本發(fā)明涉及一種用于降低血糖的藥物及其應(yīng)用，特別涉及一種p38mapk抑制劑用于降低血糖的藥物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

糖尿病(diabetesmellitus，dm)是由于遺傳和環(huán)境因素相互作用而引起的臨床綜合征，是高發(fā)病率、高致殘致死率的主要內(nèi)分泌疾病之一。根據(jù)發(fā)病機(jī)制的不同，糖尿病主要包括1型糖尿病和2型糖尿病。在我國(guó)2型糖尿病占糖尿病人群的90％以上，其是由于胰島素相對(duì)缺乏及胰島素抵抗所致的以長(zhǎng)期高血糖為特征的臨床綜合征。慢性高血糖可導(dǎo)致多種組織，特別是眼、腎臟、神經(jīng)、心血管的長(zhǎng)期損傷、功能缺陷和衰竭。臨床上出現(xiàn)三多(多食、多飲、多尿)、一少(體重下降)典型癥狀。

胰島β細(xì)胞功能受損和胰島素抵抗是2型糖尿病的兩個(gè)重要病生理機(jī)制。越來越多的研究證實(shí)，胰島β細(xì)胞功能進(jìn)行性惡化或衰竭是糖尿病前期轉(zhuǎn)變?yōu)樘悄虿〉年P(guān)鍵，是糖尿病進(jìn)展的必要環(huán)節(jié)。

p38(也稱作csbp或rk)是一種絲氨酸/蘇氨酸促分裂原活化蛋白激酶(mapk)，研究已證實(shí)具有調(diào)節(jié)前炎癥細(xì)胞因子的作用。p38是首先在小鼠單核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，其分子中酪氨酸可被脂多糖(lps)磷酸化的一種激酶。saklatvalaj.等人(cell，781039-1049，1994)首次確定了p38與細(xì)胞對(duì)細(xì)胞因子的應(yīng)答之間的聯(lián)系，證明了il-1激活蛋白激酶級(jí)聯(lián)，其導(dǎo)致小熱休克蛋白hsp27的磷酸化，這可能是通過mapk的蛋白激酶2(mapkap激酶-2)來實(shí)現(xiàn)的。han，j.等人，(science，265808-811，1994)通過對(duì)純化的激酶的肽鏈進(jìn)行序列分析證實(shí)其與小鼠單核細(xì)胞中的lps激活的p38mapk有關(guān)。同時(shí)rouse，j.等人(cell，781027-1037，1994)證明p38mapk本身在應(yīng)答多種細(xì)胞應(yīng)激，包括接觸紫外線輻射和熱休克中被上游激酶所活化，并確定mapkap激酶-2是hsp27磷酸化的激酶。隨后，smithklinebeecham的工作者lee，j.等人，nature，372739-746證明p38mapk是一系列吡啶基咪唑化合物的分子靶點(diǎn)，通過吡啶基咪唑化合物抑制lps激發(fā)的人單核細(xì)胞的tnf的產(chǎn)生。這是一個(gè)關(guān)鍵性的發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致很多p38mapk選擇性抑制劑的開發(fā)。

p38mapk的活化可以刺激單核/巨噬細(xì)胞表達(dá)腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactors，tnf)、白介素(interleukin，il)-1、il-6、il-8和環(huán)加氧酶(cyclo-oxygenase，cox)-2，調(diào)控中性粒細(xì)胞中il-8合成、氧化應(yīng)激和彈性蛋白酶釋放，調(diào)控tnf和脂多糖介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞cox-2表達(dá)、前列腺素合成和e-選擇素的表達(dá)。除了促進(jìn)炎癥因子的生成，p38可介導(dǎo)中性粒細(xì)胞的炎性聚集和化學(xué)趨化，在炎癥的啟動(dòng)階段即起到促進(jìn)炎癥的作用，這種作用與p38下游分子mapk激活蛋白2(mapk-activatedkinase，mapkap2)活化后介導(dǎo)的hsp27磷酸化有關(guān)。炎癥區(qū)域內(nèi)中性粒細(xì)胞的p38還可通過nadph氧化酶發(fā)揮促進(jìn)活性氧和補(bǔ)體生成的作用。

p38mapk抑制劑sb203580(也可以寫作sb203580或sb-203580)合成最早，化學(xué)性質(zhì)較穩(wěn)定，商品化較為成熟，易于獲得，所以在科學(xué)研究中應(yīng)用最為廣泛。sb203580的英文名稱為(4-(4-fluorophenyl)-2-(4-methylsulfinylphenyl)-5-(4-pyridyl)-1h-imidazole)，中文名稱為4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基亞磺?；交?-5-(4-吡啶基)-1h-咪唑，其分子結(jié)構(gòu)式如下：

sb203580分子量為377.43，分子式為c21h16n3fos，casnumber：152121-47-6。本產(chǎn)品純度大于99％。

sb203580能選擇性抑制p38mapk，ic50為600nm；對(duì)于jnk/sapk和p44/42mapk(即erk1/2)無顯著的抑制作用，ic50僅為100μm。

sb203580可以透過細(xì)胞膜在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮抑制p38mapk的作用，抑制后續(xù)mapkapkinase-2和mapkapkinase-3的激活的作用，從而可以有效地抑制一些炎癥因子(如il-1β、tnf-α)誘導(dǎo)的部分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。由于p38mapk對(duì)促炎癥因子(il-1β、tnfα和il-6)的重要調(diào)節(jié)作用，p38mapk在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、克羅恩病、強(qiáng)直性脊柱炎和慢性哮喘等慢性炎癥疾病中的作用成為最近研究的新熱點(diǎn)。p38抑制劑通過阻斷p38通路抑制炎癥發(fā)展治療慢性炎癥疾病的可能性也被廣泛研究和報(bào)告。

糖尿病的治療主要有自我管理、血糖監(jiān)測(cè)、飲食療法、運(yùn)動(dòng)療法和藥物治療，藥物治療包括胰島素及其類似物以及口服降糖藥物。一般來說，如果口服降糖藥不能使血糖控制達(dá)標(biāo)或有嚴(yán)重的急性或慢性并發(fā)癥，那么就要用胰島素或類似物予以治療。胰島素類是治療1型糖尿病唯一有效的治療方法。目前市場(chǎng)上已投放的治療2型糖尿病的藥物有：(1)胰島素促分泌藥物，如磺脲類藥物、格列奈類；(2)雙胍類，如二甲雙胍；(3)α-糖苷酶抑制劑，如阿卡波糖；(4)胰島素增敏劑噻唑烷二酮類，如吡格列酮；(5)新型：如glp-1受體激動(dòng)劑和dpp4抑制劑、sglt2受體阻斷劑。其中磺脲類藥物是較常用的治療糖尿病的藥物之一，其通過作用于胰島β細(xì)胞膜表面的受體促進(jìn)胰島素釋放，其降血糖作用有賴于尚存在相當(dāng)數(shù)量(30％以上)有功能的胰島β細(xì)胞。目前并未發(fā)現(xiàn)任何藥物治療2型糖尿病病人能從發(fā)病機(jī)制上根本改善和保護(hù)胰島β細(xì)胞功能及增加靶組織對(duì)胰島素的敏感性，延緩疾病的發(fā)生發(fā)展。

一項(xiàng)對(duì)小鼠rinm5f細(xì)胞系(來自于放射線誘導(dǎo)的胰島素瘤，具有較高的胰島素分泌率)的培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)，il-1β和ifn-γ聯(lián)合可以促進(jìn)β細(xì)胞凋亡，并且證實(shí)這種促凋亡作用至少部分是經(jīng)誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(inos)介導(dǎo)的。徐菁等人的研究顯示p38mapk抑制劑sb203580可通過抑制炎癥反應(yīng)而減輕小鼠胰腺組織損傷。kim等人的研究則顯示在c2c12骨骼肌細(xì)胞系中，p38mapk抑制劑sb203580可顯著抑制葡萄糖的攝取，提示p38mapk參與了外周胰島素敏感性調(diào)節(jié)。

sb203580是否可以改善糖尿病個(gè)體的血糖水平，延緩糖尿病發(fā)展方面未見有關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有糖尿病治療過程中用藥存在的技術(shù)缺陷，提供一種糖尿病治療的新靶點(diǎn)，通過抑制炎癥，延緩和改善糖尿病的發(fā)展。本發(fā)明觀察p38mapk抑制劑sb203580對(duì)胰島β細(xì)胞生存和凋亡的影響，以及sb203580對(duì)糖尿病動(dòng)物模型血糖的改善以及機(jī)制進(jìn)行研究，從而提供一種以p38mapk抑制劑sb203580為主要成分的降糖藥物，可以用于延緩和/或治療糖尿病。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，本發(fā)明第一方面提供一種降低血糖的方法，其通過抑制炎癥使胰島β細(xì)胞的胰島素分泌能力及胰島素抵抗能力的改善來實(shí)現(xiàn)血糖的降低。

特別是，所述通過抑制炎癥改善胰島β細(xì)胞胰島素分泌能力及機(jī)體胰島素抵抗能力是使用含有p38mapk抑制劑sb203580成分的藥物實(shí)現(xiàn)。

尤其是，所述降低血糖的方法可以用于調(diào)理、延緩和/或治療糖尿病。

其中，所述糖尿病為1型糖尿病、2型糖尿病、繼發(fā)性糖尿病。尤其是2型糖尿病。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，本發(fā)明第二方面提供一種獲得降糖藥物的方法，包括：

查找與抑制炎癥有關(guān)的炎癥抑制藥物；

從所有炎癥有關(guān)的炎癥抑制藥物中篩選出與改善胰島β細(xì)胞胰島素分泌能力或/和胰島素抵抗能力有關(guān)的目標(biāo)藥物；

根據(jù)對(duì)所述目標(biāo)藥物進(jìn)行的藥物試驗(yàn)結(jié)果，從所述目標(biāo)藥物中選出所述降低血糖藥物。

特別是，從所述目標(biāo)藥物中選出所述降低血糖藥物是p38mapk抑制劑sb203580。

特別是，從所述目標(biāo)藥物中選出所述降低血糖藥物是包含p38mapk抑制劑sb203580成分的藥物。

其中，根據(jù)對(duì)所述目標(biāo)藥物進(jìn)行的藥物試驗(yàn)的結(jié)果，從所述目標(biāo)藥物中選出所述降低血糖藥物包括：

將目標(biāo)藥物分別進(jìn)行細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，從而判斷目標(biāo)藥物是否可以改善胰島β細(xì)胞系的胰島素分泌能力，是否改善糖尿病動(dòng)物模型的血糖水平以及是否通過改善β細(xì)胞功能以及胰島素抵抗實(shí)現(xiàn)的。

如果實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示目標(biāo)藥物可以改善胰島β細(xì)胞系的胰島素分泌能力、糖尿病動(dòng)物模型的血糖水平、β細(xì)胞功能以及胰島素抵抗，則判斷該藥劑可以作為降低血糖的藥物。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，本發(fā)明第三方面提供一種降糖藥物，以p38mapk抑制劑sb203580為主要成分，包括藥學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑。

藥學(xué)上可接受的載體通常被保健專家認(rèn)可用于這一目的且作為藥劑的非活性成分。有關(guān)藥學(xué)上可接受的載體的匯編可以在《藥物賦形劑手冊(cè)》(handbookofpharmaceuticalexcipients，第2版，由a.wade和p.j.weller編輯；americanpharmaceuticalassociation出版，washingtonandthepharmaceuticalpress,london,1994)等工具書中找到。

所述的載體包括賦形劑，如淀粉、水等；潤(rùn)滑劑，如硬脂酸鎂等；崩解劑，如微晶纖維素等；填充劑，如乳糖等；粘結(jié)劑，如預(yù)膠化淀粉、糊精等；甜味劑；抗氧化劑；防腐劑、矯味劑、香料等；

所述降糖藥物是通過經(jīng)胃腸道給藥和非經(jīng)胃腸道給藥途徑給藥。所述的非經(jīng)胃腸道給藥途徑選擇注射給藥、呼吸道給藥、皮膚給藥、粘膜給藥或腔道給藥。

所述降糖藥物以片劑、膠囊劑、貼劑等形式存在。

非經(jīng)胃腸道給藥藥劑選擇注射劑、噴霧劑、氣霧劑、貼劑等；經(jīng)胃腸道給藥制劑選擇片劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、丸劑、溶液劑或糖漿劑等。

本發(fā)明所述藥物其組成為含有治療有效劑量的化合物p38mapk抑制劑sb203580，所述化合物在藥物中可以是單獨(dú)使用，也可以是與其他藥物聯(lián)合使用。其他預(yù)防或/和治療糖尿病尤其是2型糖尿病的藥物包括但并不局限于如下藥物：如二甲雙胍、胰島素等。

其中，本發(fā)明的降糖藥物的藥劑形式可以通過現(xiàn)有技術(shù)中公開的方法制備得到。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明第四方面提供一種將降糖藥物在制備調(diào)理、延緩和/或治療糖尿病藥物的應(yīng)用。

本發(fā)明第五方面提供一種降糖藥物在制備改善糖尿病患者胰島β細(xì)胞胰島素分泌能力藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明第六方面提供一種降糖藥物在制備改善糖尿病患者胰島素抵抗能力中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的明顯優(yōu)點(diǎn)：

1、本發(fā)明基于抑制炎癥使胰島β細(xì)胞胰島素分泌能力及胰島素抵抗能力改善來實(shí)現(xiàn)血糖降低的思想，發(fā)現(xiàn)一種可以降低血糖的藥物，該藥物是以市售的化合物p38mapk抑制劑sb203580為主要成分，研發(fā)成本低，普適應(yīng)高。

2、本發(fā)明對(duì)已知化合物p38mapk抑制劑sb203580發(fā)掘了新的藥用價(jià)值，將其用于延緩和/或治療糖尿病、改善胰島β細(xì)胞胰島素分泌能力和改善糖尿病患者胰島素抵抗、降低糖尿病患者血糖，并可制備成延緩和/或治療糖尿病的藥物或保健食品，從而為已知化合物p38mapk抑制劑sb203580的應(yīng)用開拓了一個(gè)新的領(lǐng)域。

3、本發(fā)明的系列試驗(yàn)研究證明p38mapk抑制劑sb203580具有顯著的治療糖尿病、降低血糖的作用，具有改善胰島β細(xì)胞胰島素分泌能力。

4、本發(fā)明的p38mapk抑制劑sb203580可制備為口服制劑、注射劑使用，其藥理作用強(qiáng)，用于預(yù)防、調(diào)理和治療糖尿病的功效顯著，見效快、毒副作用小、安全性好，能夠長(zhǎng)期服用，且可用現(xiàn)代藥理學(xué)分析其降血糖的作用機(jī)理，具有良好的藥用前景。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例1中不同培養(yǎng)條件下，p38mapk四種亞型蛋白表達(dá)結(jié)果圖，其中1a為對(duì)照組，培養(yǎng)條件為葡萄糖11.1mmol/l，1b為高糖組，培養(yǎng)條件為葡萄糖25mmol/l，1c為高脂組，培養(yǎng)條件為棕櫚酸0.2mmol/l，1d為高糖高脂組，培養(yǎng)條件為葡萄糖25mmol/l，棕櫚酸0.2mmol/l，1e為細(xì)胞因子刺激組，培養(yǎng)條件為il-1β5ug/ml，ifn-γ5ug/ml,葡萄糖11.1mmol/l，12h、24h、48h為不同培養(yǎng)時(shí)間；

圖2是本發(fā)明實(shí)施例2中不同培養(yǎng)時(shí)間下，胰島素分泌水平結(jié)果圖；

圖3是本發(fā)明實(shí)施例3中各組小鼠不同周齡空腹血糖曲線；其中，fpg表示空腹血糖濃度；con組表示正常對(duì)照c57小鼠；dmi組表示db/db小鼠sb203580灌胃組；dmo組表示db/db小鼠陽(yáng)性對(duì)照組，

圖4是本發(fā)明實(shí)施例3中各組小鼠的ipgtt試驗(yàn)的血糖曲線圖，其中dmi組為db/db小鼠sb203580灌胃組；dmo組為db/db小鼠蒸餾水陽(yáng)性對(duì)照組。4a為7周齡(藥物干預(yù)前)小鼠的ipgtt試驗(yàn)的血糖曲線圖；圖b為12周齡(藥物干預(yù)5周)小鼠的ipgtt試驗(yàn)的血糖曲線圖；4c為14周齡(藥物干預(yù)7周)小鼠的ipgtt試驗(yàn)的血糖曲線圖；4d為16周齡(藥物干預(yù)9周)小鼠的ipgtt試驗(yàn)的血糖曲線圖；

圖5是不同周齡小鼠ipgtt試驗(yàn)的血糖曲線下面積圖，其中：auc表示血糖曲線下面積，dmi表示db/db小鼠sb203580灌胃組，dmo表示db/db小鼠蒸餾水對(duì)照組；

圖6為不同周齡對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠的homa-β比較圖，其中，dmi組為db/db小鼠sb203580灌胃組；dmo組為db/db小鼠蒸餾水對(duì)照組。#dmi和dmo組之間p<0.05；

圖7為不同周齡對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠的homa-ir比較圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。但這些實(shí)施例僅限于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照廠商所建議的條件。

以下通過試驗(yàn)例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明所述藥物的有益效果，這些試驗(yàn)例包括了本發(fā)明藥物的藥效學(xué)試驗(yàn)。

本發(fā)明所用的p38mapk抑制劑sb203580購(gòu)自美國(guó)lclaboratories公司。

實(shí)施例1獲得降糖藥物的方法

1、查找與抑制炎癥有關(guān)的炎癥抑制藥物

查找方法是通過檢索各種醫(yī)藥網(wǎng)站，文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)等途徑獲得炎癥抑制藥物，并通過市售的方式獲得炎癥抑制藥物。

2、篩選

從所有炎癥有關(guān)的炎癥抑制藥物中篩選出改善胰島β細(xì)胞胰島素分泌能力或/和胰島素抵抗能力有關(guān)的目標(biāo)藥物，具體是將大鼠胰島ins-1β細(xì)胞系在含有不同炎癥抑制藥物的培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，觀察胰島β細(xì)胞的生存和凋亡，并將不同炎癥抑制藥物應(yīng)用于糖尿病動(dòng)物模型，觀察血糖水平，從而判斷不同炎癥抑制藥物是否引起β細(xì)胞功能進(jìn)行性惡化或衰竭(具體試驗(yàn)過程可參見下述試驗(yàn)例1-3)。

3、根據(jù)對(duì)所述目標(biāo)藥物進(jìn)行的藥物試驗(yàn)結(jié)果，從所述目標(biāo)藥物中選出所述降低血糖藥物，最終發(fā)現(xiàn)p38mapk抑制劑sb203580可以有效的改善血糖水平。

為了通過抑制炎癥使胰島β細(xì)胞的胰島素分泌能力及胰島素抵抗能力改善來實(shí)現(xiàn)血糖的降低，發(fā)明人進(jìn)行大量試驗(yàn)，得出p38mapk抑制劑sb203580可以作為降糖藥物的結(jié)果，以下試驗(yàn)例為發(fā)明人對(duì)p38mapk抑制劑sb203580的試驗(yàn)研究?jī)?nèi)容及結(jié)果。

試驗(yàn)例1p38mapk抑制劑sb203580對(duì)ins-1胰島β細(xì)胞系，p38mapk四種亞型表達(dá)的影響

1、實(shí)驗(yàn)材料

1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

大鼠胰島ins-1β細(xì)胞系：由于ins-1細(xì)胞表達(dá)氧自由基清除酶少，因此對(duì)氧化應(yīng)激損傷高度敏感，與原代胰島相似。此特點(diǎn)使其成為研究氧自由基倡導(dǎo)的功能異常和細(xì)胞毒性的模型，ins-1廣泛用于研究β細(xì)胞生長(zhǎng)及存活因素的研究。購(gòu)于上海拜力生物科技有限公司。該系源于輻射誘導(dǎo)的胰島j3細(xì)胞瘤，是通過在腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基中加入2-巰基乙醇(2-me)建立的。通過免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)大部分細(xì)胞胰島素染色陽(yáng)性，未檢測(cè)到胰升糖素、生長(zhǎng)抑素或胰多肽的分泌。

1.2實(shí)驗(yàn)藥劑

細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑：

1640培養(yǎng)基(22400-089)和胎牛血清(16000-044)購(gòu)自lifeteconology公司；0.5％胰蛋白酶(含edta不含酚紅)和青－鏈霉素混合液購(gòu)自lifeteconology公司；槍頭，6孔、12孔、96孔培養(yǎng)板，離心管，玻璃刻度吸管和一次性濾器等耗材購(gòu)自美國(guó)corning公司。il-1β和ifn-γ購(gòu)于sigma公司。

westernblot相關(guān)試劑：

i抗大鼠抗p38mapk單克隆抗體(#9212)，i抗大鼠抗p38mapk磷酸化單克隆抗體(#4511)，i抗大鼠抗p38αmapk單克隆抗體(#9218)，i抗大鼠抗p38βmapk單克隆抗體(#2339)，i抗大鼠抗p38γmapk單克隆抗體(#2307)，i抗大鼠抗p38δmapk單克隆抗體(#9214)，i抗大鼠抗bax單克隆抗體(#2772),i抗大鼠抗bcl-2單克隆抗體(#2870)購(gòu)自cellsignalingtechnology公司。i抗大鼠抗actin單克隆抗體購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；ii抗過氧化物酶結(jié)合的山羊抗小鼠igg(sc-2005)，過氧化物酶結(jié)合的山羊抗兔igg(sc-2004)購(gòu)自santacruzbiotechnology公司；westernblotecl增強(qiáng)型發(fā)光液(#34075)購(gòu)自美國(guó)thermo公司；硝酸纖維素膜購(gòu)自millipore公司。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器

高精度電子分析天平(sartorius，瑞士)、臺(tái)式低溫冷凍高速離心機(jī)(eppendorf，德國(guó))、電子天平(adventurer，美國(guó))、紫外分光光度計(jì)(島津uv3000，日本)、二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(precision，美國(guó))、超凈工作臺(tái)(baker，美國(guó))、倒置相差顯微鏡(olympus，日本)、細(xì)胞培養(yǎng)瓶(thermo,美國(guó))、細(xì)胞培養(yǎng)板(coning,美國(guó))、nanodrop2000(thermo,美國(guó))、pcr儀(gene,中國(guó)香港)、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)(kodakimagestation4000mmpro，美國(guó))、酶標(biāo)儀(bio-rad，美國(guó))、單道可調(diào)移液器(eppendorf,德國(guó))、電泳槽，轉(zhuǎn)膜槽，電源(北京六一儀器廠，中國(guó))。

2、實(shí)驗(yàn)方法

將大鼠胰島ins-1β細(xì)胞系在含10％fbs的1640和11.1mmol/l葡萄糖的基礎(chǔ)培養(yǎng)態(tài)中培養(yǎng)48小時(shí)后，分成五組，分別是：繼續(xù)加入11.1mmol/l葡萄糖的對(duì)照組，加入25mmol/l葡萄糖的高糖組，加入0.2mmol/l棕櫚酸的高脂組，加入25mmol/l葡萄糖和0.2mmol/l棕櫚酸的高糖高脂組，以及加入5ug/mlil-1β，5ug/mlifn-γ和11.1mmol/l葡萄糖的陽(yáng)性對(duì)照組(即細(xì)胞因子刺激組)，并向每組中加入20um濃度的sb203580進(jìn)行ins-1β細(xì)胞系培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中分別在12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)三個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)收集培養(yǎng)的細(xì)胞，并對(duì)其進(jìn)行蛋白提取，以及westernblot技術(shù)檢測(cè)p38mapk的α、β、γ、δ四種亞型蛋白表達(dá)的變化，以actin作為蛋白表達(dá)內(nèi)參。得到如圖1所示的表達(dá)結(jié)果。

根據(jù)圖1所示的表達(dá)結(jié)果可以看出，p38mapk的α與β亞型在不同糖脂培養(yǎng)條件下，表達(dá)量未見明顯變化(圖1a，b，c，d)。γ與δ亞型在不同的培養(yǎng)條件下，其變化趨勢(shì)不盡相同：在高糖培養(yǎng)48小時(shí)后(圖1b)，可見sb203580干預(yù)組γ亞型的表達(dá)量增多；在高脂培養(yǎng)條件下，sb203580干預(yù)組的γ亞型表達(dá)量自12小時(shí)培養(yǎng)后開始增加，且一直持續(xù)到48小時(shí)(圖1c)；在對(duì)照組與高糖組，δ亞型未見明顯變化，但在高脂培養(yǎng)條件下，可見sb203850干預(yù)組的δ亞型表達(dá)略有升高(圖1c)，且在高糖高脂共培養(yǎng)中仍可見相同趨勢(shì)(圖1d)；在陽(yáng)性對(duì)照組(圖1e)，可顯著觀察sb203580干預(yù)后自加入刺激12小時(shí)后，γ亞型表達(dá)量逐漸上升，48小時(shí)表達(dá)顯著上升，同時(shí)可見δ亞型隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)量也呈上升趨勢(shì)。

可見，sb203580的使用可以改善ins-1胰島β細(xì)胞系的p38mapkγ和δ亞型表達(dá)量，減少ins-1細(xì)胞凋亡，并且改善早期ins-1胰島β細(xì)胞系的胰島素分泌能力，以24小時(shí)培養(yǎng)最為顯著。

試驗(yàn)例2p38mapk抑制劑sb203580對(duì)ins-1胰島β細(xì)胞系胰島素分泌功能的評(píng)價(jià)

將試驗(yàn)例1中步驟2收集培養(yǎng)的細(xì)胞分別進(jìn)行上清培養(yǎng)，通過國(guó)際通用的胰島素刺激葡萄糖分泌(gsis)評(píng)價(jià)胰島分泌功能，具體實(shí)驗(yàn)方法為:

1)吸去細(xì)胞培養(yǎng)基，生理鹽水洗細(xì)胞3遍，加入3.3mmol/l葡萄糖krhb溶液進(jìn)行預(yù)處理30分鐘；2)吸去上清，加入1.0mmol/l葡萄糖krhb溶液，1小時(shí)后吸上清至1.5mlep管，-20℃凍存待測(cè)胰島素。3)同時(shí)加入16.7mmol/l葡萄糖krhb溶液刺激細(xì)胞，1小時(shí)后吸上清至1.5mlep管，-20℃凍存待測(cè)胰島素。4)葡萄糖刺激結(jié)束后，將細(xì)胞提取rna，測(cè)定rna濃度，用作胰島素校正。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清離心后通過放免法測(cè)定其中總胰島素含量，得到如圖2所示的試驗(yàn)結(jié)果。

3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖2所示的試驗(yàn)結(jié)果可知，培養(yǎng)12小時(shí)組，無sb203580干預(yù)下隨著刺激培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，ins-1細(xì)胞的基礎(chǔ)胰島素分泌能力逐漸下降，高糖和/或高脂對(duì)ins-1細(xì)胞基礎(chǔ)胰島素分泌能力未有明顯作用；在培養(yǎng)24小時(shí)后，sb203580干預(yù)組的ins-1細(xì)胞的基礎(chǔ)胰島素分泌能力均強(qiáng)于未加sb203580培養(yǎng)組，且在對(duì)照組及高糖培養(yǎng)組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)；培養(yǎng)48小時(shí)后，ins-1細(xì)胞的基礎(chǔ)胰島素分泌能力明顯下降，但加入sb203580干預(yù)可明顯善細(xì)胞因子刺激下的ins-1細(xì)胞的基礎(chǔ)胰島素分泌能力(p＜0.05)，但高糖和或高脂刺激下ins-1細(xì)胞的基礎(chǔ)胰島素分泌能力未見明顯改善，且在高脂刺激下顯著降低；在陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞因子刺激組，sb203580干預(yù)組的ins-1細(xì)胞的基礎(chǔ)胰島素分泌能力均強(qiáng)于sb203580未干預(yù)組(圖2a)。在不同培養(yǎng)條件培養(yǎng)時(shí)間下，觀察ins‐1細(xì)胞的葡萄糖刺激的胰島素分泌能力的改變。1.培養(yǎng)24小時(shí)后，sb203580干預(yù)組的ins-1細(xì)胞的葡萄糖刺激胰島素分泌能力均強(qiáng)于sb203580未干預(yù)組；2.培養(yǎng)48小時(shí)后，葡萄糖刺激的ins-1細(xì)胞的胰島素分泌能力明顯下降，但加入sb203580干預(yù)可明顯改善細(xì)胞因子刺激下的ins-1細(xì)胞的胰島素分泌能力；3.在陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞因子刺激組，sb203580干預(yù)組的ins-1細(xì)胞的葡萄糖刺激胰島素分泌能力在24小時(shí)顯著強(qiáng)于sb203580未干預(yù)組，但培養(yǎng)48小后與未干預(yù)組無差異(圖2b)。

可見：

1)在陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞因子刺激組，sb203580干預(yù)組的ins-1細(xì)胞的基礎(chǔ)胰島素分泌能力均強(qiáng)于sb203580未干預(yù)組(p＜0.05)；

2)在陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞因子刺激組，sb203580干預(yù)組的ins-1細(xì)胞的葡萄糖刺激胰島素分泌能力在24小時(shí)顯著強(qiáng)于sb203580未干預(yù)組。

試驗(yàn)例3p38mapk抑制劑sb203580對(duì)血糖改善

1、實(shí)驗(yàn)材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

c57小鼠：spf級(jí)6周齡雌性c57bl小鼠24只。db/db小鼠：6周齡雌性db/db小鼠42只。

標(biāo)準(zhǔn)小鼠顆粒飼料，自由飲水、進(jìn)食，晝夜(12h/12h)光線照明，房間溫度20℃～26℃，濕度40％～70％。

1.2實(shí)驗(yàn)藥劑

如表1所示：

表1試驗(yàn)藥劑

1.3實(shí)驗(yàn)儀器

本實(shí)施使用的試驗(yàn)儀器如表2所示：

表2實(shí)驗(yàn)儀器

2、實(shí)驗(yàn)方法

2.1動(dòng)物分組

小鼠購(gòu)買后適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。一周后，隨機(jī)處死6只c57小鼠和6只db/db小鼠。

將剩余小鼠分為3組：空白對(duì)照組(con組)為c57小鼠，18只；實(shí)驗(yàn)組(dmi組)和陽(yáng)性對(duì)照組(dmo組)均為db/db小鼠，各組18只。第一組給予蒸餾水灌胃；第2組給予15mg/(kg*d)的sb203580灌胃；第3組給予等量蒸餾水灌胃。

每周監(jiān)測(cè)小鼠的體重、進(jìn)食量，采血測(cè)空腹血漿葡萄糖及胰島素水平。待dmo組和第dmi組小鼠空腹血糖出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異時(shí)開始計(jì)為0周(9周齡)，第2周、第4周、第6周做腹腔注射糖耐量試驗(yàn)(intraperitonealglucosetolerancetest，ipgtt)。

其中，體重測(cè)定：禁食16h后使用動(dòng)物天平測(cè)得。

進(jìn)食量：以籠為單位，每周稱投喂飼料和剩余的差值獲得。

血糖測(cè)定：尾端少量血血糖儀測(cè)定。

血漿胰島素：酶聯(lián)免疫分析法。

3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1血糖

小鼠隔夜禁食16h定義為空腹?fàn)顟B(tài)。自7周齡開始測(cè)量空腹血糖起，db/db小鼠即顯著高于c57小鼠。而開始藥物干預(yù)前和干預(yù)后一周，實(shí)驗(yàn)組(dmi組)和陽(yáng)性對(duì)照組(dmo組)空腹血糖沒有顯著差異。sb203580灌胃后第2周(9周齡)，dmi組和dmo組之間的空腹血糖開始出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，第3周實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的空腹血糖差異消失，自干預(yù)后第4周開始，兩組空腹血糖統(tǒng)計(jì)學(xué)差異持續(xù)存在達(dá)5周，實(shí)驗(yàn)組空腹血糖顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組，血糖測(cè)定結(jié)果如圖3所示。

sb203580干預(yù)前，dmi和dmo組之間各時(shí)間點(diǎn)血糖水平并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(如圖4a所示)。藥物干預(yù)5周(小鼠12周齡)后測(cè)ipgtt(腹腔注射糖耐量試驗(yàn))發(fā)現(xiàn)，dmi組和dmo組相比，糖耐量有所改善，實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)血糖水平和血糖曲線下面積均低于陽(yáng)性對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(如圖4b所示)。小鼠14周齡(藥物干預(yù)7周)時(shí)和小鼠12周齡時(shí)的血糖曲線相似，dmi組的ipgtt的各時(shí)間點(diǎn)血糖水平和血糖曲線下面積均低于dmo組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(如圖4c所示)。待小鼠16周齡時(shí)兩組間差距縮小，但各時(shí)間點(diǎn)血糖水平dmi組均低于dmo組，90min和120min血糖兩組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(如圖4d所示)。

計(jì)算ipgtt曲線下面積發(fā)現(xiàn)，干預(yù)前，dmi和dmo組曲線下面積無顯著性差異；第12周、第14周出現(xiàn)顯著性差異，dmi組小于dmo組，但第16周顯著性差異消失(如圖5所示)，dmi和dmo小鼠比較p＜0.05。

3.2、β細(xì)胞功能及胰島素抵抗評(píng)估

采用homa穩(wěn)態(tài)模型(homeostasismodelassessment)公式評(píng)估dmo組和dmi組小鼠胰島β細(xì)胞功能(即homa-β＝20×空腹胰島素水平(miu/l)/(空腹血糖水平(mmol/l)-3.5)(％)；homair＝空腹血糖水平(mmol/l)×空腹胰島素水平(miu/l)/22.5。)。

自藥物干預(yù)4周(小鼠11周齡)起，實(shí)驗(yàn)組(dmi組)小鼠的homa穩(wěn)態(tài)模型的β細(xì)胞功能持續(xù)優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組(dmo組)，在第12周(藥物干預(yù)第5周)時(shí)差異達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，如表3、圖4所示。其中，圖4中dmi組為db/db小鼠sb203580灌胃組；dmo組為db/db小鼠蒸餾水對(duì)照組。#dmi和dmo組之間p<0.05。

dmi組小鼠的胰島素抵抗指數(shù)(即homa-ir)有下降趨勢(shì)，在第12周時(shí)時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，如表4及圖5所示。自藥物干預(yù)第4周起，即使校正homa-ir后，dmi和dmo組間homa-β差別仍有顯著性。

homa-β、homa-ir按照如下公式進(jìn)行計(jì)算：

homa-β＝20×空腹胰島素水平(miu/l)/(空腹血糖水平(mmol/l)-3.5)(％)；

homa-ir＝空腹血糖水平(mmol/l)×空腹胰島素水平(miu/l)/22.5]

表3各組小鼠不同周齡homa-β(％)

注：數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示。兩組間比較時(shí)用mann-whitneyu檢驗(yàn)。

pa值為校正胰島素抵抗后的p值。

表4各組小鼠不同周齡homair(％)

注：數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示。兩組間比較時(shí)用mann-whitneyu檢驗(yàn)。

由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知：p38mapk抑制劑sb203580具有改善胰島β細(xì)胞功能的作用，而且有改善機(jī)體胰島素抵抗的作用，從而降低血糖。p38mapk抑制劑可以成為糖尿病治療的一類降糖藥，抗炎改善胰島β細(xì)胞功能和胰島素抵抗。