本發(fā)明涉及一種高熱穩(wěn)定性中華鱉副產(chǎn)物膠原蛋白的制備方法，屬于膠原蛋白制備技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

近年來，由于膠原蛋白越來越多地用于醫(yī)藥、食品、高檔化妝品、生物肥料等工業(yè)領(lǐng)域，造成市場供不應(yīng)求。目前，工業(yè)膠原蛋白主要來源于牛、豬等陸產(chǎn)動物。由于畜產(chǎn)動物中重大疾病的頻繁發(fā)生，如牛的海綿狀腦病(瘋牛病)；豬的口蹄疫等，使用戶對膠原蛋白的安全性產(chǎn)生懷疑。

實際上，水產(chǎn)動物的皮、骨、鰭等含豐富的膠原蛋白，而且是安全的膠原蛋白的來源。從水產(chǎn)動物中提取膠原蛋白并對其進行深入研究在國外已相當普遍。中華鱉(pelodiscussinensiswiegmann)是我國傳統(tǒng)的名貴水產(chǎn)品，俗稱甲魚、團魚、水魚、王八、神守等。鱉類的生理活性物質(zhì)及其抗癌藥品、保健食品的開發(fā)是研究的熱點。據(jù)世界糧農(nóng)組織統(tǒng)計,我國2013年中華鱉產(chǎn)量347587t，按比例計算大約有43000t的殼、骨下腳料。有關(guān)中華鱉裙邊膠原蛋白的研究已有報道，但關(guān)于含鈣組織如中華鱉殼、骨中膠原蛋白的研究報道極少。如果這些下腳料能得到有效利用，將會為企業(yè)帶來可觀的經(jīng)濟效益。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服上述不足之處，提供一種高熱穩(wěn)定性中華鱉副產(chǎn)物膠原蛋白的制備方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案，一種高熱穩(wěn)定性中華鱉副產(chǎn)物膠原蛋白的制備方法，步驟如下：

(1)清洗：取中華鱉殼，徹底清除附著的肌肉后立即使用或置于-20℃冰箱中待用；

(2)脫鹽：中華鱉殼充分剁碎后，按照料液比1：6～8g/ml加入0.3～0.7mol/l的鹽酸溶液，溫度10～20℃；靜置放置，每隔1～3h換液1次；換液3～5次后，用水清洗至洗出液呈中性，收集得到脫鹽中華鱉殼，冷凍干燥24～48h備用；

(3)堿液浸泡：用步驟(2)所得脫鹽中華鱉殼質(zhì)量15～25倍的0.05～0.15mol/l的naoh溶液于20℃下浸泡3～5h；

(4)醇浸泡：取步驟(3)所得中華鱉殼用蒸餾水反復(fù)洗滌，充分瀝干后加入中華鱉殼質(zhì)量計15～25倍的質(zhì)量濃度為10％的異丙醇溶液，于20～25℃下浸泡12～24h，以去除脂肪；

(5)超聲酶提：步驟(4)所得中華鱉殼經(jīng)蒸餾水反復(fù)洗滌，瀝干后再加入以中華鱉殼質(zhì)量計15～25倍的0.3～0.7mol/l的乙酸溶液，在超聲波100～200w下預(yù)處理4～8min，然后添加100～200u/g的胃蛋白酶，并在37℃下磁力攪拌3～5h，以未進行超聲處理的酶提膠原蛋白進行對照；

(6)后處理：在0～8℃下，以8000～12000×g離心25～35min后得上清液即為粗膠原蛋白；

(7)重復(fù)鹽析：取步驟(6)所得粗膠原蛋白加入nacl至溶液終濃度為0.8～1.0mol/l，同時析出絮狀沉淀，于4℃，5000～10000×g離心10～20min得沉淀物，用0.5mol/l冰醋酸重新溶解，重復(fù)鹽析一次，5000～10000×g離心10～20min得沉淀物即為鹽析后的膠原蛋白；

(8)透析：對步驟(7)所得膠原蛋白用0.3～0.7mol/l乙酸溶解，在0.05～0.15mol/l乙酸中透析24～48h，每6～10h更換一次透析液，冷凍干燥后置-40℃冰箱中待用，即得產(chǎn)品高熱穩(wěn)定性中華鱉副產(chǎn)物膠原蛋白。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明采用的超聲輔助酶提工藝操作簡單，既能有效縮短提取時間，又能獲得具有良好熱穩(wěn)定性能的膠原蛋白,而且對環(huán)境的污染也較小。此外，還可充分有效開發(fā)和利用中華鱉副產(chǎn)物，避免資源的浪費，提高企業(yè)經(jīng)濟效益。

附圖說明

圖1是常規(guī)酶提和超聲輔助酶提膠原蛋白的分數(shù)粘度變化趨勢。

具體實施方式

實施例1

一種高熱穩(wěn)定性中華鱉副產(chǎn)物膠原蛋白的制備方法，步驟如下：

(1)清洗：取中華鱉殼，徹底清除附著的肌肉后立即使用或置于-20℃冰箱中待用；

(2)脫鹽：中華鱉殼充分剁碎后，按照料液比1：6g/ml加入0.3mol/l的鹽酸溶液，溫度10℃；靜置放置，每隔1h換液1次；換液5次后，用水清洗至洗出液呈中性，收集得到脫鹽中華鱉殼，冷凍干燥24h備用；

(3)堿液浸泡：用步驟(2)所得脫鹽中華鱉殼質(zhì)量15倍的0.15mol/l的naoh溶液于20℃下浸泡3h；

(4)醇浸泡：取步驟(3)所得中華鱉殼用蒸餾水反復(fù)洗滌，充分瀝干后加入中華鱉殼質(zhì)量計15倍的質(zhì)量濃度為10％的異丙醇溶液，于20℃下浸泡24h，以去除脂肪；

(5)超聲酶提：步驟(4)所得中華鱉殼經(jīng)蒸餾水反復(fù)洗滌，瀝干后再加入以中華鱉殼質(zhì)量計15倍的0.7mol/l的乙酸溶液，在超聲波100w下預(yù)處理4min，然后添加200u/g的胃蛋白酶，并在37℃下磁力攪拌3h，以未進行超聲處理的酶提膠原蛋白進行對照；

(6)后處理：在0℃下，以8000×g離心35min后得上清液即為粗膠原蛋白；

(7)重復(fù)鹽析：取步驟(6)所得粗膠原蛋白加入nacl至溶液終濃度為0.8mol/l，同時析出絮狀沉淀，于4℃，10000×g離心10min得沉淀物，用0.5mol/l冰醋酸重新溶解，重復(fù)鹽析一次，5000×g離心20min得沉淀物即為鹽析后的膠原蛋白；

(8)透析：對步驟(7)所得膠原蛋白用0.3mol/l乙酸溶解，在0.15mol/l乙酸中透析24h，每10h更換一次透析液，冷凍干燥后置-40℃冰箱中待用，即得產(chǎn)品高熱穩(wěn)定性中華鱉副產(chǎn)物膠原蛋白。

實施例2

一種高熱穩(wěn)定性中華鱉副產(chǎn)物膠原蛋白的制備方法，其特征是步驟如下：

(1)清洗：取中華鱉殼，徹底清除附著的肌肉后立即使用或置于-20℃冰箱中待用；

(2)脫鹽：中華鱉殼充分剁碎后，按照料液比1：8g/ml加入0.3mol/l的鹽酸溶液，溫度20℃；靜置放置，每隔1h換液1次；換液3次后，用水清洗至洗出液呈中性，收集得到脫鹽中華鱉殼，冷凍干燥24h備用；

(3)堿液浸泡：用步驟(2)所得脫鹽中華鱉殼質(zhì)量25倍的0.05mol/l的naoh溶液于20℃下浸泡3h；

(4)醇浸泡：取步驟(3)所得中華鱉殼用蒸餾水反復(fù)洗滌，充分瀝干后加入中華鱉殼質(zhì)量計25倍的質(zhì)量濃度為10％的異丙醇溶液，于20℃下浸泡12h，以去除脂肪；

(5)超聲酶提：步驟(4)所得中華鱉殼經(jīng)蒸餾水反復(fù)洗滌，瀝干后再加入以中華鱉殼質(zhì)量計25倍的0.3mol/l的乙酸溶液，在超聲波100w下預(yù)處理8min，然后添加200u/g的胃蛋白酶，并在37℃下磁力攪拌3h，以未進行超聲處理的酶提膠原蛋白進行對照；

(6)后處理：在8℃下，以8000×g離心25min后得上清液即為粗膠原蛋白；

(7)重復(fù)鹽析：取步驟(6)所得粗膠原蛋白加入nacl至溶液終濃度為1.0mol/l，同時析出絮狀沉淀，于4℃，10000×g離心10min得沉淀物，用0.5mol/l冰醋酸重新溶解，重復(fù)鹽析一次，10000×g離心20min得沉淀物即為鹽析后的膠原蛋白；

(8)透析：對步驟(7)所得膠原蛋白用0.7mol/l乙酸溶解，在0.05mol/l乙酸中透析48h，每10h更換一次透析液，冷凍干燥后置-40℃冰箱中待用，即得產(chǎn)品高熱穩(wěn)定性中華鱉副產(chǎn)物膠原蛋白。

實施例3

一種高熱穩(wěn)定性中華鱉副產(chǎn)物膠原蛋白的制備方法，其特征是步驟如下：

(1)清洗：取中華鱉殼，徹底清除附著的肌肉后立即使用或置于-20℃冰箱中待用；

(2)脫鹽：中華鱉殼充分剁碎后，按照料液比1：7g/ml加入0.5mol/l的鹽酸溶液，溫度15℃；靜置放置，每隔2h換液1次；換液4次后，用水清洗至洗出液呈中性，收集得到脫鹽中華鱉殼，冷凍干燥34h備用；

(3)堿液浸泡：用步驟(2)所得脫鹽中華鱉殼質(zhì)量20倍的0.1mol/l的naoh溶液于20℃下浸泡4h；

(4)醇浸泡：取步驟(3)所得中華鱉殼用蒸餾水反復(fù)洗滌，充分瀝干后加入中華鱉殼質(zhì)量計20倍的質(zhì)量濃度為10％的異丙醇溶液，于23℃下浸泡20h，以去除脂肪；

(5)超聲酶提：步驟(4)所得中華鱉殼經(jīng)蒸餾水反復(fù)洗滌，瀝干后再加入以中華鱉殼質(zhì)量計20倍的0.5mol/l的乙酸溶液，在超聲波150w下預(yù)處理6min，然后添加150u/g的胃蛋白酶，并在37℃下磁力攪拌4h，以未進行超聲處理的酶提膠原蛋白進行對照；

(6)后處理：在4℃下，以10000×g離心30min后得上清液即為粗膠原蛋白；

(7)重復(fù)鹽析：取步驟(6)所得粗膠原蛋白加入nacl至溶液終濃度為0.9mol/l，同時析出絮狀沉淀，于4℃，8000×g離心15min得沉淀物，用0.5mol/l冰醋酸重新溶解，重復(fù)鹽析一次，8000×g離心15min得沉淀物即為鹽析后的膠原蛋白；

(8)透析：對步驟(7)所得膠原蛋白用0.5mol/l乙酸溶解，在0.1mol/l乙酸中透析36h，每8h更換一次透析液，冷凍干燥后置-40℃冰箱中待用，即得產(chǎn)品高熱穩(wěn)定性中華鱉副產(chǎn)物膠原蛋白。

應(yīng)用實施例1熱變性溫度(td)的測定

通過測定膠原蛋白溶液分數(shù)粘度的變化來確定其熱變性溫度。取一定量的膠原蛋白樣品溶于0.1mol/l的乙酸中的配制成0.1％(m/v)濃度的溶液，將膠原蛋白溶液置于ostwald粘度計中，再將粘度計浸入15℃的水浴中后，保持30min，使得膠原溶液達到15℃。然后將溫度從15℃逐步升高至50℃，用ostwald粘度計測定膠原蛋白溶液在15-50℃(間隔5℃)區(qū)間內(nèi)的粘度，各溫度保持恒溫30min，并進行8次實驗，取平均值。然后，利用公式計算每個溫度的分數(shù)粘度。繪制分數(shù)粘度-溫度曲線，td值為該曲線線性部分的中點。

式中：t為任意時間的溫度，℃；t0為0min時的溫度，℃。

實驗結(jié)果如圖1所示，常規(guī)酶提中華鱉殼膠原蛋白的熱變性溫度大約為35.3℃，而超聲輔助酶提中華鱉殼得到的膠原蛋白的熱變性溫度為38.5℃左右。水生動物由于其生活的環(huán)境，一般情況下的熱變形溫度均比陸生哺乳動物低7～12℃，以上試驗方法得到的膠原蛋白的熱變形溫度已接近陸生哺乳動物，因此，超聲輔助酶提所得的膠原蛋白熱穩(wěn)定性較好，可在生物材料、制藥等領(lǐng)域有潛在的應(yīng)用價值。