本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種導(dǎo)致豬白化和聽力缺失的基因突變的檢測方法。

背景技術(shù)：

mitf(microphthalmia-associtatedtranscriptionfactor)是小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，mitf蛋白屬于tfe轉(zhuǎn)錄因子超級家族的成員，具有典型的基本螺旋-環(huán)-螺旋亮氨酸拉鏈(basichelix-loop-helixleucinezipper，bhlh-zip)結(jié)構(gòu)。mitf蛋白能夠形成同源二聚體或與tfe3、tfeb、tfec形成異源二聚體，從而結(jié)合以“canntg”為核心的e-盒或m-盒序列，起到調(diào)控目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄表達的作用。在小鼠的眼發(fā)育形成過程中，如果mitf喪失了正常功能，將導(dǎo)致眼裂減小，或?qū)е鲁赡陼r的小眼畸形。另外，在神經(jīng)嵴細胞定向分化發(fā)育成黑色素細胞過程中，mitf參與了其分化，mitf突變將導(dǎo)致皮膚著色的改變。人類的mitf基因突變會引起waardenburg2a型綜合癥和tietz綜合癥，兩者均為常染色體顯性遺傳疾病，表現(xiàn)為皮膚色素減退、虹膜色素異常和聽覺神經(jīng)性耳聾等癥狀。

小鼠的mitf基因定位于6號染色體的6qd3上，基因組全長約為211.7kb；人類的mitf基因定位于3號染色體的3p14.1上，基因組全長約為228.9kb。它們均由9－10個外顯子構(gòu)成，而且都存在多個不同轉(zhuǎn)錄本。ncbi的genbank中，小鼠至少有9種不同的mitf轉(zhuǎn)錄本:mitf-a，-a1，-a2，-h，-h1，-h2，-h3，-m和-m1，編碼的mitf蛋白的氨基酸長度從349aa變化到526aa；人類也存在10種不同的mitf轉(zhuǎn)錄本:mitf-a1，-a2，-b1，-b2，-c1，-c2，-h1，-h2，-m1和-m2，編碼的mitf蛋白的氨基酸長度從413aa變化到526aa。在這些不同轉(zhuǎn)錄本中，外顯子2～9或3～10都同源。

目前有關(guān)豬mitf基因的snp檢測偶見報道，但基本局限在個別外顯子的單個堿基突變，并沒有發(fā)現(xiàn)與導(dǎo)致豬白化和聽力缺失相關(guān)的突變。然而，建立用于研究人類waardenburg2a型綜合癥和tietz綜合癥的豬模型，亟需確定導(dǎo)致豬產(chǎn)生相同癥狀的突變位點。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述行業(yè)和市場的需要，本發(fā)明在研究中發(fā)現(xiàn)豬mitf基因c.740t>c堿基突變導(dǎo)致豬白化和聽力缺失，從而提供一種豬mitf基因突變的檢測方法，有助于研究豬mitf基因的分子結(jié)構(gòu)、功能以及分析豬相關(guān)毛色基因的遺傳學(xué)和進化。

本發(fā)明提供了一種豬mitf基因突變的檢測方法，其包括：

1)通過pcr擴增豬mitf基因的外顯子；所述豬為具有全身白化和聽力缺失的表型的廣西巴馬小型豬；

2)判斷豬mitf基因的第8號外顯子上是否存在c.80t>c的單核苷酸堿基突變；

其中，步驟2)是通過選自dna直接測序、雜交測序、酶切測序、dna芯片技術(shù)、變性高效液相色譜中的一種或多種方法實現(xiàn)的。

所述檢測方法不用于疾病的診斷和治療目的。

在根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案中，步驟1)中所述pcr的引物包含序列為seqidno:15的正義引物和序列為seqidno:16的反義引物。

在根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案中，所述pcr的反應(yīng)條件為：

反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3分鐘，94℃變性30秒，59℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，30個循環(huán)后72℃再延伸5min。

在根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案中，步驟1)所述pcr的引物包括:

序列為seqidno:1的正義引物和序列為seqidno:2的反義引物；

序列為seqidno:3的正義引物和序列為seqidno:4的反義引物；

序列為seqidno:5的正義引物和序列為seqidno:6的反義引物；

序列為seqidno:7的正義引物和序列為seqidno:8的反義引物；

序列為seqidno:9的正義引物和序列為seqidno:10的反義引物；

序列為seqidno:11的正義引物和序列為seqidno:12的反義引物；

序列為seqidno:13的正義引物和序列為seqidno:14的反義引物；

序列為seqidno:17的正義引物和序列為seqidno:18的反義引物；

序列為seqidno:19的正義引物和序列為seqidno:20的反義引物；

序列為seqidno:21的正義引物和序列為seqidno:22的反義引物。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明確定了一種豬mitf基因有效的單核苷酸突變堿基及相應(yīng)的編碼氨基酸改變，分析堿基突變導(dǎo)致的編碼氨基酸及蛋白活性、基因功能的改變，為豬的mitf基因的分離和功能分析以及豬相關(guān)毛色基因的遺傳學(xué)和進化分析提供參考，同時，為建造人類聽力疾病模型提供基因工程技術(shù)幫助。本發(fā)明的上述的方法可以應(yīng)用在建立人類waardenburg綜合征的動物模型，進而可以應(yīng)用在篩選或制備用于診斷和/或治療人類waardenburg綜合征的藥物中。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例2中mitf基因第8個外顯子區(qū)域pcr擴增產(chǎn)物page電泳示例；

圖2為為第8個外顯子區(qū)域突變點測序結(jié)果圖；其中，mitf+/-為發(fā)生突變的第8號外顯子突變部位測序結(jié)果圖；mitf+/+為野生型的第8號外顯子與mitf對應(yīng)的部位的測序結(jié)果圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例進一步說明本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)理解，實施例僅用于進一步說明和闡釋本發(fā)明，并非用于限制本發(fā)明。

本申請通過設(shè)計豬mitf基因序列特異性擴增引物，對豬基因外顯子區(qū)域進行pcr擴增；分離、純化特異性擴增產(chǎn)物進行核酸序列測定、比對，找尋不同檢測個體mitf基因存在的單核苷酸堿基突變，分析基因突變導(dǎo)致的編碼氨基酸及蛋白活性、功能的改變。

本發(fā)明所用的廣西巴馬小型豬購自中國科學(xué)院動物研究所北方大動物研究基地。

實施例1引物設(shè)計

根據(jù)genbank數(shù)據(jù)庫中豬mitf基因序列設(shè)計特異引物，如表1所示

表1豬mitf基因序列引物

實施例2應(yīng)用上述對待檢測豬基因外顯子區(qū)域進行pcr擴增。

1)以下述反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進行pcr擴增

pcr擴增反應(yīng)體系，25μl體系：

反應(yīng)條件：

95℃預(yù)變性3分鐘，94℃變性30秒，59℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，30個循環(huán)后72℃再延伸5min。

2)應(yīng)用核酸純化試劑盒(tiangen，dp214)，參照廠商提供方案對pcr擴增產(chǎn)物進行分離、純化。圖1所示為mitf基因第8個外顯子區(qū)域pcr擴增產(chǎn)物page電泳示例。

實施例3測序及單核苷酸多態(tài)檢測

對分離純化的擴增產(chǎn)物進行序列測定、比對分析，得出待檢豬mitf基因第8個外顯子區(qū)域存在單鏈t>c單核苷酸堿基突變。圖2所示為第8個外顯子區(qū)域突變點測序結(jié)果圖，其中，mitf+/-為發(fā)生突變的第8號外顯子 突變部位測序結(jié)果圖；mitf+/+為野生型的第8號外顯子與mitf對應(yīng)的部位的測序結(jié)果圖，因此可以確定白化豬的第8號外顯子上發(fā)生了t>c單堿基突變，即mitf基因c.740t>c堿基突變。

對純化的豬mitf基因引物pcr擴增產(chǎn)物直接測序，比對不同樣本pcr產(chǎn)物測定序列。結(jié)果，在被檢測的9頭廣西巴馬小型豬實驗樣本中，mitf基因基因組dna序列第八號外顯子上在白化豬種發(fā)現(xiàn)有c.740t>c堿基突變。

通過研究發(fā)現(xiàn)豬mitf基因dna序列第八號外顯子上在白化豬種中存在c.740t>c堿基突變，直接導(dǎo)致編碼氨基酸出現(xiàn)l247s改變，氨基酸性質(zhì)隨之發(fā)生變化，造成mitf基因功能域超螺旋結(jié)構(gòu)的改變，影響mitf作為轉(zhuǎn)錄因子對下游基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，進而表現(xiàn)白化和聽力缺失，從而為豬作為waardenburg綜合征的疾病模型提供遺傳依據(jù)。

盡管本發(fā)明已進行了一定程度的描述，明顯地，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的條件下，可進行各個條件的適當(dāng)變化。可以理解，本發(fā)明不限于所述實施方案，而歸于權(quán)利要求的范圍，其包括所述每個因素的等同替換。