本發(fā)明屬于水產(chǎn)品加工技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種納米鋅牡蠣粉的制備方法。

背景技術(shù)：

根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，牡蠣是鋅含量最高的食物原料，是著名的補(bǔ)鋅食物。由于鋅在人體生長(zhǎng)發(fā)育、生殖遺傳等重要生理過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用，且缺鋅癥多發(fā)，因此利用牡蠣開(kāi)發(fā)補(bǔ)鋅制品得到研究者們的關(guān)注。目前關(guān)于此方面的研究不是很多，但全都集中在用牡蠣(多)肽或蛋白酶解物與硫酸鋅結(jié)合形成螯合物。

近年來(lái)研究表明納米型礦物元素補(bǔ)充劑具有吸收率高的特點(diǎn)。由于利用蛋白肽、多糖等生物分子調(diào)控礦物元素納米化的生物模板法具有反應(yīng)條件溫和的優(yōu)勢(shì)而越來(lái)越受到研究者的重視。目前研究表明鈣、鐵、硒能在蛋白肽或多糖的作用下形成納米粒，然而蛋白肽與鋅是否能形成納米粒還未見(jiàn)報(bào)道，上述的牡蠣肽鋅螯合物是否具有納米結(jié)構(gòu)也不清晰。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種納米鋅牡蠣粉的制備方法，通過(guò)該方法可制備粒徑范圍在28～102nm的牡蠣肽-鋅納米粒，即可制備納米鋅牡蠣粉。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供一種納米鋅牡蠣粉的制備方法，包括以下制備步驟：

1)牡蠣前處理：牡蠣去殼，清洗去除雜質(zhì)后，瀝干，組織搗碎，得到漿液，進(jìn)行脫脂處理，得脫脂牡蠣粉；

2)牡蠣酶解：將步驟1)所制的脫脂牡蠣粉配成水溶液，酶解，滅酶，冷卻，離心分離，取上清液真空濃縮后噴霧干燥，得牡蠣肽粉；

3)牡蠣肽的納米鋅化：將步驟2)所得牡蠣肽粉配成質(zhì)量濃度為0.3～0.5％的水溶液，再在室溫下加入硫酸鋅，加至硫酸鋅的終質(zhì)量濃度為0.5～0.9％，混合均勻，調(diào)節(jié)ph值至6.0～11.0進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)1～2h后，將反應(yīng)液真空濃縮、噴霧干燥后即得納米鋅牡蠣粉。

本發(fā)明的制備方法中，研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)同時(shí)調(diào)節(jié)硫酸鋅的終質(zhì)量溶液濃度和反應(yīng)時(shí)的ph值參數(shù)，才能夠制備得到納米粒。如果硫酸鋅的終質(zhì)量濃度過(guò)大或ph值過(guò)大，體系產(chǎn)生沉淀，當(dāng)硫酸鋅的終質(zhì)量濃度過(guò)小或ph值過(guò)小，體系基本澄清，都不能夠獲得納米粒。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述步驟1)中，脫脂處理具體為：用體積比為1:2～4的正己烷-無(wú)水乙醇混合溶劑萃取漿液，重復(fù)萃取2次，過(guò)濾除去脂肪，濾餅經(jīng)真空干燥，粉碎過(guò)100～150目篩。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述步驟1)中，脫脂處理過(guò)程中溶劑的加入量為漿液體積的2倍。本發(fā)明中，溶劑的加入量為漿液體積的2倍時(shí)，具有較好的脫脂效果，盡可能地避免了溶劑的浪費(fèi)，如果低于2倍效果不好，且重復(fù)次數(shù)必須增加，造成溶劑的浪費(fèi)，也延長(zhǎng)了制備周期。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述步驟1)中，脫脂處理過(guò)程中萃取條件為：溫度為45～55℃，萃取時(shí)間為8h。萃取時(shí)間如果少于8h，達(dá)不到脫脂最好效果，如果超過(guò)8h，則延長(zhǎng)了制備周期。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述步驟2)中，酶解具體步驟為：用胰蛋白酶在45～49℃，ph值為8.0～9.0條件下酶解1.5～2.5h。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述步驟2)中，胰蛋白酶的加入量為2500～3500u/g。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述步驟2)中，將步驟1)所制的脫脂牡蠣粉配成質(zhì)量濃度為2～2.5％的水溶液。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述步驟2)中，在6000～9000r/min轉(zhuǎn)速下離心分離15～20min。在這個(gè)條件下，獲得較好的分離效果。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述步驟3)中，硫酸鋅的終質(zhì)量濃度為0.9％。牡蠣肽粉水溶液中的硫酸鋅的終質(zhì)量濃度達(dá)到0.9％時(shí)，獲得較好的牡蠣肽-鋅納米粒，且顆粒分散較為均勻。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述步驟3)中，反應(yīng)的ph值為11.0。在ph值下進(jìn)行反應(yīng)，獲得較好的牡蠣肽-鋅納米粒，且較為均勻。

相對(duì)現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：

1、采用本發(fā)明方法可制備納米鋅牡蠣肽粉，通過(guò)粒徑分析儀檢測(cè)，牡蠣肽-鋅納米粒的大小在28～102nm范圍內(nèi)，穩(wěn)定而均勻地分散于溶液中。

2、本發(fā)明中，通過(guò)同時(shí)調(diào)節(jié)硫酸鋅的終質(zhì)量濃度和溶液ph值就可得到牡蠣肽-鋅納米粒，方法簡(jiǎn)單易行。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例3制得樣品的透射電鏡圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例。

實(shí)施例1

一種納米鋅牡蠣粉的制備方法，包括以下制備步驟：

1)牡蠣前處理：牡蠣去殼，清洗去除雜質(zhì)后，瀝干，組織搗碎，得到漿液，用漿液體積的2倍的體積比為1:2的正己烷-無(wú)水乙醇混合溶劑，在溫度為45℃下萃取漿液，重復(fù)萃取2次，每次萃取時(shí)間為8h，6層紗布過(guò)濾除去脂肪，濾餅經(jīng)真空干燥，粉碎過(guò)150目篩，得脫脂牡蠣粉；

2)牡蠣酶解：將步驟1)所制的脫脂牡蠣粉配成質(zhì)量濃度為2％的水溶液，加入量為3500u/g的胰蛋白酶在45℃，ph值為8.8條件下酶解1.5h，酶解完成后在95℃滅酶10min，冷卻，在9000r/min轉(zhuǎn)速下離心分離15min，取上清液真空濃縮后噴霧干燥，得牡蠣肽粉；

3)牡蠣肽的納米鋅化：將步驟2)所得牡蠣肽粉配成質(zhì)量濃度為0.4％的水溶液，再在室溫下加入硫酸鋅，加至硫酸鋅的終質(zhì)量濃度為0.5％，混合均勻，調(diào)節(jié)ph值至6.0進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)1h后，將反應(yīng)液真空濃縮、噴霧干燥后即得納米鋅牡蠣粉。

實(shí)施例2

一種納米鋅牡蠣粉的制備方法，包括以下制備步驟：

1)牡蠣前處理：牡蠣去殼，清洗去除雜質(zhì)后，瀝干，組織搗碎，得到漿液，用漿液體積的2倍的體積比為1:3的正己烷-無(wú)水乙醇混合溶劑，在溫度為50℃下萃取漿液，重復(fù)萃取2次，每次萃取時(shí)間為8h，6層紗布過(guò)濾除去脂肪，濾餅經(jīng)真空干燥，粉碎過(guò)150目篩，得脫脂牡蠣粉；

2)牡蠣酶解：將步驟1)所制的脫脂牡蠣粉配成質(zhì)量濃度為2.5％的水溶液，加入量為3000u/g的胰蛋白酶在47℃，ph值為8.5條件下酶解2.5h，酶解完成后在95℃滅酶10min，冷卻，在7000r/min轉(zhuǎn)速下離心分離17min，取上清液真空濃縮后噴霧干燥，得牡蠣肽粉；

3)牡蠣肽的納米鋅化：將步驟2)所得牡蠣肽粉配成質(zhì)量濃度為0.3％的水溶液，再在室溫下加入硫酸鋅，加至硫酸鋅的終質(zhì)量濃度為0.6％，混合均勻，調(diào)節(jié)ph值至6.5進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)1.5h后，將反應(yīng)液真空濃縮、噴霧干燥后即得納米鋅牡蠣粉。

實(shí)施例3

一種納米鋅牡蠣粉的制備方法，包括以下制備步驟：

1)牡蠣前處理：牡蠣去殼，清洗去除雜質(zhì)后，瀝干，組織搗碎，得到漿液，用漿液體積的2倍的體積比為1:3的正己烷-無(wú)水乙醇混合溶劑，在溫度為50℃下萃取漿液，重復(fù)萃取2次，每次萃取時(shí)間為8h，6層紗布過(guò)濾除去脂肪，濾餅經(jīng)真空干燥，粉碎過(guò)100目篩，得脫脂牡蠣粉；

2)牡蠣酶解：將步驟1)所制的脫脂牡蠣粉配成質(zhì)量濃度為2％的水溶液，加入量為3000u/g的胰蛋白酶在49℃，ph值為9.0條件下酶解2h，酶解完成后在95℃滅酶10min，冷卻，在8000r/min轉(zhuǎn)速下離心分離20min，取上清液真空濃縮后噴霧干燥，得牡蠣肽粉；

3)牡蠣肽的納米鋅化：將步驟2)所得牡蠣肽粉配成質(zhì)量濃度為0.35％的水溶液，再在室溫下加入硫酸鋅，加至硫酸鋅的終質(zhì)量濃度為0.9％，混合均勻，調(diào)節(jié)ph值至11.0進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)1h后，將反應(yīng)液真空濃縮、噴霧干燥后即得納米鋅牡蠣粉。

實(shí)施例4

一種納米鋅牡蠣粉的制備方法，包括以下制備步驟：

1)牡蠣前處理：牡蠣去殼，清洗去除雜質(zhì)后，瀝干，組織搗碎，得到漿液，用漿液體積的2倍的體積比為1:4的正己烷-無(wú)水乙醇混合溶劑，在溫度為55℃下萃取漿液，重復(fù)萃取2次，每次萃取時(shí)間為8h，6層紗布過(guò)濾除去脂肪，濾餅經(jīng)真空干燥，粉碎過(guò)100目篩，得脫脂牡蠣粉；

2)牡蠣酶解：將步驟1)所制的脫脂牡蠣粉配成質(zhì)量濃度為2.5％的水溶液，加入量為2500u/g的胰蛋白酶在48℃，ph值為8.0條件下酶解2h，酶解完成后在95℃滅酶10min，冷卻，在6000r/min轉(zhuǎn)速下離心分離18min，取上清液真空濃縮后噴霧干燥，得牡蠣肽粉；

3)牡蠣肽的納米鋅化：將步驟2)所得牡蠣肽粉配成質(zhì)量濃度為0.5％的水溶液，再在室溫下加入硫酸鋅，加至硫酸鋅的終質(zhì)量濃度為0.8％，混合均勻，調(diào)節(jié)ph值至7.0進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)2h后，將反應(yīng)液真空濃縮、噴霧干燥后即得納米鋅牡蠣粉。

實(shí)施例5

一種納米鋅牡蠣粉的制備方法，步驟3)中，調(diào)節(jié)ph值至8.0進(jìn)行反應(yīng)。其它步驟和參數(shù)同實(shí)施例3。

實(shí)施例6

一種納米鋅牡蠣粉的制備方法，步驟3)中，調(diào)節(jié)ph值至9.0進(jìn)行反應(yīng)。其它步驟和參數(shù)同實(shí)施例3。

實(shí)施例7

一種納米鋅牡蠣粉的制備方法，步驟3)中，調(diào)節(jié)ph值至10.0進(jìn)行反應(yīng)。其它步驟和參數(shù)同實(shí)施例3。

為了充分說(shuō)明本發(fā)明通過(guò)調(diào)節(jié)硫酸鋅的終質(zhì)量濃度和溶液ph值就可得到牡蠣肽-鋅納米粒，申請(qǐng)人進(jìn)行了如下篩選實(shí)驗(yàn)：

1、材料與儀器

材料:去殼鮮牡蠣：欽州仟仟萬(wàn)家超市；胰蛋白酶：酶活190ku/g，南寧龐博生物工程有限公司；實(shí)驗(yàn)所用其它試劑均為分析純及以上。

df-101s集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；gl-21m高速冷凍離心機(jī)：湘儀離心機(jī)儀器有限公司；phs-3c型精密ph計(jì)：上海雷磁儀器廠；uv-2550型紫外分光光度計(jì)：日本島津公司；zen3600粒徑分析儀:英國(guó)malvern公司；jem-1200ex透射電鏡：日本jeol公司。

2、實(shí)驗(yàn)方法

2.1納米粒形成初判按照本發(fā)明實(shí)施例3的步驟和參數(shù)制備牡蠣粉，其中，區(qū)別在于根據(jù)需要調(diào)整硫酸鋅的終質(zhì)量濃度和溶液反應(yīng)ph值，在600nm處測(cè)定其透光率。同時(shí)以對(duì)應(yīng)ph值下的同終質(zhì)量濃度鋅溶液為空白液，實(shí)施例3制備得到的牡蠣肽溶液為對(duì)照液，二者中透光率低者為基準(zhǔn)透光率，或其中之一產(chǎn)生渾濁或沉淀，則以另一個(gè)的透光率為基準(zhǔn)透光率。當(dāng)樣液不產(chǎn)生渾濁或沉淀且透光率比基準(zhǔn)透光率下降20％時(shí)，即初判納米粒形成。

2.2粒徑分析測(cè)定參數(shù)設(shè)置為：光源he-ne激光燈，波長(zhǎng)633nm，入射角173°，粘度1.0031，ri1.330，25±0.1℃，平衡時(shí)間60s，每個(gè)樣品掃描3次，取平均值。

2.3電鏡分析將待測(cè)樣液吸附在銅網(wǎng)上，自然風(fēng)干5～10min后用磷鎢酸負(fù)染，自然風(fēng)干后置于80kv透射電鏡上觀察。

3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1牡蠣肽-鋅納米粒形成初判

將含有0.1～0.9％硫酸鋅的牡蠣肽液分別調(diào)至ph3～11，測(cè)定樣液的透光率，具體見(jiàn)表1。

表1牡蠣肽與硫酸鋅混合溶液的透光率(％)

注：同一列上標(biāo)不同字母表示差異顯著(p<0.05)，下同；-表示渾濁或沉淀。

從表1可以看出，混合體系的透光率隨著ph的上升而增加，卻隨著硫酸鋅的終質(zhì)量濃度的上升而下降。根據(jù)納米粒形成的判定條件，將能夠形成納米粒的條件歸納在表2中。

由表2可知，牡蠣肽不能與低終質(zhì)量濃度的硫酸鋅(0.4％及以下)形成納米粒。當(dāng)硫酸鋅的終質(zhì)量濃度達(dá)到0.5％及以上時(shí)，牡蠣肽才能與硫酸鋅形成納米粒，而且要求ph最低為6.0，且隨著硫酸鋅的終質(zhì)量濃度的上升，納米粒形成所需的最低ph增大，且ph范圍也增大。當(dāng)硫酸鋅的終質(zhì)量濃度達(dá)到0.9％時(shí)，納米粒形成的ph最高可達(dá)11，ph范圍增大到3個(gè)單位。

3.2牡蠣肽-鋅納米粒的粒徑分布

將上述研究中判斷為可能生成牡蠣肽-鋅納米粒的條件下制得的“納米粒”用粒徑分析儀測(cè)定粒徑分布，確定是否形成納米顆粒，結(jié)果如表3所示。

表3牡蠣肽-鋅納米粒的粒徑分布

由表3可知，在上述條件下均能形成粒徑為28～102nm的納米顆粒，且分散性良好(pdi<0.4)。通過(guò)分析可知，隨著ph的下降和鋅終質(zhì)量濃度的上升，顆粒粒徑增大，這與透光率的檢測(cè)結(jié)果相一致。

3.3牡蠣肽-鋅納米粒的電鏡圖

為進(jìn)一步確認(rèn)牡蠣肽鋅納米粒的形成，將實(shí)施例3制備得到的“納米?！边M(jìn)行電鏡觀察，結(jié)果如圖1所示。由圖1可以清楚地觀察到納米粒的形成，且納米粒的尺寸與粒徑分析儀的結(jié)果基本一致。粒徑分析儀和電鏡分析的結(jié)果均證實(shí)納米顆粒的形成，且實(shí)施例3制備得到的“納米?！痹谀軌蛐纬杉{米粒的條件中，得到的“納米粒”粒徑最小。