本發(fā)明涉及生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，更具體地涉及一種基于同步光源的x-射線遺傳標(biāo)記探針及其制備方法以及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

顯微成像技術(shù)是細(xì)胞生命科學(xué)發(fā)展的主要推動(dòng)力之一。特別在過(guò)去的幾十年中，熒光顯微技術(shù)的出現(xiàn)結(jié)合標(biāo)記技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞內(nèi)各種生物大分子的示蹤，給探究細(xì)胞的各種生命活動(dòng)提供了革命性的手段。但是，亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)各種生物大分子大多處于10-100nm尺度，由于阿貝(ernstabbe)光學(xué)衍射極限的存在(200-300nm)，傳統(tǒng)的熒光顯微技術(shù)很難對(duì)100nm以下的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)重要生物分子進(jìn)行成像觀測(cè)。免疫電鏡技術(shù)或電鏡遺傳標(biāo)記技術(shù)可在極高的空間分辨率(<10nm)下對(duì)感興趣的生物分子進(jìn)行成像，但是由于電子的穿透深度較差(100-150nm)，并且實(shí)驗(yàn)中需要對(duì)細(xì)胞樣品進(jìn)行復(fù)雜的預(yù)處理，常常導(dǎo)致污染，并且超薄切片還會(huì)導(dǎo)致結(jié)構(gòu)信息的損失。上世紀(jì)九十年代發(fā)展的超分辨熒光成像技術(shù)在納米分辨細(xì)胞成像領(lǐng)域取得了長(zhǎng)足的發(fā)展。這類技術(shù)主要通過(guò)減小激光焦點(diǎn)的尺寸(以受激發(fā)射損耗顯微技術(shù)sted為代表)或單分子定位和位置重構(gòu)提高分辨率(以隨機(jī)光學(xué)重建顯微技術(shù)storm為代表)。但是，這些技術(shù)仍普遍存在成像速度慢，難以實(shí)現(xiàn)對(duì)多種生物分子同時(shí)標(biāo)記等問(wèn)題。并且，超分辨熒光成像大多只能對(duì)標(biāo)記的蛋白分子成像，缺乏對(duì)亞細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察的手段。

基于同步輻射的x射線成像技術(shù)是納米分辨細(xì)胞成像領(lǐng)域的“第三條道路”。由于x射線的波長(zhǎng)在0.1-10nm范圍內(nèi)，因此其天然就是一種納米顯微成像技術(shù)，分辨率理論上能夠達(dá)到數(shù)個(gè)納米。該技術(shù)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì):1)與電子束相比，x射線對(duì)生物樣品的穿透力更強(qiáng)，因此不需要經(jīng)過(guò)切片等處理就能對(duì)完整細(xì)胞進(jìn)行成像。2)x射線顯微技術(shù)能夠?qū)?xì)胞形貌結(jié)構(gòu)進(jìn)行自然襯度成像，較好地反映細(xì)胞的自然狀態(tài)。3)x射線顯微成像技術(shù)具有很好的能量分辨，能精確分辨很多元素的吸收譜。因此，結(jié)合x(chóng)射線敏感的納米探針，能夠給出多種生物大分子的細(xì)胞內(nèi)空間定位信息。目前，研究人員已經(jīng)嘗試在含金屬元素的納米顆粒上連接生物分子，賦予其對(duì)特異生物分子識(shí)別定位的功能。但是，這些工作中大多采用免疫標(biāo)記的原理，而細(xì)胞內(nèi)含有大量競(jìng)爭(zhēng)性生物分子，如何保證對(duì)感興趣蛋白(proteinofinterest,poi)的標(biāo)記特異性是一大瓶頸。并且，當(dāng)應(yīng)用多種納米顆粒-生物分子同時(shí)標(biāo)記多個(gè)蛋白分子時(shí)還會(huì)互相干擾，影響識(shí)別效率。因此，現(xiàn)階段迫切需要開(kāi)發(fā)高特異性的x射線探針，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)生物分子的精確識(shí)別和定位。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種基于同步光源的x-射線遺傳標(biāo)記探針及其制備方法以及應(yīng)用，從而解決現(xiàn)有x射線顯微成像技術(shù)還無(wú)法對(duì)細(xì)胞內(nèi)生物分子進(jìn)行高特異性識(shí)別和成像的問(wèn)題。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供一種基于同步光源的x-射線遺傳標(biāo)記探針的制備方法，該制備方法包括以下步驟：1)構(gòu)建同時(shí)包括酶和目的蛋白的融合表達(dá)質(zhì)粒，并將所述融合表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞；2)使用戊二醛固定液冰浴固定所述細(xì)胞；3)加入底物分子反應(yīng)液，冰浴反應(yīng)；4)去除反應(yīng)液，使用固定液固定細(xì)胞；以及5)同步x射線成像觀察；其中，所述酶具有針對(duì)所述底物的催化活性。

根據(jù)本發(fā)明所提供的方法，其工作原理為：質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)同時(shí)表達(dá)具有催化活性的酶和目的蛋白，酶催化底物分子聚合，生成x射線可見(jiàn)的聚合物，從而實(shí)現(xiàn)目的蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位的觀察。

其中，步驟1)中的所述酶包括：抗壞血酸過(guò)氧化物酶(apex、apex2)、迷你單線態(tài)氧產(chǎn)生蛋白(minisog)、四半胱氨酸肽(tetracysteine)或辣根過(guò)氧化物酶(hrp)等等。最優(yōu)選為apex2。其中，apex、apex2、minisog、tetracysteine適用于細(xì)胞內(nèi)任意蛋白，hrp最適用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白。

步驟1)中所采用的轉(zhuǎn)染試劑為lipofectamine3000transfectionreagent、lipofectamine2000transfectionreagent、lipofectamine2000cdtransfectionreagent、lipofectamineltxreagent或jetprimetransfectionreagent。

其中的轉(zhuǎn)染方法為常規(guī)方法，轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒的比例為3:1～1:1，最佳地為1.5:1。轉(zhuǎn)染時(shí)間為12～48h，最佳地為24h。

所述細(xì)胞為常規(guī)傳代或原代培養(yǎng)的細(xì)胞株，并在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中根據(jù)細(xì)胞的種屬來(lái)源在構(gòu)建融合表達(dá)質(zhì)粒時(shí)設(shè)計(jì)表達(dá)具有催化活性的酶和目的蛋白的dna序列。優(yōu)選地，可根據(jù)不同物種在密碼子使用上的偏好性，對(duì)dna序列進(jìn)行設(shè)計(jì)與優(yōu)化，使其在細(xì)胞中更好地表達(dá)。

步驟2)中所使用的固定液僅限戊二醛，因?yàn)槲於┛梢宰畲蟪潭鹊乇３置傅拇呋钚?。所述戊二醛固定液的濃度?.5～3％。其中較佳的為2％。固定時(shí)間為20～60min，最佳為40min。

步驟3)中的所述底物分子為3,3'-二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽(dab)、金屬增強(qiáng)型dab(metalenhanceddab)或enzmet。

針對(duì)不同的酶，可考慮在底物分子反應(yīng)液中增加雙氧水的成分。例如，apex和apex2可以催化h2o2產(chǎn)生¹o2，¹o2可以進(jìn)一步催化底物分子聚合，因此對(duì)于apex和apex2來(lái)說(shuō)，底物分子反應(yīng)液中必須含有雙氧水。對(duì)于minisog和tetracysteine來(lái)說(shuō)，雙氧水則并非必需成分。

其中，步驟3)中的冰浴反應(yīng)時(shí)間為30s～2h。根據(jù)不同目的蛋白選擇最優(yōu)冰浴反應(yīng)時(shí)間。

步驟4)中所使用的固定液可選地是多聚甲醛、戊二醛、乙醇、甲醇、冰醋酸、丙酮或福爾馬林等等。其中，最優(yōu)選地為多聚甲醛，特別是4％多聚甲醛固定液。多聚甲醛固定液使得細(xì)胞內(nèi)的蛋白固定，保持其結(jié)構(gòu)，利于進(jìn)一步的脫水和觀察。

應(yīng)當(dāng)理解，步驟2)中所使用的固定液僅限戊二醛，而步驟4)中所使用的固定液并不僅限戊二醛，還可以是其他種類的固定液，但是最優(yōu)選地是多聚甲醛。

步驟4)中固定液的固定時(shí)間為10min～2h。較佳時(shí)間為15min。

步驟5)中所述同步x射線成像能量為280～20000ev，根據(jù)不同的底物分子選擇不同的入射能量。

其中，dab最優(yōu)成像能量為350～850ev，金屬增強(qiáng)型dab最優(yōu)成像能量為500～8000ev。enzmet最優(yōu)成像能量為500～7000ev。

步驟5)中所述同步x射線成像的分辨率可以達(dá)到20～200nm。

根據(jù)本發(fā)明的第二方面，還提供一種根據(jù)上述制備方法制得的基于同步光源的x-射線遺傳標(biāo)記探針。

根據(jù)本發(fā)明的第三方面，還提供一種基于同步光源的x-射線遺傳標(biāo)記探針在細(xì)胞成像中的應(yīng)用。

該應(yīng)用可包括細(xì)胞生命活動(dòng)所涉及的任何蛋白的識(shí)別及成像。

本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：1)現(xiàn)有的電鏡遺傳標(biāo)記主要應(yīng)用鋨酸染色形成的高電子密度產(chǎn)物進(jìn)行成像，屬于物理反應(yīng)，而且該過(guò)程易引入高電子密度的雜質(zhì)，對(duì)區(qū)分poi的空間分布形成干擾。而本發(fā)明提供的方法應(yīng)用同步x射線對(duì)該聚合物的天然吸收進(jìn)行成像，本質(zhì)上屬于化學(xué)反應(yīng)，可使dab分子聚合到很小的區(qū)域(幾十甚至幾納米)，特異性非常好。2)目前已有的同步x射線敏感的納米探針大都應(yīng)用納米顆粒-生物分子復(fù)合物，通過(guò)免疫染色過(guò)程識(shí)別細(xì)胞內(nèi)poi，標(biāo)記過(guò)程受到細(xì)胞內(nèi)大量競(jìng)爭(zhēng)性生物分子的影響，無(wú)法確保良好的特異性。并且，基于x射線的蛋白免疫成像技術(shù)也無(wú)法實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞在傳代分裂中功能蛋白定位和分布的變化。該方法基于遺傳標(biāo)記的原理，因此在細(xì)胞分裂傳代后也能保持非常好的特異性，不會(huì)丟失信號(hào)。3)應(yīng)用先進(jìn)的同步x射線進(jìn)行成像，穿透深度較深，不但能對(duì)完整細(xì)胞進(jìn)行成像，而且可達(dá)到組織水平。目前，組織甚至器官水平的高特異性遺傳標(biāo)記成像是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一大空白，而我們發(fā)展的基于同步光源的x-射線遺傳標(biāo)記探針預(yù)期能在該領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景。

總之，本發(fā)明提供了一種能對(duì)細(xì)胞內(nèi)生物分子進(jìn)行高特異性識(shí)別和高分辨成像的方法，具有良好的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1是同步x射線遺傳探針對(duì)細(xì)胞連接蛋白的標(biāo)記成像圖；

圖2a是同步x射線遺傳探針對(duì)細(xì)胞微管蛋白的標(biāo)記成像圖，圖2b是對(duì)圖2a中虛線框的放大圖；

圖3a和圖3b是x射線遺傳探針與電鏡遺傳探針在同步x射線細(xì)胞成像中的應(yīng)用比較圖，以細(xì)胞連接蛋白為例，圖3a為電鏡遺傳標(biāo)記，圖3b為x射線遺傳標(biāo)記，圓圈指示高電子密度的雜質(zhì)；

圖4a、圖4b、圖4c是基于apex2、minisog、tetracysteine的同步x射線遺傳標(biāo)記探針在細(xì)胞成像中的應(yīng)用比較圖，以細(xì)胞連接蛋白為例，圖4a為apex2，圖4b為minisog，圖4c為tetracysteine。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而非用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說(shuō)明書(shū)選擇。

本專利選擇人hek293t細(xì)胞，催化活性的酶以apex2為主，目的蛋白選擇相鄰細(xì)胞間的連接蛋白cx43和細(xì)胞內(nèi)微管蛋白為代表，底物分子選擇dab為代表，構(gòu)建x-射線遺傳標(biāo)記探針并應(yīng)用于該細(xì)胞的成像研究，以下實(shí)施例具體說(shuō)明本專利的實(shí)施效果。

實(shí)施例1同步x射線遺傳標(biāo)記探針的制備及在細(xì)胞連接蛋白成像中的應(yīng)用

pcdna3-cx43-apex2質(zhì)粒的構(gòu)建。該質(zhì)粒的構(gòu)建過(guò)程采用常規(guī)分子生物學(xué)手段進(jìn)行，具體如下：首先，根據(jù)人源的cx43蛋白序列，使用人源偏性的密碼子優(yōu)化了其dna序列并合成全序列，全序列由上海權(quán)陽(yáng)生物科技有限公司合成。apex2序列克隆自pegfp-apex2-tubulin質(zhì)粒(addgeneplasmid#66171)。使用q5定點(diǎn)突變?cè)噭┖?購(gòu)自neb，貨號(hào)e0552s)將該cx43序列和apex2序列之間連接linker序列。然后將cx43-apex2序列克隆進(jìn)入pcdna3哺乳動(dòng)物表達(dá)載體骨架中，從而構(gòu)建出pcdna3-cx43-apex2質(zhì)粒。測(cè)序并驗(yàn)證質(zhì)粒序列。該質(zhì)粒序列如seqidno:1所示。其中，pcdna3是一種商業(yè)化的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體骨架。將cx43-apex2融合蛋白的序列克隆進(jìn)入pcdna3載體后，會(huì)驅(qū)動(dòng)cx43-apex2融合蛋白的表達(dá)。在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中根據(jù)細(xì)胞的種屬來(lái)源在構(gòu)建融合表達(dá)質(zhì)粒時(shí)設(shè)計(jì)相應(yīng)的dna序列為cx43的序列和apex2的序列。

hek293t細(xì)胞的培養(yǎng)。其中，hek293t細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。采用dmem(含10％fbs)培養(yǎng)基，37℃，5％co2，飽和濕度培養(yǎng)。將氮化硅窗置于細(xì)胞培養(yǎng)板中，紫外滅菌，2×10⁵細(xì)胞/孔的密度接種，貼壁過(guò)夜。

將pcdna3-cx43-apex2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入hek293t細(xì)胞。使用脂質(zhì)體lipo3000法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每孔加入0.75μllipo3000，500ngpcdna3-cx43-apex2質(zhì)粒和1μlp3000。24h后去除培養(yǎng)基，2％戊二醛冰浴固定。加入含有0.03％h2o2的3,3'-二氨基聯(lián)苯胺(dab)反應(yīng)液，冰浴反應(yīng)1min，去除孔內(nèi)反應(yīng)液，4％多聚甲醛固定。梯度乙醇脫水，同步x射線成像觀察。

x射線成像實(shí)驗(yàn)在上海光源bl08u1軟x射線譜學(xué)顯微線站進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)方法為軟x射線透射成像。x射線經(jīng)波蕩器引出，經(jīng)過(guò)平面光柵單色器單色化后由波帶片聚焦到樣品上，空間分辨率為30nm。樣品放置在真空樣品室中，選取x射線入射能量為525ev。移動(dòng)運(yùn)動(dòng)電機(jī)，完成細(xì)胞樣品的尋找、對(duì)焦，然后進(jìn)行x射線成像。獲得清晰的相鄰細(xì)胞連接處連接蛋白的圖像，成像分辨率為30nm。

標(biāo)記結(jié)束后，可在同步x射線顯微鏡下清楚地觀察到相鄰細(xì)胞連接處連接蛋白的定位分布。結(jié)果見(jiàn)圖1，其中虛線方框內(nèi)黑色陰影即為細(xì)胞連接蛋白部分。

實(shí)施例2同步x射線遺傳標(biāo)記探針的制備及在細(xì)胞內(nèi)微管蛋白成像中的應(yīng)用

pegfp-apex2-tubulin質(zhì)粒(addgeneplasmid#66171)購(gòu)自addgene。該質(zhì)粒序列如seqidno:2所示。

hela細(xì)胞的培養(yǎng)。其中，hela細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。mem(含10％fbs)培養(yǎng)基，37℃，5％co2，飽和濕度培養(yǎng)。將氮化硅窗置于細(xì)胞培養(yǎng)板中，紫外滅菌，8×10⁴細(xì)胞/孔的密度接種，貼壁過(guò)夜。

將pegfp-apex2-tubulin質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入hela細(xì)胞。使用脂質(zhì)體lipo3000法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每孔加入0.75μllipo3000，500ngpcdna3-cx43-apex2質(zhì)粒和1μlp3000。24h后去除培養(yǎng)基，2％戊二醛冰浴固定。加入含有0.03％h2o2的3,3'-二氨基聯(lián)苯胺(dab)反應(yīng)液，冰浴反應(yīng)1h，去除孔內(nèi)反應(yīng)液，4％多聚甲醛固定。梯度乙醇脫水，同步x射線成像觀察，方法與實(shí)施例1相同。

標(biāo)記結(jié)束后，可在同步x射線顯微鏡下清楚地觀察到細(xì)胞內(nèi)微管蛋白的分布。結(jié)果見(jiàn)圖2a和圖2b，其中，圖2b為圖2a中虛線框的放大圖，特別是從圖2b中可以清楚地觀察到細(xì)胞內(nèi)微管蛋白的分布。

實(shí)施例3電鏡遺傳探針的制備與x射線遺傳探針在同步x射線細(xì)胞成像中的應(yīng)用比較

將pcdna3-cx43-apex2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入hek293t細(xì)胞。其中，hek293t細(xì)胞培養(yǎng)和pcdna3-cx43-apex2質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染方法與實(shí)施例1相同。

電鏡遺傳探針的標(biāo)記方法為：轉(zhuǎn)染結(jié)束后，除去孔內(nèi)培養(yǎng)基，使用2％戊二醛冰浴固定細(xì)胞。加入含0.03％h2o2的dab反應(yīng)液，冰浴反應(yīng)1min。去除孔內(nèi)反應(yīng)液，加入2％鋨酸，冰浴復(fù)染1h。去除孔內(nèi)反應(yīng)液，梯度乙醇脫水，同步x射線成像觀察，方法與實(shí)施例1相同。

x射線遺傳探針的標(biāo)記方法以及x射線成像觀察方法和實(shí)施例1相同。

以細(xì)胞連接蛋白為例，標(biāo)記結(jié)束后，結(jié)果見(jiàn)圖3a和圖3b。同步x射線顯微鏡下，電鏡遺傳探針標(biāo)記方法難以區(qū)分細(xì)胞和相鄰細(xì)胞間連接蛋白的分布，此外，鋨酸復(fù)染引入了很多具有高電子密度的雜質(zhì)，干擾了對(duì)目的蛋白定位分布的正確觀察，如圖3a所示。應(yīng)用x射線遺傳標(biāo)記方法則能在x射線顯微鏡下很清楚地觀察到目的蛋白的定位分布，并且沒(méi)有任何高電子密度的雜質(zhì)干擾，如圖3b所示。

實(shí)施例4基于apex2、minisog、tetracysteine的同步x射線遺傳標(biāo)記探針在細(xì)胞成像中的應(yīng)用比較

分別構(gòu)建pcdna3-cx43-minisog和pcdna3-cx43-tetracyseine質(zhì)粒。然后分別將pcdna3-cx43-minisog和pcdna3-cx43-tetracyseine質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入hek293t細(xì)胞。其中，hek293t細(xì)胞培養(yǎng)以及各質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染方法和實(shí)施例1相同。

轉(zhuǎn)染結(jié)束后，基于apex2的x射線遺傳標(biāo)記方法和x射線成像觀察方法和實(shí)施例1相同。

基于minisog的x射線遺傳標(biāo)記方法為：除去孔內(nèi)培養(yǎng)基，使用2％戊二醛冰浴固定細(xì)胞。加入dab反應(yīng)液，向反應(yīng)液中緩慢通入氧氣。使用150w，488nm激光照射感興趣的區(qū)域2min。去除孔內(nèi)反應(yīng)液，4％多聚甲醛固定。梯度乙醇脫水，同步x射線成像觀察，方法與實(shí)施例1相同。

基于tetracyseine的x射線遺傳標(biāo)記方法為：除去孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入reash-edt2。使用2％戊二醛冰浴固定細(xì)胞。加入dab反應(yīng)液，向反應(yīng)液中緩慢通入氧氣。使用150w，585nm激光照射感興趣的區(qū)域10min。去除孔內(nèi)反應(yīng)液，4％多聚甲醛固定。梯度乙醇脫水，同步x射線成像觀察步驟與實(shí)施例1相同。

結(jié)果見(jiàn)圖4a、圖4b和圖4c。以細(xì)胞連接蛋白為例，標(biāo)記結(jié)束后，可在同步x射線顯微鏡下觀察到三種同步x射線遺傳標(biāo)記探針標(biāo)記的細(xì)胞連接蛋白的定位分布，其中，圖4a為apex2，圖4b為minisog，圖4c為tetracysteine。圖中可見(jiàn)，基于apex2的同步x射線遺傳標(biāo)記探針在細(xì)胞成像中的應(yīng)用效果明顯優(yōu)于其它兩種。

以上所述的，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非用以限定本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的上述實(shí)施例還可以做出各種變化。即凡是依據(jù)本發(fā)明申請(qǐng)的權(quán)利要求書(shū)及說(shuō)明書(shū)內(nèi)容所作的簡(jiǎn)單、等效變化與修飾，皆落入本發(fā)明專利的權(quán)利要求保護(hù)范圍。本發(fā)明未詳盡描述的均為常規(guī)技術(shù)內(nèi)容。

序列表

<110>中國(guó)科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所

<120>一種基于同步光源的x-射線遺傳標(biāo)記探針及其制備方法以及應(yīng)用

<160>2

<210>1

<211>7295

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>pcdna3-cx43-apex2質(zhì)粒

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