本發(fā)明屬于細(xì)胞中油脂含量檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速檢測真菌細(xì)胞內(nèi)中性油脂含量的方法。
背景技術(shù)：
生物柴油是一種較為潔凈的合成油，主要是以油料作物、野生油料植物和工程微藻等水生植物油脂以及動物油脂等為原料制備而成，是一種可以代替石化柴油的再生性燃料。上述原料中油脂含量檢測是制備生物柴油的前提，也是高效篩選優(yōu)良產(chǎn)油原料的關(guān)鍵。
現(xiàn)有的細(xì)胞中油脂檢測方法主要有：利用尼羅紅染色法、銅試劑法、傅里葉變換紅外光譜法以及氣質(zhì)聯(lián)用法。尼羅紅染色法通過尼羅紅與脂類物質(zhì)的結(jié)合并發(fā)出熒光檢測信號，可以快速檢測活細(xì)胞內(nèi)的脂類組分，但是其受不同材料細(xì)胞大小的影響，需要不斷更新條件，以減少誤差。羅紅染色法通過尼羅紅與脂類物質(zhì)的結(jié)合并發(fā)出熒光檢測信號，可以快速檢測活細(xì)胞內(nèi)的脂類組分，但是其受不同材料細(xì)胞大小的影響，需要不斷更新條件，以減少誤差。銅試劑法不能絕對定量，需要稱重法或標(biāo)準(zhǔn)脂肪酸進(jìn)行定量。傅里葉變換紅外光譜法以及氣質(zhì)聯(lián)用法對設(shè)備要求較高，成本較高。
因此，需要開發(fā)一種快速高效、操作步驟簡單的檢測真菌中性油脂的方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供的一種快速檢測真菌細(xì)胞內(nèi)中性油脂含量的方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)真菌細(xì)胞中油脂檢測比較困難的問題，是一種快速高效、操作步驟簡單的檢測真菌中性油脂的方法，方便產(chǎn)油真菌育種工作的高產(chǎn)油脂菌株篩選。
本發(fā)明目的是提供一種快速檢測真菌細(xì)胞內(nèi)中性油脂含量的方法，包括以下步驟：
s1，菌體活化，得到活化的真菌細(xì)胞；
s2，液體搖瓶培養(yǎng)，得到真菌細(xì)胞培養(yǎng)液；
s3，利用真菌細(xì)胞培養(yǎng)液制備菌懸液；
s4，蘇丹黑染色
取菌懸液，離心收集菌體；加一定量的蘇丹黑染液，染色30-60min；離心，棄上清；加無菌水清洗，離心，棄上清；加70％乙醇清洗，離心，棄上清；加無菌水清洗，離心，棄上清，收集固體沉淀；將固體沉淀轉(zhuǎn)移至載玻片，然后加水懸浮，制成水裝片；
s5，中性油脂含量計算
觀察水裝片上的細(xì)胞內(nèi)黑色油滴，選取著色均勻的視野，測量視野中的單個細(xì)胞的體積v，同時測量該細(xì)胞內(nèi)油滴數(shù)目i與相應(yīng)油滴的體積vi，代入公式x％＝(∑vi)/v計算中性油脂含量體積百分比，根據(jù)m％＝d1∑vi/[d1∑vi+d2(v-∑vi)]計算中性油脂占據(jù)真菌細(xì)胞的重量百分比，其中，i表示油滴數(shù)目，vi表示第i個油滴的體積，v代表單個真菌細(xì)胞體積，x％表示中性油脂含量體積百分比，m％表示中性油脂占據(jù)真菌細(xì)胞的重量百分比，d1表示中性油脂的密度，d2表示水的密度。
優(yōu)選的，上述的快速檢測真菌細(xì)胞內(nèi)中性油脂含量的方法，所述蘇丹黑染色的步驟為：吸取1ml菌懸液，8000r/min離心3min，收集菌體；加一定量的蘇丹黑染液，染色30-60min；8000r/min離心3min，棄上清；加無菌水清洗，8000r/min離心3min，棄上清；加70％乙醇清洗，8000r/min離心3min，棄上清；加無菌水清洗，8000r/min離心3min，棄上清，收集固體沉淀；將固體沉淀轉(zhuǎn)移至載玻片，然后加水懸浮，制成水裝片。
優(yōu)選的，上述的快速檢測真菌細(xì)胞內(nèi)中性油脂含量的方法，對于絲狀的真菌細(xì)胞，v＝(3/4)πr2h，其中,π為圓周率，r為真菌細(xì)胞半徑，h是菌體細(xì)胞長度。
優(yōu)選的，上述的快速檢測真菌細(xì)胞內(nèi)中性油脂含量的方法，對于球形的真菌細(xì)胞，v＝(4/3)πr3，其中，π為圓周率，r為真菌細(xì)胞半徑。
優(yōu)選的，上述的快速檢測真菌細(xì)胞內(nèi)中性油脂含量的方法，對于橢球型的真菌細(xì)胞，v＝(3/4)πabc，其中，π為圓周率，a為真菌細(xì)胞沿x軸的赤道半徑，b為真菌細(xì)胞沿y軸的赤道半徑，c為真菌細(xì)胞沿z軸的極半徑。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的一種快速檢測真菌細(xì)胞內(nèi)中性油脂含量的方法，具有以下有益效果：
(1)蘇丹黑染色定量油脂含量方便快捷，節(jié)省時間和試劑，又避免了環(huán)境的污染，方便產(chǎn)油真菌育種工作的高產(chǎn)油脂菌株篩選。解決了真菌細(xì)胞中油脂檢測比較困難的問題，方便產(chǎn)油真菌育種工作的高產(chǎn)油脂菌株篩選。
(2)方便直觀，成本較低，操作簡單。不同材料因其細(xì)胞形狀、大小、結(jié)構(gòu)不同，蘇丹黑染色特性也不同，選擇合適的染色條件使油脂準(zhǔn)確定量，其中，對于絲狀的真菌細(xì)胞，采用v＝(3/4)πr2h計算含量，對于球形的真菌細(xì)胞，采用v＝(4/3)πr3計算含量，對于橢球型的真菌細(xì)胞，采用v＝(3/4)πabc計算含量，減少誤差。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但不應(yīng)理解為本發(fā)明的限制。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法，下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中涉及到數(shù)據(jù)范圍的，在該數(shù)據(jù)范圍內(nèi)包括兩個端點(diǎn)的任何數(shù)值均可實(shí)現(xiàn)，由于效果和步驟相同，故不贅述。下述實(shí)施例1-3中水的密度以1g/cm3計，中性油脂密度以0.92g/cm3計。
實(shí)施例1
一種快速檢測真菌細(xì)胞內(nèi)中性油脂含量的方法，該真菌細(xì)胞為假絲酵母細(xì)胞，屬于絲狀真菌細(xì)胞，包括以下步驟：
s1，菌體活化，得到活化的真菌細(xì)胞
用接種針無菌操作蘸取假絲酵母(購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌株保藏編號：cicc1366)斜面母種上菌苔，四區(qū)劃線于菌種活化培養(yǎng)基平板，置培養(yǎng)箱內(nèi)28℃培養(yǎng)72h，觀察菌苔豐滿、略呈紅色，檢查無雜菌污染可得到活化的假絲酵母。
其中，每升所述菌種活化培養(yǎng)基采用pda培養(yǎng)基，的制備方法為：馬鈴薯洗凈去皮，切成1cm×1cm×1cm小塊，稱取200g，煮沸半小時，四層紗布過濾取汁，加入20.0g葡萄糖和16g的瓊脂，完全溶解后，加蒸餾水定容至1000ml，121℃滅菌30min，自然ph。
s2，液體搖瓶培養(yǎng)，得到真菌細(xì)胞培養(yǎng)液。
將活化的假絲酵母接種于種子培養(yǎng)基中，在溫度為26-30℃，轉(zhuǎn)速180轉(zhuǎn)/分鐘的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-6d，得到假絲酵母種子液；
將假絲酵母種子液接種于液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為10％(v/v)，在溫度為26-30℃，轉(zhuǎn)速180轉(zhuǎn)/分鐘的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-6d，得到假絲酵母種子培養(yǎng)液。
其中，每升種子培養(yǎng)基(gmy)含有：磷酸二氫鉀8g、七水合硫酸鎂0.5g、酵母膏3g、葡萄糖40g、溶劑為水，ph為5.5；
液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基采用gmy40培養(yǎng)基，每升gmy40培養(yǎng)基含有：40g的葡萄糖，3g的酵母提取物，8g的kh2po4，0.5g的mgso4·7h2o，溶劑為水，ph為6.0。
s3，利用真菌細(xì)胞培養(yǎng)液制備菌懸液
把假絲酵母培養(yǎng)液4℃、8000r/min離心5min收集菌體，用高純水洗滌一次，用高純水稀釋得到合適的細(xì)胞密度的假絲酵母菌懸液，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>
s4，蘇丹黑染色
吸取1ml假絲酵母菌懸液，8000r/min離心3min，收集菌體；加0.4ml的蘇丹黑染液，染色30-60min；8000r/min離心3min，棄上清；加無菌水清洗，8000r/min離心3min，棄上清；加70％乙醇清洗，8000r/min離心3min，棄上清；加無菌水清洗，8000r/min離心3min，棄上清，收集固體沉淀；將固體沉淀轉(zhuǎn)移至載玻片，然后加水溶解，制成水裝片。
其中，蘇丹黑染液的配制方法如下：0.5g蘇丹黑b溶于100ml70％酒精中，水浴加熱煮沸，全部溶解后趁熱過濾，冷卻后冰箱4℃保存?zhèn)溆?，恢?fù)至室溫后使用。
s5，中性油脂含量計算
觀察水裝片上的細(xì)胞內(nèi)黑色油滴，選取著色均勻的視野，用顯微測微尺測量一個或多個視野中的單個真菌細(xì)胞體積v，同時測量該細(xì)胞內(nèi)油滴數(shù)目i與油滴的體積vi。代入公式x％＝(∑vi)/v；其中，x％表示中性油脂含量體積百分比，v代表單個真菌細(xì)胞體積，v＝(3/4)πr2h，其中，π為圓周率，r為真菌細(xì)胞半徑，h是菌體細(xì)胞長度，i表示油滴數(shù)目，vi表示第i個油滴的體積。選取10-50個細(xì)胞分別測定x％，然后取其平均值作為該假絲酵母內(nèi)中性油脂含量體積百分比。
經(jīng)測定假絲酵母菌內(nèi)中性油脂含量為55.85％(v/v)。油脂占據(jù)假絲酵母菌的重量百分比m％＝0.92∑vi/[0.92∑vi+(v-∑vi)]為55％，其中，i表示油滴數(shù)目，vi表示第i個油滴的體積，v代表單個真菌細(xì)胞體積，m％表示中性油脂占據(jù)真菌細(xì)胞的重量百分比。
我們以熱酸解法提取油脂作為對比，檢測該假絲酵母中油脂含量，具體如下：
(1)參考實(shí)施例1的方法制備假絲酵母菌懸液，并且4℃、8000r/min離心5min收集菌體。(2)真空冷凍干燥菌體，取1g干燥菌體放于離心管中加入4mol/l鹽酸10ml，用玻璃棒攪拌均勻，超聲處理30min，超聲頻率為30-40khz。(3)將離心管轉(zhuǎn)移至沸水中沸水浴1h，取出放到冰中冷卻10min，后加入95％乙醇10ml，使溶液充分混合，置于冰浴中10min左右。(4)加入5ml石油醚30-60和5ml乙醚，搖勻，4℃、4800r/min離心4min，小心用膠頭滴管吸取醚液層，放入已知重量的試管中。(5)再加入3ml石油醚30-60，3ml乙醚搖勻，4℃、4800r/min離心4min，小心用膠頭滴管吸取醚液層，放入新的已知重量的試管中，該試管重量記為m1。(6)在烘箱中由低到高逐漸升溫蒸去醚液(防止爆沸)，一般從30℃開始逐漸升溫，60min中內(nèi)從30℃升至90℃，后置90℃烘箱中干燥1h，取出冷卻稱量，直至達(dá)到恒重，重量記為m2，即得微生物油脂重(g)：m＝m2-m1為0.586g。則干菌體含油量x1％＝m/1＝58.6％。
用實(shí)施例1的方法定量中性油脂重量百分比為55％，熱酸解法提取油脂菌體含油量58.6％，誤差低于5％，在可承受范圍制備，考慮到油滴僅為中性脂肪，酸熱解提取的是細(xì)胞總脂肪，因此蘇丹黑染色數(shù)據(jù)低于酸解提取數(shù)據(jù)是可以理解的。但是蘇丹黑染色定量油脂含量方便快捷，節(jié)省時間和試劑，又避免了環(huán)境的污染，方便產(chǎn)油真菌育種工作的高產(chǎn)油脂菌株篩選。
實(shí)施例2
一種快速檢測真菌細(xì)胞內(nèi)中性油脂含量的方法，該真菌細(xì)胞為球形酵母細(xì)胞，屬于球形真菌細(xì)胞，包括以下步驟：
s1，菌體活化，得到活化的真菌細(xì)胞
用接種針無菌操作蘸取球形酵母(購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號：cicc1234)斜面母種上菌苔，四區(qū)劃線于菌種活化培養(yǎng)基平板，置培養(yǎng)箱內(nèi)28℃培養(yǎng)72h，觀察菌苔豐滿、略呈紅色，檢查無雜菌污染可得到活化的球形酵母。
其中，每升所述菌種活化培養(yǎng)基采用pda培養(yǎng)基，制備方法為：馬鈴薯洗凈去皮，切成1cm×1cm×1cm小塊，稱取200g，煮沸半小時，四層紗布過濾取汁，加入20.0g葡萄糖和20.0g的瓊脂，完全溶解后，加蒸餾水定容至1000ml，121℃滅菌30min，自然ph。
s2，液體搖瓶培養(yǎng)，得到真菌細(xì)胞培養(yǎng)液
將活化的球形酵母接種于種子培養(yǎng)基中，在溫度為26-30℃，轉(zhuǎn)速180轉(zhuǎn)/分鐘的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-6d，得到球形酵母種子液。
將球形酵母種子液接種于液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為10％(v/v)，在溫度為26-30℃，轉(zhuǎn)速180轉(zhuǎn)/分鐘的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-6d，得到假絲酵母種子培養(yǎng)液。
其中，每升種子培養(yǎng)基(gmy)含有：磷酸二氫鉀8g、七水合硫酸鎂0.5g、酵母膏3g、葡萄糖40g、溶劑為水，ph為5.5；
液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基采用gmy40培養(yǎng)基，每升gmy40培養(yǎng)基包括：40g的葡萄糖，3g的酵母提取物，8g的kh2po4，0.5g的mgso4·7h2o，溶劑為水，ph為6.0。
s3，利用真菌細(xì)胞培養(yǎng)液制備菌懸液
把球形酵母培養(yǎng)液4℃、8000r/min離心5min收集菌體，用高純水洗滌一次，用高純水稀釋得到合適的細(xì)胞密度的球形酵母菌懸液，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>
s4，蘇丹黑染色
吸取1ml假球形母菌懸液，8000r/min離心3min，收集菌體；加0.6ml的蘇丹黑染液，染色30-60min；8000r/min離心3min，棄上清；加無菌水清洗，8000r/min離心3min，棄上清；加70％乙醇清洗，8000r/min離心3min，棄上清；加無菌水清洗，8000r/min離心3min，棄上清收集固體沉淀并加水重懸浮，得到懸浮液；將懸浮液轉(zhuǎn)移至載玻片，制成水裝片。
其中，蘇丹黑染液的配制方法如下：0.5g蘇丹黑b溶于100ml70％酒精中，水浴加熱煮沸，全部溶解后趁熱過濾，冷卻后冰箱4℃保存?zhèn)溆?，恢?fù)至室溫后使用。
s5，中性油脂含量計算
觀察水裝片上的細(xì)胞內(nèi)黑色油滴，選取著色均勻的視野，用顯微測微尺測量一個或多個視野中的單個真菌細(xì)胞體積v，同時測量該細(xì)胞內(nèi)油滴數(shù)目i與油滴的體積vi。代入公式x％＝(∑vi)/v；其中，x％表示油脂含量體積百分比，v代表單個真菌細(xì)胞體積，v＝(4/3)πr3，其中，π為圓周率，r為真菌細(xì)胞半徑，i表示油滴數(shù)目，vi表示第i個油滴的體積。選取10-50個細(xì)胞分別測定x％，然后取其平均值作為該假絲酵母內(nèi)中性油脂含量體積百分比。
經(jīng)測定球形酵母菌內(nèi)中性油脂含量為19.77％(v/v)。油脂占據(jù)球形酵母菌的重量百分比m％＝0.92∑vi/[0.92∑vi+(v-∑vi)]為18.77％，其中，i表示油滴數(shù)目，vi表示第i個油滴的體積，v代表單個真菌細(xì)胞體積，m％表示中性油脂占據(jù)真菌細(xì)胞的重量百分比。
我們以熱酸解法提取油脂作為對比，檢測該球形酵母中油脂含量，具體如下：
(1)參考實(shí)施例2的方法制備球形酵母菌懸液，并且4℃、8000r/min離心5min收集菌體。(2)真空冷凍干燥菌體，取1g干燥菌體放于離心管中加入4mol/l鹽酸10ml，用玻璃棒攪拌均勻，超聲波30min，超聲頻率為30-40khz。。(3)將離心管轉(zhuǎn)移至沸水中沸水浴1h，取出放到冰中冷卻10min，后加入95％乙醇10ml，使溶液充分混合，置于冰浴中10min左右。(4)加入5ml石油醚30-60和5ml乙醚，搖勻，4℃、4800r/min離心4min，小心用膠頭滴管吸取醚液層，放入已知重量的試管中。(5)再加入3ml石油醚30-60，3ml乙醚搖勻，4℃、4800r/min離心4min，小心用膠頭滴管吸取醚液層，放入新的已知重量的試管中，該試管重量記為m1。(6)在烘箱中由低到高逐漸升溫蒸去醚液(防止爆沸)，一般從30℃開始逐漸升溫，60min中內(nèi)從30℃升至90℃，后置90℃烘箱中干燥1h，取出冷卻稱量，直至達(dá)到恒重，重量記為m2，即得微生物油脂重(g)：m＝m2-m1為0.195g。則干菌體含油量x1％＝m/1＝19.5％。
用實(shí)施例2的方法定量中性油脂重量百分比為18.77％，熱酸解法提取油脂菌體含油量19.5％，誤差低于5％，在可承受范圍制備，考慮到油滴僅為中性脂肪，酸熱解提取的是細(xì)胞總脂肪，因此蘇丹黑染色數(shù)據(jù)低于酸解提取數(shù)據(jù)是可以理解的。但是蘇丹黑染色定量油脂含量方便快捷，節(jié)省時間和試劑，又避免了環(huán)境的污染，方便產(chǎn)油真菌育種工作的高產(chǎn)油脂菌株篩選。
實(shí)施例3
一種快速檢測真菌細(xì)胞內(nèi)中性油脂含量的方法，該真菌細(xì)胞為斯達(dá)氏油脂酵母細(xì)胞，屬于橢球型真菌細(xì)胞，包括以下步驟：
s1，菌體活化，得到活化的真菌細(xì)胞
用接種針無菌操作蘸取斯達(dá)氏油脂酵母(購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌株保藏編號：cicc1809)斜面母種上菌苔，四區(qū)劃線于菌種活化培養(yǎng)基平板，置培養(yǎng)箱內(nèi)28℃培養(yǎng)72h，觀察菌苔豐滿、略呈紅色，檢查無雜菌污染可得到活化的斯達(dá)氏油脂酵母。
其中，每升所述菌種活化培養(yǎng)基采用pda培養(yǎng)基，制備方法為：馬鈴薯洗凈去皮，切成1cm×1cm×1cm小塊，稱取200g，煮沸半小時，四層紗布過濾取汁，加入20.0g葡萄糖和20.0g的瓊脂，完全溶解后，加蒸餾水定容至1000ml，121℃滅菌30min，自然ph。
s2，液體搖瓶培養(yǎng)，得到真菌細(xì)胞培養(yǎng)液
將活化的斯達(dá)氏油脂酵母接種于種子培養(yǎng)基中，在溫度為26-30℃，轉(zhuǎn)速180轉(zhuǎn)/分鐘的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-6d，得到斯達(dá)氏油脂酵母種子液。
將斯達(dá)氏油脂酵母種子液接種于液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為10％(v/v)，在溫度為26-30℃，轉(zhuǎn)速180轉(zhuǎn)/分鐘的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-6d，得到假絲酵母種子培養(yǎng)液。
其中，每升種子培養(yǎng)基(gmy)含有：磷酸二氫鉀8g、七水合硫酸鎂0.5g、酵母膏3g、葡萄糖40g、溶劑為水，ph為5.5；
液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基采用gmy40培養(yǎng)基，每升gmy40培養(yǎng)基包括：40g的葡萄糖，3g的酵母提取物，8g的kh2po4，0.5g的mgso4·7h2o，溶劑為水，ph為6.0。
s3，利用真菌細(xì)胞培養(yǎng)液制備菌懸液
把斯達(dá)氏油脂酵母培養(yǎng)液4℃、8000r/min離心5min收集菌體，用高純水洗滌一次，用高純水稀釋得到合適的細(xì)胞密度的斯達(dá)氏油脂酵母菌懸液，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>
s4，蘇丹黑染色
吸取1ml假斯達(dá)氏油脂母菌懸液，8000r/min離心3min，收集菌體；加0.6ml的蘇丹黑染液，染色30-60min；8000r/min離心3min，棄上清；加無菌水清洗，8000r/min離心3min，棄上清；加70％乙醇清洗，8000r/min離心3min，棄上清；加無菌水清洗，8000r/min離心3min，棄上清，收集固體沉淀并加水重懸浮，得到懸浮液；將懸浮液轉(zhuǎn)移至載玻片，制成水裝片。
其中，蘇丹黑染液的配制方法如下：0.5g蘇丹黑b溶于100ml70％酒精中，水浴加熱煮沸，全部溶解后趁熱過濾，冷卻后冰箱4℃保存?zhèn)溆?，恢?fù)至室溫后使用。
s5，中性油脂含量計算
觀察水裝片上的細(xì)胞內(nèi)黑色油滴，選取著色均勻的視野，用顯微測微尺測量一個或多個視野中的單個真菌細(xì)胞體積v，同時測量該細(xì)胞內(nèi)油滴數(shù)目i與油滴的體積vi。代入公式x％＝(∑vi)/v；其中，x％表示油脂含量體積百分比，v代表單個真菌細(xì)胞體積，v＝(3/4)πabc，其中，π為圓周率，a為真菌細(xì)胞沿x軸的赤道半徑，b為真菌細(xì)胞沿y軸的赤道半徑，c為真菌細(xì)胞沿z軸的極半徑，i表示油滴數(shù)目，vi表示第i個油滴的體積。選取10-50個細(xì)胞分別測定x％，然后取其平均值作為該假絲酵母內(nèi)中性油脂含量體積百分比。
經(jīng)測定斯達(dá)氏油脂酵母菌內(nèi)中性油脂含量為39.77％(v/v)。油脂占據(jù)斯達(dá)氏油脂酵母菌的重量百分比m％＝0.92∑vi/[0.92∑vi+(v-∑vi)]為38.86％，其中，i表示油滴數(shù)目，vi表示第i個油滴的體積，v代表單個真菌細(xì)胞體積，m％表示中性油脂占據(jù)真菌細(xì)胞的重量百分比。
我們以熱酸解法提取油脂作為對比，檢測該斯達(dá)氏油脂酵母中油脂含量，具體如下：
(1)參考實(shí)施例3的方法制備斯達(dá)氏油脂酵母菌懸液，并且4℃、8000r/min離心5min收集菌體。(2)真空冷凍干燥菌體，取1g干燥菌體放于離心管中加入4mol/l鹽酸10ml，用玻璃棒攪拌均勻，超聲波30min，超聲頻率為40khz。。(3)將離心管轉(zhuǎn)移至沸水中沸水浴1h，取出放到冰中冷卻10min，后加入95％乙醇10ml，使溶液充分混合，置于冰浴中10min左右。(4)加入5ml石油醚30-60和5ml乙醚，搖勻，4℃、4800r/min離心4min，小心用膠頭滴管吸取醚液層，放入已知重量的試管中。(5)再加入3ml石油醚30-60，3ml乙醚搖勻，4℃、4800r/min離心4min，小心用膠頭滴管吸取醚液層，放入新的已知重量的試管中，該試管重量記為m1。(6)在烘箱中由低到高逐漸升溫蒸去醚液(防止爆沸)，一般從30℃開始逐漸升溫，60min中內(nèi)從30℃升至90℃，后置90℃烘箱中干燥1h，取出冷卻稱量，直至達(dá)到恒重，重量記為m2，即得微生物油脂重(g)：m＝m2-m1為0.402g。則干菌體含油量x1％＝m/1＝40.2％。
用實(shí)施例3的方法定量中性油脂重量百分比為38.86％，熱酸解法提取油脂菌體含油量40.2％，誤差低于5％，在可承受范圍制備，考慮到油滴僅為中性脂肪，酸熱解提取的是細(xì)胞總脂肪，因此蘇丹黑染色數(shù)據(jù)低于酸解提取數(shù)據(jù)是可以理解的。但是蘇丹黑染色定量油脂含量方便快捷，節(jié)省時間和試劑，又避免了環(huán)境的污染，方便產(chǎn)油真菌育種工作的高產(chǎn)油脂菌株篩選。
需要說明的是，上述實(shí)施例1-3中蘇丹黑染液的用量可根據(jù)菌體總量的多少進(jìn)行不同程度的調(diào)整，盡管已描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，但本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員一旦得知了基本創(chuàng)造性概念，則可對這些實(shí)施例作出另外的變更和修改。所以，所附權(quán)利要求意欲解釋為包括優(yōu)選實(shí)施例以及落入本發(fā)明范圍的所有變更和修改。
顯然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對本發(fā)明進(jìn)行各種改動和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)的范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動和變型在內(nèi)。