì)胞活性更高，可見活性氧抑制劑的添加有效地保護(hù)了白木香愈傷細(xì)胞活性。

上述添加氯化鈉和dpi培養(yǎng)白木香愈傷細(xì)胞的培養(yǎng)溫度為25～28℃，培養(yǎng)周期為120～240小時。優(yōu)選地，采用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)對白木香愈傷細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速180～220rpm。

[白木香愈傷細(xì)胞的細(xì)胞活力測定和2-(2-苯乙基)色酮化合物的檢測]

可采用常規(guī)方法測定白木香愈傷細(xì)胞的相對細(xì)胞活力，例如采用高分辨液質(zhì)聯(lián)用法檢測白木香愈傷細(xì)胞中的2-(2-苯乙基)色酮化合物。

以下實施例和對比例中，原料說明如下：

本發(fā)明中，所述ms鹽可以來自市售或配制。本發(fā)明實施例中采用的ms鹽為sigma公司生產(chǎn)的m5524。

本發(fā)明中，所述的ms培養(yǎng)基具有本領(lǐng)域公知的含義，可按照公知的方法配制。例如可參考如下文獻(xiàn)配制：murashige,t.,skoog,f.(1962)arevisedmediumforrapidgrowthandbioassayswithtobaccotissueculture.physiol.plant.15,473–497。一種具體的配制方法是：首先配制ms大量元素母液、ms微量元素母液(200×)、ms有機母液(200×)、fe鹽母液(200×)；然后按照表1的配方，以雙蒸水定容至預(yù)定體積，得到ms培養(yǎng)基。

所述母液配制方法如下：

ms大量元素母液(20×)：

kno3：38g/l；nh4no3:33g/l；cacl2·2h2o:8.8g/l；mgso4·2h2o:7.4g/l；kh2po4:3.4g/l；mgso4·2h2o需要單獨溶解，稀釋后再與其它大量元素混合，存于4℃冰箱。

ms微量元素母液(200×)：

ki:0.166g/l；h3bo3:1.24g/l；mnso4·4h2o:4.46g/l；znso4·7h2o:1.72g/l；na2moo4·2h2o:0.05g/l；cuso4·5h2o:0.005g/l；cocl2·6h2o:0.005g/l；mnso4·4h2o需要先用少量1mol/l溶解，然后與其它微量元素溶液混合，存于4℃冰箱。

ms有機母液(200×)：

肌醇：20g/l；鹽酸：0.1g/l；鹽酸吡哆醇(vb6)：0.1g/l；鹽酸硫胺素(vb1)：0.02g/l；甘氨酸：0.4g/l存于4℃冰箱。

fe鹽母液(200×)：

feso4·7h2o:5.56g/l，na2edta·2h2o:7.46g/l(edta:6.74g/l)，先溶于500ml雙蒸水，加熱，調(diào)ph至5.5，定容至1l。錫箔紙包裹，避光，存于4℃冰箱。

表1ms基本培養(yǎng)基配方

以下實施例和對比例中，白木香愈傷細(xì)胞的相對細(xì)胞活力的測定方法為：

稱取0.45g接種繼代后的愈傷組織細(xì)胞，置于3ml的0.04wt％ttc溶液中，室溫下暗反應(yīng)18h后，用3ml蒸餾水漂洗細(xì)胞以洗凈表面殘留的ttc。用5ml的95vt％的乙醇提取已經(jīng)還原的ttc(紅色)，以酶標(biāo)儀測定480nm處的光吸收值。以繼代0小時的細(xì)胞為對照細(xì)胞，活力設(shè)為100％，計算白木香愈傷細(xì)胞的相對細(xì)胞活力。

以下實施例和對比例中，白木香愈傷組織中2-(2-苯乙基)色酮化合物的檢測方法為：

1.樣品的制備方法：

稱取去除表面培養(yǎng)基的500mg干燥愈傷，以3ml甲醇超聲提取，過濾，即得。

2.液相色譜測試：

色譜柱；美國安捷倫公司的色譜柱(agilenteclipsexdbc18，250×4.6mm，i.d.5μm)，流速1.0ml/min，檢測波長為dad檢測器全波長掃描，洗脫系統(tǒng)采用乙腈-0.1％甲酸水梯度洗脫：0～20min，10～20％乙腈；20～35min，20～25％乙腈，35～55min，25～35％乙腈，55～70min；35～38％乙腈，70～90min，38～50％乙腈，90～105min，50～70％乙腈，105～120min，70％乙腈，120～130min，70～90％乙腈(乙腈為體積百分比)。

3.質(zhì)譜測試：

正離子模式；霧化氣體為n2，流速1.5ml/min；干燥氣體為n2，壓力100mpa；檢測器電壓1.40kv；曲線脫溶劑管(cdl)壓力為正常模式；cdl溫度為200℃；加熱器溫度200℃；接口電壓1.4kv；離子阱真空度(itvacuum，1.9×10^-2pa)；高純氬氣(ar)作為冷卻氣體和碰撞誘導(dǎo)解離的碰撞氣體。質(zhì)譜設(shè)為自動多級ms¹、ms²和ms³全掃描模式；離子累積時間為100ms；cid碰撞能量設(shè)為50％；數(shù)據(jù)處理用lcsolutionversion1.1軟件(shimadzu)；分子式預(yù)測誤差均在±5ppm之內(nèi)。

實施例1

分別采用白木香的新鮮莖段、葉片作為外植體材料，接種至如下誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于26℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)28天，誘導(dǎo)產(chǎn)生白木香愈傷組織。采用的誘導(dǎo)培養(yǎng)基分別為：

①ms+naa0.5mg/l+6-ba1.0mg/l；

②ms+naa0.2mg/l+6-ba1.2mg/l；

③ms+naa0.5mg/l+6-ba1.5mg/l；

④ms+naa0.8mg/l+6-ba1.5mg/l。

試驗結(jié)果表明，上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基均誘導(dǎo)得到了白木香愈傷細(xì)胞，誘導(dǎo)率均在85％以上，其中誘導(dǎo)培養(yǎng)基①的誘導(dǎo)率和愈傷組織的生長狀態(tài)最佳。

實施例2

將實施例1誘導(dǎo)培養(yǎng)基①得到的愈傷細(xì)胞接種至固體繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，采用的繼代培養(yǎng)基分別為：

1)ms鹽4.3g/l、kh2po410mg/l、肌醇100mg/l、naa2mg/l、6-ba1mg/l、2,4-d1mg/l、kt1mg/l、vb51mg/l、蔗糖30g/l；

2)ms鹽3.5g/l、kh2po415mg/l、肌醇120mg/l、naa0.5mg/l，6-ba1.0mg/、2,4-d1.5mg/l、kt0.5mg/l、vb51.5mg/l、蔗糖20g/l；

3)ms鹽7.0g/l、kh2po45mg/l、肌醇80mg/l、naa1mg/l，6-ba0.5mg/、2,4-d0.5mg/l、kt2.0mg/l、vb52mg/l、蔗糖40g/l；

4)ms鹽6.3g/l、kh2po48mg/l、肌醇105mg/l、naa2mg/l，6-ba0.8mg/、2,4-d1.2mg/l、kt1.0mg/l、vb51.5mg/l、蔗糖35g/l。

對比誘導(dǎo)培養(yǎng)基:

文獻(xiàn)《白木香愈傷組織的誘導(dǎo)及培養(yǎng)》(董閃等，湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，53(15)，3673-3677)中的c2、d3培養(yǎng)基：

c2：ms+6-ba1.0mg/l+naa0.2mg/l；

d3：ms+6-ba1.0mg/l+2,4-d2.0mg/l；

上述繼代培養(yǎng)的溫度為26℃，繼代培養(yǎng)周期為28天。結(jié)果顯示，采用本發(fā)明的繼代培養(yǎng)基1)-4)培養(yǎng)的白木香愈傷組織生長旺盛，生長量大，顏色呈黃綠色，質(zhì)地疏松，易分散，無褐化現(xiàn)象產(chǎn)生；其中繼代培養(yǎng)基1)中白木香愈傷組織生長量最大。c2、d3培養(yǎng)基誘導(dǎo)出的白木香愈傷細(xì)胞生長量則明顯低于本發(fā)明的培養(yǎng)基1)-4)。

實施例3

將實施例2繼代培養(yǎng)基①得到的白木香愈傷組織接種于液體生產(chǎn)培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)產(chǎn)生2-(2-苯乙基)色酮化合物。采用的生產(chǎn)培養(yǎng)基為：ms鹽4.3g/l、kh2po410mg/l、肌醇100mg/l、naa2mg/l、6-ba1mg/l、2,4-d1mg/l、kt1mg/l、vb51mg/l、蔗糖30g/l，額外添加35～450mm的氯化鈉。培養(yǎng)溫度為26℃，培養(yǎng)30天后，采用高分辨液質(zhì)聯(lián)用法檢測愈傷細(xì)胞中2-(2-苯乙基)色酮化合物，不同濃度nacl誘導(dǎo)白木香愈傷組織產(chǎn)生2-(2-苯乙基)色酮的基峰圖見圖1。

以最穩(wěn)定出現(xiàn)且含量相對較高的兩個2-(2-苯乙基)色酮化合物ah6、ah8作為定量對象，其結(jié)構(gòu)是通過高分辨質(zhì)譜推測分子式，二級質(zhì)譜碎片與2-(2-苯乙基)色酮裂解規(guī)律比較，以及標(biāo)準(zhǔn)品對照而明確地鑒定出來的，定量結(jié)果見圖2。ah6、ah8的結(jié)構(gòu)如下：

采用150mmnacl誘導(dǎo)白木香愈傷組織30天后，利用高分辨液質(zhì)lcms-it-tof檢測到了41個2-(2-苯乙基)色酮化合物，具體見表2。

表2nacl誘導(dǎo)白木香愈傷組織產(chǎn)生的2-(2-苯乙基)色酮化合物

注：*代表標(biāo)準(zhǔn)品鑒定；ah6為36號峰，ah8為35號峰。

以下是采用標(biāo)準(zhǔn)品鑒定的部分2-(2-苯乙基)色酮化合物的結(jié)構(gòu)式：

實施例4

將采用實施例1誘導(dǎo)培養(yǎng)基①誘導(dǎo)得到的白木香愈傷組織，經(jīng)實施例2的繼代培養(yǎng)基1)繼代培養(yǎng)5次后，接種于如下液體生產(chǎn)培養(yǎng)基：

(1)按照如下配方配制液體培養(yǎng)基：ms鹽4.3g/l、kh2po410mg/l、肌醇100mg/l、naa2mg/l、6-ba1mg/l、2,4-d1mg/l、kt1mg/l、vb51mg/l、蔗糖30g/l、nacl150mm，在此基礎(chǔ)上分別添加二苯基氯化碘鹽10μm～100μm，得到液體培養(yǎng)基。

(2)按照如下配方配制對比液體培養(yǎng)基：ms鹽4.3g/l、kh2po410mg/l、肌醇100mg/l、naa2mg/l、6-ba1mg/l、2,4-d1mg/l、kt1mg/l、vb51mg/l、蔗糖30g/l、nacl150mm。

培養(yǎng)溫度為26℃，培養(yǎng)時間為5天后，采用高分辨液質(zhì)聯(lián)用法檢測愈傷細(xì)胞中2-(2-苯乙基)色酮化合物。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加二苯基氯化碘鹽后，白木香愈傷組織中多種2-(2-苯乙基)色酮化合物，特別是ah6、ah8的產(chǎn)量有相當(dāng)顯著地增加；同時，經(jīng)細(xì)胞活性試驗證明，與僅加入氯化鈉相比，同時加入氯化鈉和dpi的培養(yǎng)基中愈傷細(xì)胞的細(xì)胞活性更高。在本研究所采用的誘導(dǎo)方法中，150mmnacl+25μmdpi的組合是誘導(dǎo)白木香愈傷組織中產(chǎn)生2-(2-苯乙基)色酮最為高效的誘導(dǎo)方式，圖3示出了加入常規(guī)繼代培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上僅加入150mmnacl和同時加入150mmnacl+25μmdpi培養(yǎng)后，白木香愈傷細(xì)胞產(chǎn)生的2-(2-苯乙基)色酮化合物的hplc圖(波長為320nm)。本發(fā)明方法可以有效的用于人工誘導(dǎo)加速結(jié)香的生產(chǎn)實踐中，改善現(xiàn)有的人工結(jié)香方法，具有重要的實用價值和經(jīng)濟(jì)價值。

本發(fā)明并不限于上述實施方式，在不背離本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以想到的任何變形、改進(jìn)、替換均落入本發(fā)明的范圍。