本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種采用滇龍膽內(nèi)生真菌轉(zhuǎn)化龍膽苦苷的方法，并成功轉(zhuǎn)化、分離得到兩個(gè)具有保肝活性的成分。
背景技術(shù)：
：龍膽（gentianaeradixetrhizoma），為龍膽科植物條葉龍膽gentianamanshuricakitag、龍膽g.scabrabge.、三花龍膽g.triflorapall.或滇龍膽g.rigescensfranch.的干燥根及根莖。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，是中醫(yī)臨床的常用中藥，性味苦、寒，歸肝膽經(jīng)，能清熱燥濕，瀉肝膽火，用于濕熱黃疸，陰腫陰癢，帶下，濕疹瘙癢，肝火目赤，耳鳴耳聾，脅痛口苦，強(qiáng)中，驚風(fēng)抽搐。其中，滇龍膽別名堅(jiān)龍膽、南龍膽、藍(lán)花根、龍膽草、雪山苦草等，是云南道地藥材，云南彝藥主要品種，又是眾多企業(yè)生產(chǎn)苦膽草片、龍膽瀉肝片等的重要原料，為保肝利膽之良藥。龍膽中的主要活性成分為龍膽苦苷（gentiopicroside）、獐牙菜苦苷（swertiamarin）、獐牙菜苷（sweroside）等，其中，龍膽苦苷已經(jīng)作為龍膽的質(zhì)量控制指標(biāo)成分，為《中國(guó)藥典》（2015年版）所收載?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這些活性成分均具有顯著的保肝利膽作用。龍膽苦苷可以明顯保護(hù)ccl4所導(dǎo)致的肝損傷，降低谷丙氨轉(zhuǎn)氨酶的受損釋放，同時(shí)龍膽苦苷還可以明顯增加膽汁流量和膽紅素的濃度，具有顯著保肝、利膽、抗炎、鎮(zhèn)痛等藥理作用。此類化合物為前體藥物，經(jīng)過腸道菌群或肝臟代謝后，在體內(nèi)產(chǎn)生藥效團(tuán)，因而在整體動(dòng)物水平上具有明顯的藥效（活性），在體外細(xì)胞或酶的水平上，卻不表現(xiàn)出生物活性。內(nèi)生真菌（endophyticfungi），是指那些在其生活史中某一段時(shí)期生活在植物組織內(nèi)，對(duì)宿主植物沒有引起明顯病害癥狀的真菌。根據(jù)“內(nèi)共生理論”學(xué)說，內(nèi)生真菌與宿主在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中有遺傳物質(zhì)的交換，與宿主植物協(xié)同進(jìn)化。近二三十年的研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌幾乎存在于所有已研究的植物中，具有豐富的物種多樣性，參與調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)，是植物病害生物防治的天然資源；次生代謝產(chǎn)物豐富，并能產(chǎn)生與宿主相同或相似的成分，研究前景廣闊。由此推測(cè)，滇龍膽中的內(nèi)生真菌能協(xié)助宿主合成一些宿主代謝所必須的類似物或前體化合物，是具有巨大潛力的資源領(lǐng)域。微生物轉(zhuǎn)化，是通過微生物細(xì)胞或酶系對(duì)外源底物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾和改造，而獲得有價(jià)值的產(chǎn)物的生理生化反應(yīng)。微生物轉(zhuǎn)化是巨大的獲取新天然化合物結(jié)構(gòu)的寶庫(kù)，可以有效保護(hù)藥用資源、低碳環(huán)保。鑒于內(nèi)生真菌與宿主協(xié)同進(jìn)化，可能參與了次生代謝產(chǎn)物的合成，協(xié)助宿主合成了一些宿主代謝所必須的類似物或前體物質(zhì)，且內(nèi)生真菌中具有豐富的酶系，利用其進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化可以獲得有價(jià)值的衍生物，我們采用滇龍膽內(nèi)生真菌轉(zhuǎn)化龍膽苦苷，并獲得了1對(duì)活性代謝產(chǎn)物。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于采用內(nèi)生真菌成功轉(zhuǎn)化龍膽苦苷，本發(fā)明涉及將底物中龍膽苦苷成分轉(zhuǎn)化為如下1對(duì)活性代謝產(chǎn)物：5α-(hydroxymethyl)-6β-methyl-1h,3h-5,6-dihydropyrano[3,4-c]pyran-1(3h)-one（化合物a）；和5β-(hydroxymethyl)-6β-methyl-5,6-dihydropyrano[3,4-c]pyran-1(3h)-one（化合物b）的方法。本發(fā)明涉及化合物a在制備治療肝損傷的組合物的應(yīng)用。本發(fā)明涉及化合物b在制備治療肝損傷的組合物的應(yīng)用。本發(fā)明涉及化合物a在制備抗氧化的組合物的應(yīng)用。本發(fā)明涉及化合物b在制備抗氧化的組合物的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：一株滇龍膽內(nèi)生真菌及其轉(zhuǎn)化龍膽苦苷的方法：其特征在于：為內(nèi)生真菌直接發(fā)酵轉(zhuǎn)化法，包括內(nèi)生真菌的培養(yǎng)、發(fā)酵、底物的添加及產(chǎn)物制備。所述內(nèi)生真菌為從滇龍膽中分離得到的一株內(nèi)生真菌1-10，經(jīng)18srdna鑒定為fusariumoxysporum；所述生物轉(zhuǎn)化發(fā)酵液為pda液體發(fā)酵培養(yǎng)基：土豆200g，葡萄糖5g，煮后定容至1000ml，ph7.0；本發(fā)明所述的滇龍膽內(nèi)生真菌轉(zhuǎn)化龍膽苦苷的方法，包括如下具體步驟：a)滇龍膽內(nèi)生真菌的分離①?gòu)牡猃埬懶迈r植株的根、莖、葉、花中分離內(nèi)生真菌：將新鮮植株分別采用水洗、75%酒精浸泡及5%次氯酸鈉浸泡的方式消毒，接種于pda固體培養(yǎng)基，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至長(zhǎng)出真菌菌落；②分離過程中設(shè)立對(duì)照組，將消毒好的植株于空白培養(yǎng)基上翻滾接觸，并將培養(yǎng)皿同樣置于恒溫箱中培養(yǎng)，觀察是否有菌落產(chǎn)生，以確保內(nèi)生真菌分離成功；③對(duì)分離得到的內(nèi)生真菌進(jìn)行反復(fù)純化。b)生物轉(zhuǎn)化活性的篩選：利用分離得到的內(nèi)生真菌轉(zhuǎn)化其宿主活性成分龍膽苦苷，并同時(shí)設(shè)立只發(fā)酵而不加入底物，及不含菌僅加入底物的對(duì)照組。①發(fā)酵：將菌株分別發(fā)酵，搖床條件為150rpm，28℃；②加入底物：發(fā)酵兩天，待發(fā)酵瓶中菌絲生長(zhǎng)旺盛時(shí)，加入龍膽苦苷繼續(xù)搖床培養(yǎng)；③終止發(fā)酵：繼續(xù)共培養(yǎng)7天，待底物基本轉(zhuǎn)化后，加入雙倍量甲醇終止反應(yīng)，并進(jìn)行q-tof-ms檢測(cè)。c)生物轉(zhuǎn)化放大實(shí)驗(yàn)將篩選得到的目標(biāo)菌株進(jìn)行大量發(fā)酵，并加大底物的投入量。d)分離轉(zhuǎn)化產(chǎn)物①對(duì)生物轉(zhuǎn)化完成的樣品進(jìn)行過濾，得到濾過液，用等體積的水飽和正丁醇分三次反復(fù)萃取，合并萃取液，減壓濃縮揮干正丁醇。②所得殘?jiān)眉状既芙夂螅^mci柱（60cm，50gofmcigel）層析純化，洗脫劑依次用水、meoh-h2o（50/50，80/20，v/v）梯度洗脫。③收集meoh-h2o（50/50，80/20，v/v）洗脫液，減壓回收溶劑。殘?jiān)眉状紡?fù)溶，經(jīng)反相高效液相制備色譜，得到產(chǎn)物。e)產(chǎn)物分析及結(jié)構(gòu)鑒定化合物a和化合物b的1h（400mhz）、13c（100mhz）nmr如下所示：結(jié)構(gòu)鑒定為：化合物a化合物b分離轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的方法的優(yōu)選過程：a)mci柱純化的優(yōu)選過程：洗脫劑依次用水、meoh-h2o（10/90、50/50，90/10，v/v）梯度洗脫（各2-3倍柱體積）；洗脫劑依次用水、meoh-h2o（20/80、50/50，80/20，v/v）梯度洗脫（各2-3倍柱體積）；經(jīng)hplc檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)水、meoh-h2o（50/50，80/20，v/v）洗脫（各2-3倍柱體積），目標(biāo)產(chǎn)物主要集中在這兩部分洗脫液中，故采用此洗脫條件。b)反相高效液相制備的優(yōu)選過程：流動(dòng)相a為純水，流動(dòng)相b為乙腈，梯度條件設(shè)為：a：b=11%：89%，時(shí)間為30mina：b=8%：92%，時(shí)間為30min經(jīng)考察，梯度為a：b=8%：92%，時(shí)間為30min，比較適合化合物a/b的制備?；衔颽和化合物b在反相制備液相中保留時(shí)間分別為約15min和18min。本發(fā)明具有如下有益效果：1)內(nèi)生真菌易于培養(yǎng)，發(fā)酵過程易于控制。2)轉(zhuǎn)化過程無污染、可控、安全、環(huán)保。3)轉(zhuǎn)化率可達(dá)1-2.5%。本發(fā)明所述的保肝化合物的制備方法，為大量制備純度較高的保肝化合物用于研究其生理活性及作用機(jī)制提供前提，具有應(yīng)用前景。具體實(shí)施例實(shí)施例1從滇龍膽中分離得到的一株內(nèi)生真菌fusariumoxysporumschl的方法從云南臨滄采集野生滇龍膽完整植株，48小時(shí)內(nèi)運(yùn)送至上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行內(nèi)生真菌分離。滇龍膽內(nèi)生真菌分離：將整個(gè)植株清除掉土壤，小心清洗干凈，分為根、莖、葉、花部位，于流動(dòng)自來水下沖洗1小時(shí)，在無菌操作臺(tái)中用75%乙醇漂洗(20～30s)→無菌水沖洗4次→5%naclo溶液漂洗5min)→無菌水沖洗4次→75%乙醇漂洗(20～30s)→無菌水沖洗4次。無菌濾紙片吸干水分，切成5mm×5mm×1mm的小塊，接種于pda固體培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)皿中接種4塊，置28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～30d，觀察到培養(yǎng)基上從各植物組織塊內(nèi)部向周圍長(zhǎng)出菌絲時(shí)，采用尖端菌絲挑取法把真菌轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)、轉(zhuǎn)接，直至完全純化。分離過程中設(shè)置對(duì)照組，采用經(jīng)表面消毒的組織塊在空白培養(yǎng)基上滾動(dòng)，使組織塊各表面接觸到培養(yǎng)皿，與接種好的培養(yǎng)皿一起培養(yǎng)，對(duì)照培養(yǎng)皿上未長(zhǎng)出菌落，說明表面消毒徹底。分離、純化采用的培養(yǎng)基為pda固體培養(yǎng)基：土豆200g，葡萄糖20g，瓊脂18g，煮后定容至1000ml，ph7.0。通過以上步驟，從滇龍膽的新鮮葉中分離得到菌株fusariumoxysporumschl。實(shí)施例2滇龍膽內(nèi)生真菌轉(zhuǎn)化龍膽苦苷的方法將菌株1-10在無菌操作臺(tái)中接種入pda液體發(fā)酵培養(yǎng)基，于28℃、150rpm培養(yǎng)。待48小時(shí)后，錐形瓶中真菌孢子豐富時(shí)，將底物龍膽苦苷加入，繼續(xù)于28℃、150rpm培養(yǎng)。龍膽苦苷加入量為100mg/l。pda液體發(fā)酵培養(yǎng)基：土豆200g，葡萄糖5g，煮后定容至1000ml，ph7.0。250ml錐形瓶裝入100ml培養(yǎng)基。實(shí)施例3q-tof-ms檢測(cè)的方法使用的是watersacquitytmsynaptg2系統(tǒng)。色譜方法色譜柱使用watershsst31.8μm，2.1*50mm，柱溫45℃。流動(dòng)相a為0.1%fa水溶液（v/v），流動(dòng)相b為乙腈，流速為0.4ml/min。采用梯度洗脫，方法如下：時(shí)間（min）05913141617a%98928272101098b%28182890902質(zhì)譜方法毛細(xì)管電壓為1.5kv；采樣錐孔電壓為45v；提取錐孔電壓為4v；離子源溫度為120℃；干燥氣溫度為400℃，流速為800l/h；錐孔氣流速為50l/h。化合物a和化合物b在uplc中保留時(shí)間分別為約6.9min和7.1min。實(shí)施例4生物轉(zhuǎn)化放大實(shí)驗(yàn)的方法將菌株fusariumoxysporumschl在無菌操作臺(tái)中接種入pda液體發(fā)酵培養(yǎng)基，于28℃、150rpm培養(yǎng)。待48小時(shí)后，錐形瓶中真菌孢子豐富時(shí)，將底物龍膽苦苷加入，繼續(xù)于28℃、150rpm培養(yǎng)7天。pda液體發(fā)酵培養(yǎng)基：土豆800g，葡萄糖20g，煮后定容至4000ml，ph7.0。250ml錐形瓶裝入100ml培養(yǎng)基。共計(jì)40瓶發(fā)酵培養(yǎng)液，分別發(fā)酵并加入龍膽苦苷底物1000mg。實(shí)施例5分離轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的方法萃?。簩㈠F形瓶中的培養(yǎng)液過濾，合并培養(yǎng)液，用三倍量的水飽和正丁醇萃取培養(yǎng)液，合并有機(jī)相，減壓回收有機(jī)相，得到殘?jiān)?。mci柱純化：將殘?jiān)?00mg）用水和甲醇溶解、超聲、上mci柱（60cm，含mci填料約50g）。甲醇洗脫2-3個(gè)柱體積，然后依次用水、meoh-h2o（50/50，80/20，v/v）洗脫（各2-3倍柱體積），收集meoh-h2o（50/50，80/20，v/v）洗脫液，將lc分析結(jié)果相同的組分合并、減壓回收。反相高效液相制備：將殘?jiān)鼧悠酚眉状紡?fù)溶、過濾，上反相高效液相色譜制備。色譜柱：ymc-pa出口，ods-a，10μm，250*20mm。流動(dòng)相：a為純水，b為乙腈，梯度：a：b=8%：92%，時(shí)間為30min，制備得到化合物a和化合物b單體化合物，均為棕色粉末，分別為25mg、10mg?；衔颽和化合物b在反相制備液相中保留時(shí)間分別為約15min和18min。實(shí)施例6保肝活性1.化合物對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的人肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用1.1實(shí)驗(yàn)材料、藥品與儀器材料：正常人肝細(xì)胞系(hl-7702)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。用含10%的胎牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。每毫升培養(yǎng)基均含有100單位青霉素和100單位鏈霉素，所有細(xì)胞均在含5%co2的37℃孵箱中培養(yǎng)，每3-4天傳代一次；cck-8試劑盒。儀器：流式細(xì)胞儀，全自動(dòng)酶標(biāo)儀，co2培養(yǎng)箱，96孔培養(yǎng)板。1.2受試樣品：化合物a、化合物b1.3cck-8法評(píng)價(jià)肝細(xì)胞的活力取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后，用含10%fbs的dmem溶液重新懸浮，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，將稀釋為含有5×106/l個(gè)hl-7702細(xì)胞的懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔接種5000個(gè)，待細(xì)胞長(zhǎng)成至亞層，即可用于實(shí)驗(yàn)，選擇長(zhǎng)成對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，換去原培養(yǎng)液，加入不同濃度的各代謝產(chǎn)物，37℃，50ml/lco2條件下培養(yǎng)24h，然后加入含量為2.0mmh2o2，100μl/孔，培養(yǎng)1h，造成h2o2損傷模型。加入cck-8孵育2h，用酶聯(lián)免疫儀在波長(zhǎng)450nm處測(cè)od值。每個(gè)藥物濃度重復(fù)測(cè)5次。cellviability%=(藥物組a_450)/(modea_450)×100%1.4化合物對(duì)損傷肝細(xì)胞的保護(hù)結(jié)果（1）實(shí)驗(yàn)過程中，分別做了化合物3個(gè)濃度（5、10、20um）的生物活性，化合物a在20um時(shí)對(duì)損傷的hl-7702細(xì)胞有保護(hù)作用，與模型組相比，具有顯著性差異（p＜0.01）；化合物b在5um時(shí)對(duì)損傷的hl-7702細(xì)胞有保護(hù)作用，與模型組相比，具有顯著性差異（p＜0.01）?；衔飳?duì)tgf-β1誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞活化的抑制2.1實(shí)驗(yàn)材料、藥品與儀器材料：人肝星狀細(xì)胞系(lx-2)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；每毫升培養(yǎng)基均含有100單位青霉素和100單位鏈霉素，所有細(xì)胞均在含5%co2的37℃孵箱中培養(yǎng)，每3-4天傳代一次。藥品：化合物a、化合物b儀器：流式細(xì)胞儀，全自動(dòng)酶標(biāo)儀，co2培養(yǎng)箱，96孔培養(yǎng)板。2.2mtt法評(píng)價(jià)肝星狀細(xì)胞(lx-2細(xì)胞)的增殖取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后，用含10%fbs的dmem溶液重新懸浮，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，將稀釋為含有5×106/l個(gè)lx-2細(xì)胞的懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔接種4000個(gè)，待細(xì)胞長(zhǎng)成至亞層，即可用于實(shí)驗(yàn)，選擇長(zhǎng)成對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，換去原培養(yǎng)液，然后加入不同濃度的各代謝產(chǎn)物同時(shí)加入tgf-β12.5ng/ml，37oc，50ml/lco2條件下培養(yǎng)24h，孵育結(jié)束后，加入mtt溶液，4h后1000rpm/min離心15min，棄上清，每孔再加入dmso溶液100μl在37℃下恒溫20min，于酶聯(lián)免疫儀在波長(zhǎng)490nm處測(cè)od值。每個(gè)藥物濃度重復(fù)測(cè)5次。inhibitionofcellviability%=(【"modea"】_"490""-藥物組"a_490)/("mode""a"_"490")×100%2.3化合物對(duì)活化肝星狀細(xì)胞的抑制化合物a在濃度為10μg/ml時(shí)對(duì)活化的肝星狀細(xì)胞有一定抑制作用，與模型組相比，具有顯著性差異（p＜0.01）；化合物b在濃度為20μg/ml時(shí)對(duì)活化的肝星狀細(xì)胞有一定抑制作用，與模型組相比，具有顯著性差異（p＜0.01）。結(jié)論：兩個(gè)產(chǎn)物a和b均表現(xiàn)出了對(duì)損傷的hl-7702細(xì)胞有保護(hù)作用，及對(duì)活化的肝星狀細(xì)胞的抑制作用，而它們的底物對(duì)活化的肝星狀細(xì)胞沒有抑制作用。實(shí)施例7化合物a的片劑的制備處方：化合物a1mg，淀粉94mg，硬脂酸鎂5mg。制備工藝：取化合物a過篩，加淀粉、硬脂酸鎂混合均勻，制成顆粒，干燥，壓片，即得。實(shí)施例8化合物b的片劑的制備處方：化合物b1mg，淀粉94mg，硬脂酸鎂5mg。制備工藝：取化合物b過篩，加淀粉、硬脂酸鎂混合均勻，制成顆粒，干燥，壓片，即得。最后有必要在此說明的是：上述內(nèi)容只用于對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容做出的一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍?！　equencelisting　　<110>上海中醫(yī)藥大學(xué)　　<120>一種采用滇龍膽內(nèi)生真菌進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的方法　　<160>1　　<170>patentinversion3.3　　<210>1　　<211>1085　　<212>dna　　<213>fusariumoxysporum　　<400>1　　taccccgacctgcgaatggctcattatataagttatcgtttatttgaaaaaggatactac60　　ttggataaccgtggtaattctagagctaatacatgctaaaaatcccgacttcggaaggga120　　tgtatttattagattaaaaaccaatgcccttcggggctcactggtgattcatgataactc180　　ctcgaatcgcatggccttgtgccggcgatggttcattcaaatttcttccctatcaacttt240　　cgatgtttgggtattggccaaacatggttgcaacgggtaacggagggttagggctcgacc300　　ccggagaaggagcctgagaaacggctactacatccaaggaaggcagcaggcgcgcaaatt360　　acccaatcccgacacggggaggtagtgacaataaatactgttttagggctcttttgggtc420　　ttgtaattggaatgagtacaatttaaatcccttaacgaggaacaattggagggcaagtct480　　ggtgccagcagccgcggtaattccagctccaatagcgtatattaaagttgttgtggttaa540　　aaagctcgtagttgaaccttgggcctggctggccggtccgcctcaccgcgtgtactggtc600　　cggccgggcctttccctctgtggaaccccatgcccttcactgggtgtggcggggaaacag660　　gacttttactgtgaaaaaattagagtgctccaggcaggcctatgctcgaatacattagca720　　tggaataatagaataggacgtgtggttctattttgttggtttctaggaccgccgtaatga780　　ttaatagggacagtcgggggcatcagtattcaattgtcagaggtgaaaattcttggattt840　　aatggaaactaactactgcgaaaagccatttgccaaggatgttttcattaatcaggaacg900　　aaagttaggggatcgaaaacgatcagataccgtcgtagtctaaccataaactatgccgac960　　tagggatcggacggtgttaatttttgacccgtttcggctcccttacgagaaaatcaaaat1020　　gccttggcttccaggggaagttaggttccgcaggctgaaaccttcatgaattgacgaaac1080gcact1085當(dāng)前第1頁(yè)12