本發(fā)明屬于食品致病菌檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種牡蠣中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的快速檢測方法。
背景技術(shù)：
食源性致病菌是引起食源性疾病的首要原因，食源性致病菌對人類健康造成極大危害，是食品安全的重大隱患。食源性疾病并不隨經(jīng)濟(jì)發(fā)展和技術(shù)進(jìn)步而減少或消失，世界范圍內(nèi)食品安全惡性事件接連發(fā)生，食源性疾病未能受到有效控制，食源性疾病發(fā)生率居高不下，食品安全形勢嚴(yán)峻。盡管政府監(jiān)管部門不斷加大對食品安全的監(jiān)管力度，對食品安全研究領(lǐng)域科研投入逐年加大，同時食品企業(yè)也不斷提高生產(chǎn)過程中食品安全意識，引進(jìn)了haccp等先進(jìn)的管理體系來確保食品安全，但是食源性致病菌污染食品進(jìn)而導(dǎo)致食源性疾病暴發(fā)日益頻繁。目前對致病菌污染食品途徑控制當(dāng)中，還無法找到一種完全有效杜絕致病菌污染的方式，開發(fā)出快速靈敏實(shí)用性強(qiáng)的致病菌檢測方法就成為確保食品安全的一個重要保障。
現(xiàn)階段常用的快速檢測方法雖然得到廣泛應(yīng)用，常規(guī)pcr和免疫學(xué)檢測方法,通常面臨的問題是檢測方法靈敏度不夠高，一般食品樣品經(jīng)過選擇性增菌處理后，待檢細(xì)菌濃度要達(dá)到104-105cfu/ml才能得到比較準(zhǔn)確結(jié)果，當(dāng)食品樣品中存在防腐劑，天然抗菌，抑菌成分時，往往待檢致病菌濃度達(dá)不到檢測限，導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性結(jié)果。
綜上，現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)是，檢測方法靈敏度不夠高，容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供的一種牡蠣中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的快速檢測方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)的常規(guī)pcr和免疫學(xué)檢測方法靈敏度不夠高，容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果的問題。
本發(fā)明的目的是提供一種牡蠣中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的快速檢測方法，包括以下步驟：
s1，收集待測樣品
s2，制備環(huán)糊精處理樣品
向待測牡蠣樣品中加無菌生理鹽水，均質(zhì)處理，加入環(huán)糊精，并使溶液中環(huán)糊精最終濃度為10g/100ml，均質(zhì)處理，低速離心去除大顆粒物質(zhì)，所得上清液高速離心，將沉淀物溶于0.01m醋酸生理鹽水緩沖液，得到環(huán)糊精處理樣品；
s3，制備膨潤土包被活性炭
活性炭用去離子清洗，瀝干備用；向膨潤土中加入去離子水，膨潤土與去離子水的比例為1g：50ml，震蕩1min，700rpm離心1min，棄沉淀，將上層溶液轉(zhuǎn)至干凈的容器中，加入瀝干的活性炭，上層溶液與瀝干的活性炭之間的比為例為4ml：1g，37℃搖床過夜，隨后55℃烘干，得到膨潤土包被活性炭；
s4，制備膨潤土包被活性炭處理樣品
用0.85％生理鹽水清洗膨潤土包被活性炭，將環(huán)糊精處理樣品與清洗好的膨潤土包被活性炭混合，室溫震蕩；將震蕩后的混合物轉(zhuǎn)移至裝有玻璃棉的容器內(nèi)，用醋酸生理鹽水緩沖液清洗并收集洗脫液；洗脫液離心，棄去上清液；將沉淀懸浮在5mg/ml牛血清白蛋白溶液中，加入0.05mg/ml鮭魚精dna溶液和去離子水；沸水浴，得到的細(xì)胞裂解物冰上冷卻至室溫，離心，加入等量體積4℃預(yù)冷的無水乙醇，離心，棄去上清液，保留沉淀的dna，加入無菌去離子水溶解沉淀的dna，得到dna模板，備用；
s5，pcr檢測
pcr檢測使用的引物序列為：
inlb1：5’-aatcactttctttggagcataatggtataagtg-3’
inlb2：5’-gttccatcaacatcataacttactgtgtaaacc-3’
如果獲得的pcr檢測產(chǎn)物片段為279bp，則結(jié)果為陽性。
優(yōu)選的，上述牡蠣中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的快速檢測方法中，每升0.01m醋酸生理鹽水緩沖液中溶質(zhì)為0.01mol的乙酸和0.01mol的乙酸鈉，溶劑為0.85％nacl溶液，用0.1m鹽酸調(diào)節(jié)ph為5.0。
優(yōu)選的，上述牡蠣中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的快速檢測方法中，s2的具體步驟為：取待測牡蠣樣品中加入無菌0.85％生理鹽水，待測牡蠣樣品與無菌0.85％生理鹽水的比例為1g：3ml，均質(zhì)處理，加入環(huán)糊精，并使溶液中環(huán)糊精最終濃度為10g/100ml，繼續(xù)均質(zhì)2min，低速離心1000rpm、5min，去除大顆粒物質(zhì)，所得上清液高速離心10000rpm、10min，將沉淀物溶于0.01m醋酸生理鹽水緩沖液，得到環(huán)糊精處理樣品。
優(yōu)選的，上述牡蠣中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的快速檢測方法中，s3中，所述活性炭為200目的粉末。
優(yōu)選的，上述牡蠣中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的快速檢測方法中，s3中，每120ml上層溶液中含有1.52g的膨潤土。
優(yōu)選的，上述牡蠣中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的快速檢測方法中，s4中，膨潤土包被活性炭與環(huán)糊精處理樣品的比例為4.6g：30ml。
優(yōu)選的，上述牡蠣中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的快速檢測方法中，s4中，所述將沉淀懸浮在5mg/ml牛血清白蛋白溶液中，加入0.05mg/ml鮭魚精dna溶液和去離子水中，牛血清白蛋白溶液、鮭魚精dna溶液和去離子水的體積比例為1:1:3。
優(yōu)選的，上述牡蠣中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的快速檢測方法中，s5中，pcr采用50μlpcr反應(yīng)體系：5μl10×pcrbuffer，4μldntps混合物，0.5μl引物inlb1，0.5μl引物inlb2，0.25μltaqdna聚合酶，模板1μl，ddh2o38.75μl；
pcr反應(yīng)條件為：94℃，4min預(yù)變性；94℃，20s變性；60℃，20s退火；72℃，50s延伸，35個循環(huán)；72℃，10min終延伸；4℃保存。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，一種牡蠣中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的快速檢測方法，具有以下有益效果：
(1)本發(fā)明的方法是一種從牡蠣中靈敏快速實(shí)用性強(qiáng)無需前增菌的pcr檢測方法，大大縮短目前常規(guī)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢測及快速檢測方法的檢測時間(新建立的檢測方法對樣品的檢測時間為4小時)，且檢測限僅為10cfu/25g，檢測靈敏度高，不容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果，可以確保食品從農(nóng)場到餐桌流通過程中的食品安全實(shí)時檢測，進(jìn)而更好地確保消費(fèi)者健康。
(2)由于食品中含有大量的pcr反應(yīng)抑制因子，比如脂肪，蛋白質(zhì)，酶，抗生素，有機(jī)和無機(jī)化學(xué)物質(zhì)，多糖類物質(zhì)等，這些抑制因子極大地影響了pcr方法對食品中致病菌檢測的應(yīng)用。目前，對于克服pcr反應(yīng)抑制因子的方法是通過檢測前12-24小時增菌的手段，提高檢測的靈敏度，但同時也延長了檢測時間。
本發(fā)明的目的是建立有效的樣品處理方法提高致病菌從食品中的回收率，消除pcr反應(yīng)抑制因子。β-環(huán)糊精(β-cyclodextrin)是一種環(huán)狀多糖化合物，其中七個葡萄糖單體與一個特定體積的中空內(nèi)部形成一個截短的錐形結(jié)構(gòu)。它的疏水性空洞內(nèi)可嵌入各種有機(jī)化合物，形成包接復(fù)合物，并改變被包絡(luò)物的物理和化學(xué)性質(zhì)?；钚蕴烤哂袠O強(qiáng)的吸附能力，這種吸附能力會受到碳表面化學(xué)結(jié)構(gòu)的強(qiáng)烈影響。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)工作證實(shí)，定量的膨潤土結(jié)合活性炭，并于β-環(huán)糊精結(jié)合使用，可以有效的將致病菌從食品中分離，并且能夠有效的去除pcr反應(yīng)抑制因子，另外在樣品處理過程中添加定量鮭魚精dna可以進(jìn)一步去除pcr反應(yīng)抑制因子，提高檢測靈敏度，所以新建立的檢測方法對樣品的檢測時間僅需要4小時。經(jīng)申請人實(shí)驗(yàn)證明，如果不采用膨潤土、活性炭、β-環(huán)糊精、鮭魚精dna則pcr檢測結(jié)果難以辨別，甚至無法得到pcr擴(kuò)增結(jié)果。
從而，本發(fā)明針對單核細(xì)胞增生李斯特氏菌為檢測目標(biāo)，建立一種從牡蠣中靈敏快速實(shí)用性強(qiáng)無需前增菌的pcr檢測方法。
附圖說明
圖1是陽性和陰性檢測結(jié)果電泳圖；
其中，m泳道為dnamaker，1號泳道為陽性檢測結(jié)果，2號泳道為陰性檢測結(jié)果。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但不應(yīng)理解為本發(fā)明的限制。下面實(shí)例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，均按照本領(lǐng)域的常規(guī)方法和條件進(jìn)行。
實(shí)施例1
一種牡蠣中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的快速檢測方法，包括以下步驟：
s1，收集待測樣品
本實(shí)施例1收集的待測樣品為人工污染樣品，人工污染樣品按以下方法制備：取25g牡蠣樣品人工污染1ml單核細(xì)胞增生李斯特氏菌菌懸液(濃度范圍分別為100cfu/ml、101cfu/ml、102cfu/ml、103cfu/ml、104cfu/ml、105cfu/ml)，人工污染的樣品放入4℃冰箱中保存過夜，確保致病菌有效的吸附在樣品上，得到人工污染樣品，檢測開始前要對樣品中的待檢致病菌濃度進(jìn)行實(shí)際測試，測試方法參照現(xiàn)行國家食品中各種致病菌檢測方法進(jìn)行。
s2，制備環(huán)糊精處理樣品
取25g人工污染樣品中加入75ml無菌0.85％生理鹽水，利用均質(zhì)機(jī)進(jìn)行均質(zhì)處理，加入環(huán)糊精溶液，并使溶液中環(huán)糊精最終濃度為10g/100ml，繼續(xù)均質(zhì)處理2min，低速離心1000rpm、5min，去除大顆粒物質(zhì)，所得上清液高速離心10000rpm、10min，將沉淀物溶于30ml0.01m醋酸生理鹽水緩沖液，得到環(huán)糊精處理樣品。
其中，每升0.01m醋酸生理鹽水緩沖液中溶質(zhì)為0.01mol的乙酸和0.01mol的乙酸鈉，溶劑為0.85％nacl溶液，用0.1m鹽酸調(diào)節(jié)ph為5.0。
s3，制備膨潤土包被活性炭
將200目的活性炭用去離子清洗3次，瀝干備用。向4g膨潤土中加入200ml去離子水，震蕩1min，700rpm離心1min，棄沉淀，將120ml含有1.52g的膨潤土的上層溶液轉(zhuǎn)至1升的燒杯，加入30g瀝干的活性炭(濕重)，燒杯放在旋轉(zhuǎn)搖床中150rpm、37℃搖床過夜(≥12h)，隨后將燒杯中的溶液放置在55℃烘箱中烘干，直至膨潤土包被的活性炭變干(水分含量≤1％)，得到膨潤土包被活性炭。
需要說明的是，膨潤土需要先進(jìn)行清洗，除掉一些雜質(zhì)，才能使用，我們實(shí)驗(yàn)證實(shí)了離心后的膨潤土溶液中膨潤土的含量是1.52g/120ml，所以不能直接將1.52g的膨潤土加入到120ml水中，否則會影響檢測結(jié)果。
s4，制備膨潤土包被活性炭處理樣品
取4.6g膨潤土包被活性炭加入到250ml燒杯中，用20ml0.85％生理鹽水清洗2次，將30ml環(huán)糊精處理樣品與清洗好的膨潤土包被活性炭混合，混合物在室溫下160rpm旋轉(zhuǎn)震蕩15min；取0.2g無菌玻璃棉放至50ml無菌塑料注射器底部，將震蕩后的混合物轉(zhuǎn)移至裝有玻璃棉的注射器內(nèi)，以無菌離心管為收集容器，用醋酸生理鹽水緩沖液清洗直至在無菌離心管中收集到30ml洗脫液。30ml洗脫液經(jīng)10000rpm離心10min，棄去上清液保留沉淀。沉淀懸浮在0.5ml含有100μl5mg/ml牛血清白蛋白溶液中，加入100μl0.05mg/ml鮭魚精dna溶液和300μl去離子水。
將離心管放入沸水中，沸水浴熱裂解細(xì)胞10min，將得到的細(xì)胞裂解物冰上冷卻至室溫，12000rpm離心5min，將上清液轉(zhuǎn)移至干凈離心管內(nèi)，加入等量體積4℃預(yù)冷的無水乙醇，以沉淀dna，離心管再次12000離心15min，棄去上清液，保留沉淀，加入100μl無菌去離子水溶解沉淀的dna，dna樣品分裝，每份10μl，得到dna模板，備用。
s5，pcr檢測
針對單核細(xì)胞增生李斯特氏菌毒力基因(inlb)設(shè)計(jì)特異引物序列，優(yōu)化反應(yīng)條件。所述引物序列為：
inlb1：5’-aatcactttctttggagcataatggtataagtg-3’
inlb2：5’-gttccatcaacatcataacttactgtgtaaacc-3’
50μlpcr反應(yīng)體系：5μl10×pcrbuffer，4μldntps混合物，0.5μl引物inlb1(40μmol/l)，0.5μl引物inlb2(40μmol/l)，0.25μl(5u/μl)taqdna聚合酶，模板1μl，ddh2o38.75μl。
pcr反應(yīng)條件：94℃，4min預(yù)變性；94℃，20s變性；60℃，20s退火；72℃，50s延伸，35個循環(huán)；72℃，10min終延伸；4℃保存。
如果獲得的pcr檢測產(chǎn)物片段為279bp，則結(jié)果為陽性，陽性和陰性檢測結(jié)果電泳圖如圖1所示。其中，m泳道為dnamaker，1號泳道為陽性檢測結(jié)果，2號泳道為陰性檢測結(jié)果。
需要說明的是，實(shí)施例1中使用的環(huán)糊精是β-環(huán)糊精。
我們對市場上出售的牡蠣進(jìn)行實(shí)際測試，提取單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，其他李斯特氏菌及非李斯特氏菌的dna作為模版，利用本檢測方法pcr反應(yīng)體系來驗(yàn)證檢測方法的特異性。
實(shí)驗(yàn)組s1中收集的是市售牡蠣，其余步驟均與實(shí)施例1的方法相同。以已經(jīng)公開發(fā)表的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢測引物特異性(prfa:cccaagtagcaggacatgctaa；ggtatcacaaagctcacgag)作為對照，其余操作同實(shí)驗(yàn)組。同時以現(xiàn)行國家食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢測標(biāo)準(zhǔn)方法作為對比，來驗(yàn)證新建立的pcr檢測方法的實(shí)用性，結(jié)果見表1。
表1結(jié)果表明，實(shí)施例1采用的引物序列具有較好的特異性，只對單核細(xì)胞增生李斯特氏菌呈陽性檢測結(jié)果，而對其他李斯特氏菌及非李斯特氏菌呈陰性檢測結(jié)果。而另外一種prfa引物對于部分單核細(xì)胞增生李斯特氏菌呈陰性結(jié)果，部分其他李斯特氏菌檢測呈陽性結(jié)果，表明該引物序列的特異性并不是很理想，存在假陰性檢測結(jié)果的缺陷?，F(xiàn)行國家食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢測標(biāo)準(zhǔn)方法與實(shí)施例1的結(jié)果相同，故表1中僅以inlb特異性結(jié)果來表征。
表1檢測方法的特異性
注：表1中“+”表示陽性結(jié)果，“—”表示陰性結(jié)果。
將不同濃度的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌人工污染到牡蠣中，利用實(shí)施例1的檢測方法進(jìn)行檢測，確定實(shí)施例1的檢測靈敏度，結(jié)果見表2。由表2可知，實(shí)施例1的檢測方法的檢測靈敏度為10cfu/25g，且穩(wěn)定性良好。
表2檢測方法的靈敏度
注：表1中“+”表示陽性結(jié)果，“—”表示陰性結(jié)果。
采集市售新鮮牡蠣樣品200份，分別采用快速檢測方法和現(xiàn)行國家檢測標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測對比，用來驗(yàn)證該快速檢測方法的實(shí)用性，結(jié)果見表3。由表3可知，實(shí)施例1的方法與現(xiàn)有國家標(biāo)準(zhǔn)方法的檢出率、符合率和活體菌檢測率均相同，但是實(shí)施例1的方法檢測時間明顯縮短，僅為4小時。
表3實(shí)際樣品測試結(jié)果
需要說明的是，本發(fā)明權(quán)利要求書中涉及數(shù)值范圍時，應(yīng)理解為每個數(shù)值范圍的兩個端點(diǎn)以及兩個端點(diǎn)之間任何一個數(shù)值均可選用，由于采用的步驟方法與實(shí)施例相同，為了防止贅述，本發(fā)明的描述了優(yōu)選的實(shí)施例1，盡管已描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，但本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員一旦得知了基本創(chuàng)造性概念，則可對這些實(shí)施例作出另外的變更和修改。所以，所附權(quán)利要求意欲解釋為包括優(yōu)選實(shí)施例以及落入本發(fā)明范圍的所有變更和修改。
顯然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對本發(fā)明進(jìn)行各種改動和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)的范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動和變型在內(nèi)。