本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種多糖及其制備方法。

背景技術(shù)：

微生物產(chǎn)生多糖來適應(yīng)各種環(huán)境條件，胞外多糖可以幫助微生物生長(zhǎng)，如粘附，存儲(chǔ)營(yíng)養(yǎng)，保護(hù)層，是形成生物被膜的重要組成組分。細(xì)菌產(chǎn)生的多糖，在許多領(lǐng)域具有非常廣泛的應(yīng)用價(jià)值，如作為抗氧化劑，金屬螯合劑，乳化劑，增稠劑等。而極端古菌產(chǎn)生的多糖被研究與報(bào)道的并不多，嗜鹽古菌的生存環(huán)境很極端，其產(chǎn)生的多糖，也許更具價(jià)值。目前報(bào)道的可以產(chǎn)生胞外多糖的幾種嗜鹽古菌有haloferax、halococcus、haloarcula、natronococcus、haloterrigena和halobacterium，只有五種來自嗜鹽古菌的多糖，其組成與結(jié)構(gòu)被報(bào)道，而關(guān)于嗜鹽古菌多糖的生物合成途徑，知之甚少。對(duì)于嗜鹽古菌多糖及其生物合成途徑的研究，可以豐富人類對(duì)古菌的認(rèn)識(shí)，并且開發(fā)出更具價(jià)值的多糖。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種制備多糖的方法。

本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：發(fā)酵嗜鹽古菌har.hispanicatcc33960，得到多糖。

上述方法中，所述發(fā)酵的條件為37℃培養(yǎng)至穩(wěn)定期。

上述方法中，在所述發(fā)酵后還包括如下步驟：

1)收集發(fā)酵產(chǎn)物的上清液，將上述上清液依次經(jīng)乙醇沉淀、透析、濃縮、干燥，得到干燥產(chǎn)物；

2)將所述干燥產(chǎn)物依次經(jīng)離子交換層析和凝膠層析，得到多糖。

上述方法中，所述透析采用截留量為8000-12000分子量的透析袋進(jìn)行。

上述方法中，所述離子交換層析為將所述干燥產(chǎn)物溶解后，流進(jìn)離子交換層析柱，再用離子交換層析洗脫緩沖液洗脫，收集離子交換層析產(chǎn)物；

所述離子交換層析洗脫緩沖液為含有0到2.5mnacl的20mmnaac水溶液；

所述離子交換層析洗脫的方式為梯度洗脫；

所述離子交換層析柱填充的介質(zhì)為deae-sepharosefastflow(購(gòu)自sigma，體積為120ml，長(zhǎng)30cm)；

所述離子交換層析柱體積為120ml，長(zhǎng)30cm；

所述收集離子交換層析產(chǎn)物為收集nacl濃度在含有1.25m-1.55mnacl的20mmnaac水溶液；

所述凝膠層析為將所述離子交換層析產(chǎn)物二次透析后，再流進(jìn)凝膠柱，再用凝膠層析洗脫緩沖液洗脫，收集凝膠層析產(chǎn)物；

所述凝膠層析洗脫緩沖液為水，洗脫用量為150ml(1個(gè)柱體積)；

所述收集凝膠層析產(chǎn)物為收集2/15-1/3的柱體積的洗脫液(20-50ml)；

所述凝膠柱填充的介質(zhì)為sephacryls-400(購(gòu)自gehealthcare，150ml，長(zhǎng)100cm)；

所述凝膠柱體積為150ml，長(zhǎng)100cm；

所述二次透析采用截留量為14000da的透析袋進(jìn)行。

由上述方法制備的多糖也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

所述多糖為酸性多糖；

或，所述多糖為酸性多糖；

或，所述多糖包括或?yàn)槿缦聨追N組分形成的聚合物：1)甘露糖、2)半乳糖、3)葡萄糖、4)1)-3)中至少一種的硫酸化修飾產(chǎn)物；

或，所述多糖包括或?yàn)槿缦聨追N組分形成的聚合物：1)甘露糖、2)半乳糖、3)葡萄糖、4)1)-3)中至少一種的硫酸化修飾產(chǎn)物；

所述甘露糖、所述半乳糖和所述葡萄糖的摩爾比為55.9:43.2:0.9；

所述多糖中硫酸根的質(zhì)量百分含量為26％；

所述多糖中碳水化合物的質(zhì)量百分含量為51％。

上述多糖在制備如下1)-3)中任一中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍：

1)維持細(xì)菌保濕產(chǎn)品；

2)吸附陽(yáng)離子維持細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)產(chǎn)品；

3)細(xì)菌保護(hù)屏障產(chǎn)品。

上述應(yīng)用中，所述細(xì)菌為嗜鹽古菌。

本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明了，這種來自極端嗜鹽古菌的酸性多糖，其組成與已經(jīng)報(bào)道的嗜鹽古菌多糖都不盡相同，具有高硫酸根含量和高甘露糖含量的特點(diǎn)，且分子量大，在溶液中呈現(xiàn)出規(guī)則顆粒狀，有很好的延展性。在嗜鹽古菌中，該酸性多糖可以使菌落保持濕潤(rùn)狀態(tài)，并且結(jié)合金屬陽(yáng)離子維持嗜鹽古菌的細(xì)胞形態(tài)。

附圖說明

圖1為嗜鹽古菌har.hispanicatcc33960酸性多糖的分離純化與分子量測(cè)定；a,發(fā)酵液經(jīng)過deae-sepharosefastflow柱純化。蛋白含量測(cè)定，紫外檢測(cè)器檢測(cè)od280nm值；多糖含量測(cè)定，苯酚硫酸法測(cè)定od490nm值；nacl％，nacl濃度。b，洗脫組分的酸性多糖電泳。40-47管。c，多糖的均一性分析及分子量測(cè)定。

圖2為多糖的單糖組成分析，gc-ms檢測(cè)多糖的完全酸水解產(chǎn)物。

圖3為多糖的紅外光譜ftir檢測(cè)。

圖4為多糖的nmr檢測(cè)a，¹h譜。b，¹³c譜。。

圖5為野生株、多糖缺失突變株與回復(fù)株的菌落特征比較。

圖6為野生株與多糖缺失突變株的生長(zhǎng)速率(左)及形態(tài)觀察(右)。

圖7為嗜鹽古菌har.hispanicatcc33960的基因敲除突變株的pcr鑒定及southern鑒定。

圖8為野生株、基因敲除突變株與表達(dá)回復(fù)菌株的rt-pcr鑒定分析。

圖9為酸性多糖的7.5％page電泳檢測(cè)。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1、多糖的制備

1、發(fā)酵制備多糖

嗜鹽古菌har.hispanicatcc33960在1l的as-168培養(yǎng)基中，37℃200rpm轉(zhuǎn)速的搖床中，培養(yǎng)4-5天至穩(wěn)定期，13,000×g離心30分鐘離心去除菌體，保留上清。

將發(fā)酵上清用4倍體積的無水乙醇在4℃沉淀過夜，13,000×g離心30分鐘收集沉淀；將沉淀用500ml蒸餾水復(fù)溶后，在截留量為8000-12000分子量的透析袋內(nèi)用蒸餾水透析除鹽，然后在透析袋內(nèi)加入核酸酶10μl(購(gòu)自sigma,≥250units/μl,mw30kda)，37℃放置12小時(shí)；再加入3mg蛋白酶k(購(gòu)自sigma,≥30units/mg,mw29kda)，37℃放置12小時(shí)；期間換水繼續(xù)透析。將透析液再經(jīng)過13,000×g離心30分鐘，收集上清，將上清溶液經(jīng)過100kda截留量的超濾濃縮裝置，濃縮到250ml,冷凍干燥成粉末，得到粗多糖，將凍干粉末溶于緩沖液a(20mmnaac溶液)中，得到粗多糖溶液，粗多糖濃度為10mg/ml。

2、純化

(1)離子交換柱純化

上述粗多糖溶液經(jīng)deae-sepharosefastflow(購(gòu)自sigma，體積為120ml，長(zhǎng)30cm)離子交換柱吸附后，用緩沖液b,含2.5mnacl的20mmnaac(146gnacl,1.64gnaac定容到1l，0.22μm濾膜過濾)梯度洗脫，洗脫體積為600ml，即5個(gè)柱體積洗脫，在這個(gè)過程中，緩沖液b的含量從0到100％，也就是nacl梯度從0到2.5m；流速為0.5ml/min。將洗脫下來的組分收集，用紫外檢測(cè)器(280nm)、苯酚硫酸法和酸性多糖電泳法鑒定每管洗脫組分。當(dāng)nacl濃度在1.25m-1.55m時(shí)，洗脫下來的組分即為純化的酸性多糖。

結(jié)果見圖1中a和b，其中41-47管(nacl濃度在1.25m-1.55m)即為洗脫下來的酸性多糖。將酸性多糖各管組分合并(41-47管)，裝進(jìn)透析袋(截留量14000da)用蒸餾水透析除鹽后，凍成干粉。

(2)sephacryls-400/hr柱純化

將上述(1)的干粉用ddh2o溶解成多糖含量為2mg/ml的溶液，經(jīng)過sephacryls-400/hr柱(購(gòu)自gehealthcare，150ml，長(zhǎng)100cm)，用150mlddh2o洗脫，流速為0.5ml/min。每管用苯酚硫酸法檢測(cè)多糖含量，并收集主峰(20-50ml，2/15-1/3的柱體積)，凍成干粉，稱重，1las-168培養(yǎng)基可以獲得純多糖30mg。

3)多糖的均一性分析及分子量的測(cè)定

將上述2)得到的純多糖干粉溶于ddh2o中，配制成3mg/ml的溶液，取40μl溶液經(jīng)過tskg4000分子篩柱分析樣品的均一性，流動(dòng)相為0.1mnano3，流速為0.5ml/min，柱溫為30℃，利用示差折光檢測(cè)器來檢測(cè)。利用不同分子量的dextran(50kda,80kda,150kda,270kda,410kda,670kda,1100kda)來做標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定該酸性多糖的分子量。經(jīng)測(cè)定，該酸性多糖分子量為1100kda,見圖1c。

4)、多糖的單糖組成測(cè)定

將200μg上述2)得到純多糖，利用2m三氟乙酸(tfa)在121℃下水解2個(gè)小時(shí)，真空旋轉(zhuǎn)干燥，利用硼氫化鈉(nabd4)還原單糖，利用乙酸酐來乙酰化單糖。選擇20μg的肌醇(inositol)作為內(nèi)參。乙?；奶谴祭胓c-ms分析確定其種類(agilent7890agcinterfacedtoa5975cmsd,electronimpactionizationmode)。分離柱為30msupelcosp-2331bondedphasefusedsilicacapillarycolumn。

gc-ms結(jié)果見圖2，該多糖中的單糖由甘露糖，半乳糖和葡萄糖組成，其組成的摩爾比為甘露糖：半乳糖：葡萄糖＝55.9:43.2:0.9，碳水化合物(所有單糖)占該多糖總量的51％(質(zhì)量百分含量)。

該多糖的組成不同于其他在嗜鹽古菌中發(fā)現(xiàn)的多糖，見表1。

表1為已知嗜鹽古菌多糖的單糖組成比較

5)、多糖的硫酸根含量測(cè)定

將上述2)得到純多糖干粉與kbr粉末一起研磨后，取少量進(jìn)行紅外光譜檢測(cè)(thermonicoletis5)，所選波長(zhǎng)為500-4000cm^-1，結(jié)果見圖3。多糖在3520cm^-1處有一大的吸收峰值，這是-oh基團(tuán)的吸收特征；2937cm^-1處的吸收峰是由于c-h鍵的伸縮振動(dòng)；1645cm^-1處的吸收峰來自于c＝o鍵的伸縮振動(dòng)；900-1150cm^-1處的吸收峰來自c-o-c鍵的伸縮振動(dòng)；而1258cm^-1和855cm^-1處的吸收峰則是來自s＝o鍵的伸縮振動(dòng)。ftir的結(jié)果提示，該多糖是硫酸化的。利用離子色譜對(duì)該多糖的硫酸根含量進(jìn)行了測(cè)定，取2mg純多糖，用2mtfa，在121℃下密閉管中水解2小時(shí)后，真空旋轉(zhuǎn)干燥，將水解后樣品溶于ddh2o中，利用高效液相離子色譜儀(ics-2100,thermoscientific)檢測(cè)so4^2-含量，選擇ionpacas11-hc分析柱，柱溫維持在30℃，流動(dòng)相為30mmnaoh溶液，流速為1ml/min。利用na2so4做標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定該多糖so4^2-含量為26％(w/w)。

7)、多糖的一維氫譜，碳譜測(cè)定

將40mg上述2)得到多糖溶于0.5ml重水中(99.96％純度的d2o)，冷凍干燥交換3次，進(jìn)行一維質(zhì)譜檢測(cè)(brukeravanceⅲ500mhzspectrometer)。¹h譜時(shí)用d2o(4.70ppm)作為內(nèi)參，¹³c譜時(shí)用dmso(39.39ppm)作為內(nèi)參。一維氫譜、碳譜結(jié)果見圖4a，¹³cnmr結(jié)果(圖4b)顯示了四個(gè)異頭碳原子，分別為δ104.12,103.85,102.52和96.07ppm,60-85ppm為糖環(huán)上的碳原子信號(hào),意味著多糖的重復(fù)單位由4種類型的單糖(甘露糖，半乳糖，葡萄糖及一種硫酸化修飾的上述單糖)構(gòu)成。

實(shí)施例2、多糖的生物學(xué)功能

一、基因敲除突變株嗜鹽古菌atcc33960突變株(△hah_1662)的獲得

hah_1662基因的核苷酸序列為序列1，其編碼的蛋白的氨基酸序列為序列2。

用于敲出該基因的同源重組片段序列為序列3。

1、用于敲除的敲除質(zhì)粒的制備

將序列表中序列3所示的同源重組片段用hindⅲ和kpni酶(neb公司生產(chǎn))雙酶切后，將雙酶切片段用天根公司dna凝膠回收試劑盒回收，方法參考其說明書。

將敲除載體質(zhì)粒pubp(記載在如下文獻(xiàn)中：ppl.environ.microbiol.,2007,vol73,no19,page6058-6065)同樣經(jīng)過hindⅲ和kpni酶雙酶切后，將雙酶切片段用天根公司dna凝膠回收試劑盒回收，方法參考其說明書。將上述兩個(gè)酶切片段用t4ligase(promega公司生產(chǎn))連接，構(gòu)建成敲除質(zhì)粒pubpδhah_1662。

pubpδhah_1662為將序列表中序列3所示的片段替換質(zhì)粒pubp的hindⅲ和kpni酶切位點(diǎn)間得到的載體。

2、導(dǎo)入目的菌實(shí)現(xiàn)敲除

1)感受態(tài)的制備：從平板上用牙簽挑取少量har.hispanicatcc33960菌體，接種于as-168培養(yǎng)基中(bactocasaminoacids5g；bactoyeastextract5g；sodiumglutamate1g；trisodiumcitrate3g；mgso4·7h2o20g；kcl2g；nacl200g；feso4·7h2o微量；mncl2·7h2o痕量；加ddh2o至1l，用naoh調(diào)ph至7.0-7.2，固體培養(yǎng)基加1.2％瓊脂，8p滅菌30分鐘),37℃,200rpm培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期(菌體呈淡紅色)，然后以1:10轉(zhuǎn)接于新鮮培養(yǎng)基中，約生長(zhǎng)20-24h至菌體呈微紅色，再以同樣比例轉(zhuǎn)接，生長(zhǎng)20-24h，即可用于轉(zhuǎn)化。

2)轉(zhuǎn)化(所有操作均在室溫下進(jìn)行)：取1ml活化好的菌液于滅菌的離心管中，6000rpm離心3min；棄上清，用移液槍吸盡殘余的上清，然后加入200μlbss-ls緩沖液(nacl5.85g；kcl0.201g；sucrose15g；先溶解于95ml蒸餾水中，8p×30min滅菌后再加入5ml滅菌的1m,ph8.2tris-hcl)，用移液槍輕輕吹勻，6000rpm離心3min；棄上清，用移液槍吸盡殘余的上清，然后加入100μlbss-ls/加甘油緩沖液(nacl5.85g；kcl0.201g；sucrose15g；glycerol15ml；先溶解于95ml蒸餾水中，8p×30min滅菌后再加入5ml滅菌的1m,ph8.2tris-hcl)，用移液槍輕輕吹勻；加入10μl0.5mph8.0的edta緩沖液，用手輕輕拍打離心管壁，混勻后室溫下放置10min(形成原生質(zhì)體)；預(yù)先將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒pubpδhah_16625μl與5μlbss-ls/加甘油緩沖液混勻，然后加入到原生質(zhì)體溶液中，放置5min(陰性對(duì)照在原生質(zhì)體溶液中加入10μlbss-ls/加甘油緩沖液)；加入120μl(與上面離心管中溶液等體積)60％的peg600溶液,peg600溶液使用時(shí)用ubss/ls緩沖液(nacl5.85g；kcl0.201g；sucrose15g；ddh2o加至100ml,用tris堿或naoh調(diào)至ph至7.0-7.5，8p×30min滅菌)配置，迅速上下顛倒離心管多次，直到溶液變得透亮均一，然后室溫放置20-30min。加入1ml復(fù)蘇培養(yǎng)基(30％seawater76.7ml；peptone0.5g；bactoyeastextract0.1g；sucrose15g；ddh2o加至100ml；用tris堿或naoh調(diào)至ph至7.0-7.5，8p×30min滅菌)，上下顛倒離心管混勻溶液，10000rpm離心2min；棄上清，再加入500μl-1ml的復(fù)蘇培養(yǎng)基懸浮菌體，于37℃，200rpm搖床復(fù)蘇過夜。

3)涂板：將復(fù)蘇過夜的菌體10000rpm離心2min，剩余500-600μl復(fù)蘇培養(yǎng)基用來重懸菌體，在含mevinolin(5μg/ml)的as-168固體培養(yǎng)基上，讓液體在平板上流動(dòng)直到均勻地吸附于平板。

4)生長(zhǎng)：將涂好的平板放于37℃溫箱，用塑料袋裝好，以防板子干涸。7天左右可以看到淡紅色的轉(zhuǎn)化子，10天左右，可以將轉(zhuǎn)化子在含mevinolin的as-168固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，生長(zhǎng)3天左右即可用于dna抽提pcr檢測(cè)。

pcr檢測(cè)的引物為p1t:5’tatggccgagaacatcctcg3’；p4t:5’cgcatacctcttggtatag3’；得到1.2kb和2.4kb的片段，為目的菌株，為正確的轉(zhuǎn)化子。

5)將正確的轉(zhuǎn)化子在不含mevinolin的as-168的液體培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)至少三次，在傳代期間，個(gè)別菌體發(fā)生二次基因重組，選取可以在as-168/mev-平板上生長(zhǎng)，而不能在as-168/mev⁺平板上生長(zhǎng)的單菌落，經(jīng)過pcr驗(yàn)證篩選基因敲除突變株。

選擇p1t和p4t作為引物，單菌落基因組為模板，發(fā)生一次重組pop-in菌株可以擴(kuò)增出1.2kb和2.4kb兩條帶，而發(fā)生兩次重組pop-out菌株，只能擴(kuò)增出1.2kb條帶。pcr驗(yàn)證結(jié)果見圖7a。因此，判斷兩次重組pop-out菌株為嗜鹽古菌atcc33960突變株(△hah_1662)，即har.hispanicatcc33960菌體基因組敲除hah_1662基因得到的重組菌。

3、southern雜交驗(yàn)證突變株。

提取野生株嗜鹽古菌atcc33960與嗜鹽古菌atcc33960突變株(△hah_1662)基因組dna，選擇ecorv(neb公司生產(chǎn))進(jìn)行酶切，得到的酶切產(chǎn)物選取hah_1662下游1550-bp片段作為探針，進(jìn)行southern雜交(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南)。

1550-bp片段用引物p55’aaccgtttcaatcgacggtatatcctgattattc3’和p65’atctcacaacatctgttgattctggcattcacaag3’進(jìn)行擴(kuò)增，以野生型菌株嗜鹽古菌atcc33960基因組dna為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增。

pcr反應(yīng)體系：10×extaqbuffer5μl，引物p5和引物p6各1μl(20μmol/l)，dna模板1μl(1μg/μl)，dntps(各2.5mm)4μl，extaqenzyme(takara，5u/μl)1μl，最后補(bǔ)水至50μl。反應(yīng)條件：98℃熱變性5min；95℃變性1min，50℃退火30s，72℃延伸1min30s，共30個(gè)循環(huán)；72℃最后延伸10min。pcr產(chǎn)物(1550-bp片段)用北京天根公司dna凝膠回收試劑盒回收，方法參考其說明書。

southern驗(yàn)證結(jié)果見圖7b，野生菌可以雜交出3.3kb的條帶，而嗜鹽古菌atcc33960突變株(△hah_1662)可以雜出4.4kb的條帶，表明，嗜鹽古菌atcc33960突變株(△hah_1662)的確敲除hah_1662基因。

4、野生株、δhah_1662突變株rt-pcr鑒定

1)提取rna反轉(zhuǎn)錄得到cdna

野生株、δhah_1662突變株提取rna，并反轉(zhuǎn)錄得到cdna作為模板。

2)擴(kuò)增

以各菌株cdna為模板，用p9(5’atggatatcctccacacgcc3’)和p10(5’catgtacctcgttatgatcg3’)引物擴(kuò)增hah_1662；

以cdna為模板，用p11(5’gtgagtaatgttctgtatcc3’)和p12(5’gccctgtatgcttccagtgc3’)引物擴(kuò)增hah_1667做對(duì)照(control)；

以cdna為模板，用p13(5’atggcaaatacaccggtatcag3’)和p14(5’tactacactgccaccgggttc3’)引物擴(kuò)增質(zhì)粒pwl-cbd-hah_1662上的cellulosebindingdomain(cbd)。

上述rt-pcr產(chǎn)物在1％的瓊脂糖凝膠中電泳后，eb染色，結(jié)果如圖8所示，說明野生株，基因敲除株，表達(dá)回復(fù)菌株正確。

二、嗜鹽古菌atcc33960突變株(△hah_1662)降低胞外酸性多糖產(chǎn)量

嗜鹽古菌har.hispanicatcc33960野生株和基因敲除突變株δhah_1662在40ml的as-168培養(yǎng)基中，37℃200rpm，培養(yǎng)至穩(wěn)定期，13,000×g離心30分鐘離心去除菌體，保留上清。將40ml發(fā)酵上清用4倍體積的無水乙醇在4℃沉淀過夜，13,000×g離心30分鐘收集沉淀；將沉淀用40ml蒸餾水復(fù)溶后，在截留量為8000-12000分子量的透析袋內(nèi)用蒸餾水透析除鹽，然后在透析袋內(nèi)加入核酸酶2μl(購(gòu)自sigma,≥250units/μl,mw30kda)，37℃放置12小時(shí)；再加入20μl5mg/ml蛋白酶k(購(gòu)自sigma,≥30units/mg,mw29kda)，37℃放置12小時(shí)；期間換水繼續(xù)透析。將透析液再經(jīng)過13,000×g離心30分鐘，收集上清，將上清溶液經(jīng)過100kda截留分子量的超濾濃縮管(millipore公司生產(chǎn)，50ml,操作見產(chǎn)品說明書)，濃縮到5ml,冷凍干燥成粉末，得到多糖。將凍干粉末溶于2mlddh2o中，即為粗多糖溶液。

配制7.5％的page膠，參見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，取20μl粗多糖溶液加入5μl的5×loadingbuffer(終濃度為312.5mmol/l的tris-hcl，甘油終濃度為50％，溴酚藍(lán)終濃度為0.05％，ph6.8的水溶液)120v電泳，待溴酚藍(lán)跑出，收膠。用0.5％的亞甲基藍(lán)溶液(用3％的醋酸溶液配制)染色30min分鐘后，3％的醋酸溶液脫色。

結(jié)果見圖9，可以看出，敲除突變株δhah_1662中無多糖存在，即為多糖缺失突變株，而野生株atcc33960中可以提取到多糖。因此，表明hah_1662基因?yàn)榕c多糖合成相關(guān)的基因。

二、觀察降低多糖含量的菌株的表型

1、多糖維持菌落的粘濕度

將野生株與多糖缺失突變株δhah_1662(δeps)在as-168固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察其菌落形態(tài)，發(fā)現(xiàn)缺失該多糖的突變株，菌落干涸，缺少了濕粘度，見圖5，可見，該酸性多糖負(fù)責(zé)維持菌落的粘濕度。

2、多糖可以在嗜鹽古菌中保濕，吸附陽(yáng)離子維持細(xì)胞形態(tài)的作用，是一種菌體的天然保護(hù)屏障

正常as-168培養(yǎng)基中的nacl為200g/l,即3.4mnacl培養(yǎng)條件；

2.3mnacl培養(yǎng)基是將as-168培養(yǎng)基中的nacl濃度定為135g/l。

取150μlod600nm＝1.0的缺失多糖突變株δeps培養(yǎng)液和野生株培養(yǎng)液分別接種到40mlas-168培養(yǎng)基和2.3mnacl培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃，200rpm；每隔一定時(shí)間取樣測(cè)定od600nm值，三個(gè)生物學(xué)重復(fù)取平均值；測(cè)定生長(zhǎng)曲線，見圖6左，可以看出，將缺失多糖突變株δeps在2.3mnacl低鹽條件下培養(yǎng)時(shí)，生長(zhǎng)遲緩，且細(xì)胞膨脹受損。

取3.4mnacl和2.3mnacl培養(yǎng)條件下的菌體(穩(wěn)定期)，用含3％戊二醛的鹽溶液固定后，進(jìn)行掃描電鏡觀察(su8010,hitachiltd.,japan)，發(fā)現(xiàn)在低鹽條件下，細(xì)胞膨脹受損，見圖6右。

上述結(jié)果證實(shí)了，該酸性多糖在嗜鹽古菌中，具有保濕，吸附陽(yáng)離子維持細(xì)胞形態(tài)的作用，是一種菌體的天然保護(hù)屏障。

序列表

<110>中國(guó)科學(xué)院微生物研究所

<120>一種多糖及其制備方法

<160>3

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1194

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