本發(fā)明公開了一種audg介導(dǎo)的多交叉置換擴(kuò)增結(jié)合生物傳感檢測微生物目的基因的方法，屬于微生物和分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域，核酸擴(kuò)增是一種不可缺少的技術(shù)，廣泛運(yùn)用于基礎(chǔ)研究、臨床診斷、考古研究、流行病研究、轉(zhuǎn)基因研究等領(lǐng)域。在已經(jīng)發(fā)展的核酸擴(kuò)增技術(shù)中，pcr是第一個(gè)被建立的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，具有劃時(shí)代意義，現(xiàn)已被廣泛運(yùn)用于生物相關(guān)領(lǐng)域。然而，pcr進(jìn)行核酸擴(kuò)增時(shí)，受實(shí)驗(yàn)室的條件限制，依賴于復(fù)雜昂貴的熱循環(huán)儀器。此外，pcr產(chǎn)物的檢測比較復(fù)雜，需要一套復(fù)雜的流程及設(shè)備。這些劣勢限制了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用，尤其在經(jīng)濟(jì)落后的地區(qū)及快速診斷領(lǐng)域。因此，對于生物及醫(yī)學(xué)相關(guān)研究領(lǐng)域而言，非常有必要發(fā)展簡單、快速、敏感的核酸擴(kuò)增方法。

為了克服pcr擴(kuò)增技術(shù)的劣勢，應(yīng)運(yùn)而生了許多恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。較pcr技術(shù)而言，恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)不依賴于熱循環(huán)擴(kuò)增設(shè)備，反應(yīng)速度快，敏感性好。有利于實(shí)現(xiàn)快速擴(kuò)增，便捷檢測及現(xiàn)場診斷。到目前為止，已發(fā)展的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)有10種，應(yīng)用較為廣泛的有滾環(huán)擴(kuò)增(rca)、鏈置換擴(kuò)增(sda)、解旋酶依賴的恒溫?cái)U(kuò)增(hda)、環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(lamp)、交叉擴(kuò)增(cpa)等。然而，這些恒溫技術(shù)實(shí)現(xiàn)核酸擴(kuò)增需要多種酶同時(shí)工作，依賴于昂貴的試劑，復(fù)雜的操作步驟。因此這些方法的實(shí)用性、便捷性、可操作性有待于提高，尤其是在快速診斷領(lǐng)域及欠發(fā)達(dá)地區(qū)。

為了克服pcr技術(shù)及現(xiàn)有恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的劣勢，實(shí)現(xiàn)便捷、快速、敏感及特異的擴(kuò)增核酸序列，發(fā)明人近期已經(jīng)建立了一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù)，命名為多交叉置換擴(kuò)增(multiplecrossdisplacementamplification，mcda)，相關(guān)內(nèi)容公開于cn104946744a，該專利文件作為現(xiàn)有技術(shù)文件構(gòu)成本申請說明書的一個(gè)部分。mcda在恒溫條件下實(shí)現(xiàn)核酸擴(kuò)增，僅使用一種恒溫置換酶、擴(kuò)增速度快、反應(yīng)靈敏、特異性高。

類似于環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(lamp)和交叉擴(kuò)增(cpa)，mcda的技術(shù)瓶頸在結(jié)果的判讀，即擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測。到目前為止，最常見的檢測手段主要包括顏色指示劑、電泳、實(shí)時(shí)濁度。這三種產(chǎn)物檢測技術(shù)僅僅適用于單一基因靶標(biāo)檢測，顏色指示劑判讀時(shí)會出現(xiàn)模擬兩可的結(jié)果，電泳判讀結(jié)果時(shí)耗時(shí)較長，容易出現(xiàn)交叉污染，不適合于現(xiàn)場檢測，實(shí)時(shí)濁度判讀時(shí)需要特殊的儀器設(shè)備。為了克服這三種產(chǎn)物檢測技術(shù)的劣勢，使mcda技術(shù)在生物、醫(yī)藥及衛(wèi)生領(lǐng)域應(yīng)用更廣泛、更經(jīng)濟(jì)。近期，發(fā)明人以mcda為基礎(chǔ)，將mcda技術(shù)與納米生物檢測技術(shù)相結(jié)合，開發(fā)了依賴mcda技術(shù)、實(shí)現(xiàn)快速，敏感檢測的納米生物傳感技術(shù)，該技術(shù)被命名為多交叉恒溫?cái)U(kuò)增結(jié)合高分子納米生物傳感的核酸診斷技術(shù)(multiplecrossdisplacementamplificationlabel-basedgoldnanoparticleslateralflowbiosensor,mcda-lfb)，相關(guān)內(nèi)容公開于cn201610872509.4；cn201610942289.8；cn201610982015.1；該專利文件作為現(xiàn)有技術(shù)文件構(gòu)成本申請說明書的一個(gè)部分。

為了將擴(kuò)增產(chǎn)物適用于生物傳感技術(shù)，傳統(tǒng)的策略是在擴(kuò)增體系中同時(shí)添加兩條標(biāo)記的引物，一條引物在5’端標(biāo)記半抗原，另一條引物在5’端標(biāo)記生物素。當(dāng)擴(kuò)增完畢，雙標(biāo)的擴(kuò)增產(chǎn)物被構(gòu)建(該雙標(biāo)的產(chǎn)物起源于兩條標(biāo)記的引物)，一端標(biāo)記半抗原，另一端標(biāo)記生物素。然而，傳統(tǒng)策略構(gòu)建雙標(biāo)記的產(chǎn)物容易導(dǎo)致假陽性結(jié)果，甚至不需要擴(kuò)增就能導(dǎo)致假陽性結(jié)果。該假陽性結(jié)果來源于標(biāo)記引物之間的雜交。因此，為了克服傳統(tǒng)標(biāo)記策略的劣勢，本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種新的檢測策略，該技術(shù)只需一條標(biāo)記的引物就能構(gòu)建雙標(biāo)的擴(kuò)增產(chǎn)物，從而將擴(kuò)增產(chǎn)物適用于生物傳感技術(shù)。此外，為了將擴(kuò)增產(chǎn)物適用于生物傳感技術(shù)的檢測，打開反應(yīng)管是一個(gè)必須的步驟，該步驟會導(dǎo)致大量的擴(kuò)增產(chǎn)物以氣溶膠的形式揮發(fā)，從而導(dǎo)致交叉污染。為了克服交叉污染和傳統(tǒng)策略導(dǎo)致的假陽性結(jié)果，在本發(fā)明中，發(fā)明人旨在利用單標(biāo)記的引物和南極熱敏尿嘧啶脫氧核酸糖基化酶(audg)，以mcda技術(shù)為基礎(chǔ)，開發(fā)南極熱敏尿嘧啶脫氧核酸糖基化酶介導(dǎo)的多交置換擴(kuò)增結(jié)合高分子納米生物傳感的核酸檢測技術(shù)(antarcticthermalsensitiveuracil-dna-glycosylase-supplementedmultiplecrossdisplacementamplificationlabel-basednanoparticleslateralflowbiosensorforsimultaneouseliminationofcarryovercontaminationanddetectionofnucleicacidsequence,audg-mcda-lfb)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于上述發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供了一種audg介導(dǎo)的多交叉恒溫?cái)U(kuò)增結(jié)合高分子納米生物傳感檢測目的基因的方法(audg-mcda-lfb)，為了驗(yàn)證audg-mcda-lfb技術(shù)的可行性，兩個(gè)高危型人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus,hpv)hpv16的e7基因和hpv18的l1基因被應(yīng)用于audg-mcda-lfb技術(shù)，所述方法包括以下步驟：

(1)提取待檢測樣品的基因組；

(2)提供針對hpv16的e7基因的第一套引物：置換引物f1和f2，所述置換引物f1的序列如seqidno:1所示，所述置換引物f2的序列如seqidno:2所示；提供交叉引物cp1和cp2，所述交叉引物cp1的序列如seqidno:3所示，所述交叉引物cp2的序列如seqidno:6所示；同時(shí)提供在交叉引物cp1或cp2的5’端標(biāo)記有半抗原的交叉引物cp1*或cp2*；提供擴(kuò)增引物c1和c2，d1和d2，r1和r2，引物c1的序列如seqidno:7所示，引物c2的序列如seqidno:8所示；引物d1的序列如seqidno:9所示，引物d2的序列如seqidno:10所示，引物r1的序列如seqidno:11所示，引物r2的序列如seqidno:12所示，和/或

提供針對hpv18的l1基因的第二套引物：置換引物f1和f2，所述置換引物f1的序列如seqidno:13所示，所述置換引物f2的序列如seqidno:14所示；提供交叉引物cp1和cp2，所述交叉引物cp1的序列如seqidno:15所示，所述交叉引物cp2的序列如seqidno:18所示；同時(shí)提供在交叉引物cp1或cp2的5’端標(biāo)記有半抗原的交叉引物cp1*或cp2*；提供擴(kuò)增引物c1和c2，d1和d2，r1和r2，引物c1的序列如seqidno:19所示，引物c2的序列如seqidno:20所示；引物d1的序列如seqidno:21所示，引物d2的序列如seqidno:22所示，引物r1的序列如seqidno:23所示，引物r2的序列如seqidno:24所示；

(4)在南極熱敏尿嘧啶脫氧核酸糖基化酶、鏈移位型聚合酶、解鏈溫度調(diào)節(jié)劑、引物、常規(guī)的dntp，以及生物素化的脫氧尿嘧啶存在下，使用待檢測樣品的基因組核酸作為模板恒溫?cái)U(kuò)增dna；

(5)使用高分子納米生物傳感器檢測步驟(4)的擴(kuò)增產(chǎn)物。

在一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，兩套引物中的所述交叉引物cp1*或cp2*的5’端標(biāo)記的半抗原彼此不同；當(dāng)在一條所述交叉引物cp1*或cp2*的5’端標(biāo)記熒光素時(shí)，則在另一條所述交叉引物cp1*或cp2*的5’端標(biāo)記地高辛。

在一個(gè)更為優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述高分子納米生物傳感器包括一背板1，在所述背板1上依次設(shè)置裝有樣品墊2、金標(biāo)墊3、硝酸纖維素膜4及吸水墊5，在所述硝酸纖維素膜4上依次設(shè)置檢測線41、檢測線42及控制線43，在金標(biāo)墊3、檢測線41、檢測線42及控制線43區(qū)域依次包被有色基團(tuán)修飾的親和素化的高分子納米粒子6、抗熒光素抗體7、抗地高辛抗體8及生物素偶聯(lián)的牛血清蛋白9。

在另一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述恒溫?cái)U(kuò)增是在61-64℃的環(huán)境中進(jìn)行的。

在一個(gè)更為優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述恒溫?cái)U(kuò)增是在63℃的環(huán)境中進(jìn)行的。

優(yōu)選地，所述目的基因?yàn)閔pv16型的e7基因或者h(yuǎn)pv18型的l1基因。

在一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，在所述第一套引物中的交叉引物cp1的5’端標(biāo)記有熒光素的所述交叉引物cp1*的序列如seqidno:5所示，或者在所述第二套引物中的交叉引物cp1的5’端標(biāo)記有地高辛的所述交叉引物cp1*的序列如seqidno:17所示。

本發(fā)明還提供了一組用于恒溫?cái)U(kuò)增hpv16型的e7基因的引物序列，所述序列包括：如seqidno:1所示的置換引物f1，如seqidno:2所示的置換引物f2，如seqidno:3所示的交叉引物cp1，如seqidno:6所示的交叉引物cp2，如seqidno:7所示的擴(kuò)增引物c1，如seqidno:8所示的擴(kuò)增引物c2，如seqidno:9所示的擴(kuò)增引物d1，如seqidno:10所示的擴(kuò)增引物d2，如seqidno:11所示的擴(kuò)增引物r1，如seqidno:12所示的擴(kuò)增引物r2，同時(shí)還提供在交叉引物cp1或cp2的5’端標(biāo)記有半抗原的交叉引物cp1*或cp2*。

本發(fā)明還提供了一組用于恒溫?cái)U(kuò)增hpv18型的l1基因的引物序列，其特征在于，所述序列包括：如seqidno:13所示的置換引物f1，如seqidno:14所示的置換引物f2，如seqidno:15所示的交叉引物cp1，如seqidno:18所示的交叉引物cp2，如seqidno:19所示的擴(kuò)增引物c1，如seqidno:20所示的擴(kuò)增引物c2，如seqidno:21所示的擴(kuò)增引物d1，如seqidno:22所示的擴(kuò)增引物d2，如seqidno:23所示的擴(kuò)增引物r1，如seqidno:24所示的擴(kuò)增引物r2，同時(shí)還提供在交叉引物cp1或cp2的5’端標(biāo)記有半抗原的交叉引物cp1*或cp2*。

在一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，在交叉引物cp1*或cp2*的5’端標(biāo)記的半抗原為熒光素或者地高辛。

本發(fā)明所提供的方法針對hpv16型的e7基因或者h(yuǎn)pv18型的l1基因的擴(kuò)增產(chǎn)物能被高分子納米生物傳感器可視化檢測。所述方法便捷、快速、敏感、特異，適宜于各種核苷酸片段檢測。本發(fā)明整個(gè)反應(yīng)擴(kuò)增時(shí)間僅為40分鐘，而且針對hpv16和hpv18，無論是單一檢測還是多重檢測下限都為5×10⁰拷貝/微升，具有極高的靈敏度。在本發(fā)明中，無論是針對單一還是多重mcda產(chǎn)生的污染子，audg的降解能達(dá)1×10^-15克/微升。因此本發(fā)明中的audg-mcda方法能夠有效的消除污染子。以常見的hpv型別(6，11，31，33，35，39，45，51，52，56，66，73，81，82，83)的基因組核酸為模板評價(jià)audg-mcda-lfb技術(shù)的特異性。audg-mcda-lfb技術(shù)能準(zhǔn)確的hpv16和hpv18，說明audg-mcda-lfb方法的特異性良好。

附圖說明

圖1.mcda-lfb引物設(shè)計(jì)的位置和方向示意圖；

圖2.高分子納米生物傳感器結(jié)構(gòu)及工作示意圖；

圖3.audg-mcda-lfb擴(kuò)增原理示意圖；

圖4.audg-mcda-lfb消除污染子原理示意圖；

圖5.mcda-lfb檢測結(jié)果示意圖譜；

圖6.audg-mcda引物驗(yàn)證結(jié)果圖譜；

圖7.e7基因標(biāo)準(zhǔn)audg-mcda最佳反應(yīng)溫度測試結(jié)果圖譜；

圖8.l1基因標(biāo)準(zhǔn)audg-mcda最佳反應(yīng)溫度測試結(jié)果圖譜；

圖9.audg-mcda檢測hpv16和hpv18的靈敏度結(jié)果圖譜；

圖10.et-mcda檢測hpv16和hpv18的靈敏度結(jié)果圖譜；

圖11.多重audg-mcda-lfb同時(shí)檢測hpv16和hpv18的靈敏度結(jié)果圖譜；

圖12.audg消除單一mcda交叉污染的評價(jià)；

圖13.audg消除多重mcda交叉污染的評價(jià)；

圖14.audg-mcda-lfb技術(shù)的最佳反應(yīng)時(shí)間測試結(jié)果圖譜；

圖15.audg-mcda-lfb技術(shù)的特異性檢測評價(jià)圖譜

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的保護(hù)范圍構(gòu)成任何限制。

本發(fā)明中所涉及的材料方法

1.試劑：

背板、樣品墊、金標(biāo)墊、纖維膜及吸水墊購于jie-yi公司?？篃晒馑乜贵w(anti-fitc)、抗地高辛抗體(anti-dig)、生物素化的牛血清蛋白(b-bsa)購于abcam公司。有色基團(tuán)(紫紅色)修飾的、親和素化的高分子納米粒子(dyestreptavidincoatedpolymernanoparticles,sa-dnps,129nm)購買于bangslaboratories。dna提取試劑盒(qiaampdnaminikits；qiagen,hilden,germany)購于德國qiagen公司。恒溫?cái)U(kuò)增試劑和顯色劑(hydroxynaphthol,hnb)購買自北京海泰正元生物科技有限公司。生物素化的脫氧尿嘧啶(biotin-11-dutp)購買自thermoscientific公司。南極熱敏尿嘧啶脫氧核酸糖基化酶(audg),脫氧胞嘧啶(dctp)，脫氧胸腺嘧啶(dttp)，脫氧腺嘌呤(datp)和脫氧鳥嘌呤(dgtp)購買自newenglandbiolabs公司。dl50dnamarker購于寶生物工程(大連)有限公司。其余試劑均為市售分析純產(chǎn)品。

本發(fā)明實(shí)驗(yàn)中使用的主要儀器：恒溫實(shí)時(shí)濁度儀la-320c(eikenchemicalco.,ltd,japan)購于日本榮研公司。電泳設(shè)備為北京君意東方電泳設(shè)備有限公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)為bio-radgeldoxxr，美國bio-rad產(chǎn)品。

2.引物設(shè)計(jì)

為了驗(yàn)證、評價(jià)audg-mcda-lfb技術(shù)及建立針對hpv16和hpv18病原體的快速、敏感和特異的audg-mcda-lfb檢測體系。本發(fā)明針對hpv16的特異基因e7和hpv的特異基因l1分別設(shè)計(jì)兩套mcda擴(kuò)增引物，旨在驗(yàn)證audg-mcda-lfb技術(shù)的可行性、敏感性、特異性及可靠性。

e7基因存在于hpv16型中，其特異性好，可以將hpv16型與其他密切相近的hpv型別區(qū)分開。l1基因存在于所有的hpv18型中，其特異性好，可以將hpv18型與其他密切相近的hpv型別區(qū)分開。利用引物設(shè)計(jì)軟件primerexplorerv4(eikenchemical)(http://primerexplorer.jp/e/)和引物設(shè)計(jì)軟件primerpremier5.0設(shè)計(jì)mcda引物，并將獲得的特異性引物在ncbi數(shù)據(jù)庫(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)中進(jìn)行序列比對分析，以排除引物與其他物種序列可能存在的非特異性匹配，最終獲得優(yōu)化后的兩套完整mcda擴(kuò)增引物，一套引物針對hpv16型檢測，另一套引物針對hpv18型檢測。引物設(shè)計(jì)的位置和方向見圖1，序列及修飾見表1。

表1引物序列及修飾

^a16，hpv16；18，hpv18；

16-e-cp1，該引物用于多重et-mcda檢測體系，根據(jù)et-mcda檢測體系的結(jié)果，用于調(diào)配多重audg-mcda-lfb檢測體系中的引物濃度。

16-cp1*，該引物用于audg-mcda-lfb檢測體系，在5’端標(biāo)記熒光素(fitc)；

18-e-cp1，該引物用于多重et-mcda檢測體系，根據(jù)et-mcda檢測體系的結(jié)果，用于調(diào)配多重audg-mcda-lfb檢測體系中的引物濃度。

18-cp1*，該引物用于audg-mcda-lfb檢測體系，在5’端標(biāo)記地高辛(dig)。

^bseqid.no.5與seqid.no.3和seqid.no.4(該引物在5'端多了一個(gè)酶切位點(diǎn)序列tgcaatg)的核苷酸序列相同，區(qū)別在于在其5’端標(biāo)記熒光素；seqid.no.17與seqid.no.15和seqid.no.16(該引物在5'端多了一個(gè)酶切位點(diǎn)序列tgcaatg)的核苷酸序列相同，區(qū)別在于在其5’端標(biāo)記地高辛；

^cmer，monomericunit(單體單元)；nt，nucleotide(核苷酸)。

3.生物傳感檢測器(lfb)的設(shè)計(jì)

生物檢測器(lfb)的設(shè)計(jì)見圖2。lfb含有一背板1，在所述背板1上設(shè)置有樣品墊2、金標(biāo)墊3、硝酸纖維膜4及吸水墊5。首先將樣品墊2、金標(biāo)墊3、纖維膜4及吸水墊5依次組裝在背板上。然后將有色基團(tuán)(紫紅色)修飾的，親和素化的高分子納米粒子(sa-dnps)6包被在金標(biāo)墊3上，將抗熒光素抗體7、抗地高辛抗體8及生物素偶聯(lián)的牛血清蛋白(b-bsa)9分別包被在硝酸纖維膜4上，分別作為檢測線41(即tl1)、檢測線42(即tl2)及控制線43(即cl)，待干燥后備用。

lfb的檢測原理(圖2)：將mcda產(chǎn)物滴加到lfb的樣品墊區(qū)域，然后將緩沖液滴加到lfb的樣品墊區(qū)域。mcda產(chǎn)物在虹吸作用下，從下往上運(yùn)動(dòng)(從樣品墊向吸水墊方向運(yùn)動(dòng))。當(dāng)mcda產(chǎn)物達(dá)到金標(biāo)墊后，雙標(biāo)產(chǎn)物的一端(即生物素標(biāo)記端)與親和素化的高分子納米粒子(sa-dnps)6反應(yīng)。當(dāng)產(chǎn)物繼續(xù)運(yùn)動(dòng)，雙標(biāo)產(chǎn)物的另一端(即半抗原標(biāo)記端)與檢測線41或檢測線42區(qū)域的抗體結(jié)合，將雙標(biāo)產(chǎn)物固定在檢測線41(生物素和熒光素同時(shí)標(biāo)記的mcda擴(kuò)增子71的靶標(biāo)一)或檢測線42(生物素和地高辛同時(shí)標(biāo)記的mcda擴(kuò)增子81的靶標(biāo)二)區(qū)域。隨著產(chǎn)物在檢測線41或檢測線42區(qū)域的積累，通過另一端的親和素化的高分子納米粒子(sa-dnps)6進(jìn)行顯色反應(yīng)，從而對mcda產(chǎn)物進(jìn)行可視化檢測。此外，過剩的親和素化的高分子納米粒子(sa-dnps)6可與控制線43區(qū)域的b-bsa反應(yīng)，進(jìn)行直接顯色反應(yīng)，判斷l(xiāng)fb的功能是否正常。

lfb結(jié)果的判讀(圖5)：僅控制線43區(qū)域出現(xiàn)紅色條帶，表示陰性對照，沒有陽性產(chǎn)物(iv)；控制線43及檢測線41區(qū)域出現(xiàn)紅色條帶，表示針對靶標(biāo)一的檢測為陽性結(jié)果(ii)；控制線43及檢測線42區(qū)域出現(xiàn)紅色條帶，表示針對靶標(biāo)二的檢測為陽性結(jié)果(iii)；控制線43、檢測線41和檢測線42區(qū)域出現(xiàn)紅色條帶，表示生物素和熒光素同時(shí)標(biāo)記的mcda擴(kuò)增子71(靶標(biāo)一)和生物素和地高辛同時(shí)標(biāo)記的mcda擴(kuò)增子81(靶標(biāo)二)的檢測都為陽性結(jié)果；當(dāng)lfb不出現(xiàn)紅線條帶時(shí)，表示lfb失效；當(dāng)檢測線41和/或檢測線42出現(xiàn)紅色條帶時(shí)，控制線43無紅色條帶,代表結(jié)果不可信，需要重新檢測。

實(shí)施例1.mcda擴(kuò)增

1.通過mcda擴(kuò)增構(gòu)建可檢測產(chǎn)物

mcda反應(yīng)體系包括10條引物，識別靶序列的10個(gè)區(qū)域，包括2條交叉內(nèi)引物，即cp1和cp2(crossprimer，cp)，2條置換引物(displacementprimer)，即f1和f2，6條擴(kuò)增引物(amplificationprimer)，即d1，c1，r1，d2，c2和r2。為了構(gòu)建可檢測產(chǎn)物，選擇10條引物中任意一條引物，在5’端標(biāo)記半抗原(熒光素或者地高辛)，新標(biāo)記的引物被命名為f1*，f2*，cp1*，cp2*，c1*，c2*，d1*，d2*，r1*和r2*。在本發(fā)明中，以cp1*為例子闡明本發(fā)明的原理。

在既定的恒溫條件下，雙鏈dna在處于半解離和半結(jié)合的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)中，任何一個(gè)引物向雙鏈dna的互補(bǔ)部位進(jìn)行堿基配對延伸時(shí)，另一條鏈就會解離，變成單鏈。首先在bstdna聚合酶的作用下，以cp1*引物p1區(qū)段的3′末端為起點(diǎn)，與對應(yīng)的dna互補(bǔ)序列配對，啟動(dòng)鏈置換dna合成(圖3)。在dna的合成過程中，生物素化的脫氧尿嘧啶(biotin-11-dutp)被bst酶整合到擴(kuò)增子。隨著mcda擴(kuò)增的進(jìn)行，形成大量的雙標(biāo)產(chǎn)物(一端標(biāo)記半抗原，產(chǎn)物中標(biāo)記生物素)，雙標(biāo)產(chǎn)物起源于標(biāo)記的cp1*引物和摻入到擴(kuò)增子中生物素化的脫氧尿嘧啶(biotin-11-dutp)。該雙標(biāo)的產(chǎn)物能被高分子納米生物傳感器檢測，從而進(jìn)行可視檢測。當(dāng)針對不同靶標(biāo)設(shè)計(jì)的cp1*引物進(jìn)行不同半抗原標(biāo)記時(shí)，可實(shí)現(xiàn)多重檢測。詳細(xì)的mcda擴(kuò)增原理見申請人的中國發(fā)明專利cn104946744a。

標(biāo)準(zhǔn)的mcda反應(yīng)體系：交叉引物cp1和cp1*的濃度為30pmol，交叉引物cp2的濃度為60pmol，置換引物f1和f2的濃度為10pmol,擴(kuò)增引物r1，r2，d1和d2的濃度為30pmol，擴(kuò)增引物c1和c2的濃度為20pmol，2m的betain，8mm的mgso4，2.5μl的10×bstdna聚合酶緩沖液，1.4mm的datp，1.0mm的dttp，0.4mm的biotin-11-dutp,1.4mm的dctp，1.0mm的dgtp，10u的鏈置換dna聚合酶，0.5u的南極熱敏尿嘧啶脫氧核酸糖基化酶，1μl的模板，補(bǔ)加去離子水至25μl。整個(gè)反應(yīng)恒溫在63℃1小時(shí)，80℃5min終止反應(yīng)。

2.南極熱敏尿嘧啶脫氧核酸糖基化酶(audg)去除交叉污染

在反應(yīng)體系中(圖4)，由于加入了生物素化的脫氧尿嘧啶(biotin-11-dutp)，隨著mcda擴(kuò)增的進(jìn)行，所有的擴(kuò)增產(chǎn)物都被摻入脫氧尿嘧啶(dutp)。當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物(摻入脫氧尿嘧啶的擴(kuò)增子)進(jìn)入擴(kuò)增體系時(shí)，audg在常溫條件下(如室溫)移除單鏈或雙鏈中脫氧尿嘧啶，從而使單鏈或雙鏈dna出現(xiàn)缺口。由于天然的模板不包含脫氧尿嘧啶，因此audg對天然的dna無催化作用。當(dāng)進(jìn)行mcda擴(kuò)增時(shí)，溫度較高(大于60℃)，帶有缺口的單鏈或雙鏈dna在熱力作用下降解，因此不能作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，從而消除了反應(yīng)體系的污染產(chǎn)物，達(dá)到去除交叉污染的目的。此外，audg在溫度大于50℃時(shí)，會立即失活，從而不能降解新合成的擴(kuò)增產(chǎn)物，即使擴(kuò)增產(chǎn)物中包含脫氧尿嘧啶。因此本發(fā)明中選擇的audg既能用于消除交叉污染，又不影響mcda的正常擴(kuò)增。

3.驗(yàn)證兩套mcda引物的可行性

mcda擴(kuò)增之后，三種檢測方法被用于mcda擴(kuò)增產(chǎn)物判別。首先，在反應(yīng)混合物中加入可視染料(如hnb試劑)，陽性反應(yīng)管的顏色從紫色變?yōu)樘焖{(lán)色，陰性反應(yīng)管則保持原來的紫色。其次，mcda產(chǎn)物可以通過瓊脂糖電泳后檢測擴(kuò)增子，由于產(chǎn)物中包含了不同大小的擴(kuò)增片段，因此陽性擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖呈特異性階梯狀，陰性反應(yīng)不出現(xiàn)任何條帶。更為直接簡單的方法為通過lfb對產(chǎn)物進(jìn)行檢測。

可視顏色變化法：mcda在合成dna的同時(shí)產(chǎn)生大量的焦磷酸根離子，該離子能夠與反應(yīng)體系中的鎂離子結(jié)合，形成不可溶的物質(zhì)，從而改變?nèi)芤旱膒h值，使反應(yīng)混合的顏色發(fā)生改變?？梢酝ㄟ^可視檢測顏色變化判讀結(jié)果，陽性反應(yīng)管從紫色變?yōu)樘焖{(lán)色，陰性反應(yīng)保持紫色不變，見圖6的a和b。a表示針對hpv16的mcda引物的驗(yàn)證，a1表示陽性擴(kuò)增(反應(yīng)管中加入5×10⁴拷貝的pmd18-t-hpv16質(zhì)粒模板，作為陽性對照)，a2表示陰性擴(kuò)增(反應(yīng)管中加入5×10⁴拷貝的pmd18-t-hpv18質(zhì)粒模板，作為陰性對照，測定是否存在交叉反應(yīng))，a3表示陰性擴(kuò)增(反應(yīng)管中加入10pg的hpv6模板，作用陰性對照)，a4表示陰性擴(kuò)增(反應(yīng)管中加入10pg的hpv11模板，作為陰性對照)，a5表示陰性擴(kuò)增(1微升的雙蒸水代替10pg的模板，作為空白對照)。只有陽性對照出現(xiàn)陽性擴(kuò)增，說明針對hpv16e7基因設(shè)計(jì)的檢測hpv16的mcda引物可用。

圖6的b表示針對hpv18的mcda引物的驗(yàn)證，b1表示陽性擴(kuò)增(反應(yīng)管中加入5×10⁴拷貝的pmd18-t-hpv18質(zhì)粒模板，作為陽性對照)，b2表示陰性擴(kuò)增(反應(yīng)管中加入5×10⁴拷貝的pmd18-t-hpv16質(zhì)粒模板，作為陰性對照，測定是否存在交叉反應(yīng))，b3表示陰性擴(kuò)增(反應(yīng)管中加入10pg的hpv6模板，作用陰性對照)，b4表示陰性擴(kuò)增(反應(yīng)管中加入10pg的hpv11模板，作為陰性對照)，b5表示陰性擴(kuò)增(1微升的雙蒸水代替10pg的模板，作為空白對照)。只有陽性對照出現(xiàn)陽性擴(kuò)增，說明針對l1基因設(shè)計(jì)的檢測hpv18的mcda引物可用。

電泳檢測法：將圖6的a和b的產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，由于mcda的擴(kuò)增產(chǎn)物包含了許多大小不一的短片段及一系列反向重復(fù)的靶序列構(gòu)成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和多環(huán)花椰菜樣結(jié)構(gòu)的dna片段混合物，電泳后在凝膠上顯現(xiàn)不同大小區(qū)帶組成的階梯式圖譜，見圖6的c和d。通過電泳檢測法判讀mcda擴(kuò)增結(jié)果，陽性反應(yīng)出現(xiàn)了預(yù)期的結(jié)果，而陰性反應(yīng)和空白對照未出現(xiàn)任何擴(kuò)增條帶，進(jìn)一步驗(yàn)證了本研究所設(shè)計(jì)的mcda引物可行，能夠用于靶序列擴(kuò)增檢測。

lfb檢測：將圖6的a和b的產(chǎn)物進(jìn)行l(wèi)fb檢測，由于針對hpv16檢測的mcda引物標(biāo)記的半抗原為熒光素(fitc)，因此，當(dāng)檢測線tl1和控制線cl出現(xiàn)紅色條帶時(shí)表示為hpv16檢測陽性。由于hpv18檢測的mcda引物標(biāo)記的半抗原為dig，因此，當(dāng)檢測線tl2和cl出現(xiàn)紅色條帶時(shí)表示為hpv18檢測陽性。通過lfb檢測法判讀mcda擴(kuò)增結(jié)果，陽性反應(yīng)出現(xiàn)了預(yù)期的結(jié)果，而陰性反應(yīng)和空白對照僅出現(xiàn)cl紅色條帶，驗(yàn)證了本研究所設(shè)計(jì)的mcda-lfb技術(shù)及mcda引物可行，能夠用于目的靶序列的檢測(圖6的e和f)。

實(shí)施例2.測定mcda技術(shù)的最佳反應(yīng)溫度

在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系條件下，加入針對hpv16及hpv18dna模板及所設(shè)計(jì)的對應(yīng)的mcda引物，其模板濃度為5×10⁴拷貝/微升。反應(yīng)在恒溫條件下進(jìn)行(60-67℃)，結(jié)果運(yùn)用實(shí)時(shí)濁度儀進(jìn)行檢測，在不同的溫度下得到不同的動(dòng)態(tài)曲線圖，見圖7和圖8。61-64℃被推薦作為兩套mcda引物的最佳反應(yīng)溫度。本發(fā)明中的后續(xù)驗(yàn)證選擇63℃作為恒溫條件進(jìn)行mcda擴(kuò)增。圖7表示針對e7基因設(shè)計(jì)的檢測hpv16的mcda引物溫度動(dòng)態(tài)曲線圖；圖8表示針對l1基因設(shè)計(jì)的檢測hpv18的mcda引物溫度動(dòng)態(tài)曲線圖。

實(shí)施例3.audg-mcda-lfb檢測單一靶標(biāo)的靈敏度

運(yùn)用連續(xù)稀釋好的質(zhì)粒(pmd18-t-hpv16：5×10⁵，5×10⁴，5×10³，5×10²，5×10¹，5×10⁰和5×10^-1拷貝/微升)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的mcda擴(kuò)增反應(yīng)后，運(yùn)用lfb檢測顯示結(jié)果。針對hpv16檢測，mcda-lfb的檢測范圍為5×10⁵～5×10⁰拷貝/微升，lfb在tl1和cl區(qū)域出現(xiàn)紅色線(圖9a中的1-6)。當(dāng)反應(yīng)體系中基因組模板量降低至5×10⁰拷貝以下時(shí)，lfb僅在cl區(qū)域出現(xiàn)紅色線，表示陰性結(jié)果(圖9a中的7-8)。圖9的a為運(yùn)用lfb可視化讀取mcda擴(kuò)增結(jié)果：圖9a中1到6表示pmd18-t-hpv16的模板量為5×10⁵，5×10⁴，5×10³，5×10²，5×10¹，5×10⁰拷貝/微升，圖9a中的7-8分別表示pmd18-t-hpv16的模板量為5×10^-1拷貝/微升和空白對照(1微升雙蒸水)。

運(yùn)用連續(xù)稀釋好的質(zhì)粒(pmd18-t-hpv18：5×10⁵，5×10⁴，5×10³，5×10²，5×10¹，5×10⁰和5×10^-1拷貝/微升)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的mcda擴(kuò)增反應(yīng)后，運(yùn)用lfb檢測顯示結(jié)果。針對hpv18檢測，mcda-lfb的檢測范圍為5×10⁵～5×10⁰拷貝/微升，lfb在tl2和cl區(qū)域出現(xiàn)紅色線(圖9d中的1-6)。當(dāng)反應(yīng)體系中基因組模板量降低至5×10⁰拷貝以下時(shí)，lfb僅在cl區(qū)域出現(xiàn)紅色線，表示陰性結(jié)果(圖9d中的7-8)。圖9的d為運(yùn)用lfb可視化讀取mcda擴(kuò)增結(jié)果；圖9d中的1-6表示pmd18-t-hpv18的模板量為5×10⁵，5×10⁴，5×10³，5×10²，5×10¹，5×10⁰拷貝/微升，圖9d中的7-8分別表示pmd18-t-hpv16的模板量為5×10^-1拷貝/微升和空白對照(1微升雙蒸水)。

其他檢測方法確認(rèn)檢測結(jié)果：將圖9的a和d的產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，由于mcda的擴(kuò)增產(chǎn)物包含了許多大小不一的短片段及一系列反向重復(fù)的靶序列構(gòu)成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和多環(huán)花椰菜樣結(jié)構(gòu)的dna片段混合物，電泳后在凝膠上顯現(xiàn)不同大小區(qū)帶組成的階梯式圖譜，見圖9的c和f。通過電泳檢測法判讀mcda擴(kuò)增結(jié)果，陽性反應(yīng)出現(xiàn)了預(yù)期的結(jié)果，而陰性反應(yīng)和空白對照未出現(xiàn)任何擴(kuò)增條帶，進(jìn)一步驗(yàn)證了mcda-lfb的檢測靈敏度。此外，lfb和電泳確認(rèn)的檢測結(jié)果與實(shí)時(shí)濁度的檢測結(jié)果一致(見圖9的b和e)。

實(shí)施例4.et-mcda-lfb同時(shí)檢測多個(gè)靶標(biāo)的靈敏度

為了實(shí)現(xiàn)audg-mcda-lfb技術(shù)同時(shí)檢測多個(gè)靶標(biāo)，內(nèi)切酶介導(dǎo)的實(shí)時(shí)多重mcda技術(shù)(et-mcda)被用于調(diào)節(jié)多重mcda的反應(yīng)體系(et-mcda技術(shù)詳見申請人的專利cn201610219350.6)。在上述描述的多重et-mcda擴(kuò)增條件下，hpv16和hpv18在同一反應(yīng)中能夠被同時(shí)檢測(圖10)。

多重et-mcda反應(yīng)體系：置換引物16-f1和16-f2的濃度為10pmol,擴(kuò)增引物16-c1和16-c2的濃度為10pmol，擴(kuò)增引物16-r1，16-r2，16-d1和16-d2的濃度為20pmol，交叉引物16-cp1和16-e-cp1的濃度為20pmol,16-cp2的濃度為40pmol，置換引物18-f1和18-f2的濃度為10pmol,擴(kuò)增引物18-c1和18-c2的濃度為10pmol，擴(kuò)增引物18-r1，18-r2，18-d1和18-d2的濃度為10pmol，交叉引物18-cp1和18-e-cp1的濃度為10pmol,18-cp2的濃度為20pmol，2m的betain，8mm的mgso4，2.5μl的10×bstdna聚合酶緩沖液，1.4mm的datp，1.0mm的dttp,0.4mm的biotin-11-dutp，1.4mm的dctp，1.0mm的dgtp，10u的鏈置換dna聚合酶，1u的南極熱敏尿嘧啶脫氧核酸糖基化酶，15unb.bsrdi的內(nèi)切酶，hpv16及hpv18各1μl的模板，補(bǔ)加去離子水至25μl。整個(gè)反應(yīng)恒溫在63℃1小時(shí)。

圖10的a和b實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線被同時(shí)產(chǎn)生，來自不同的熒光通道。此外多重et-mcda針對hpv16和hpv18的檢測下限也為5×10⁰拷貝/微升。圖10的a1/b1到a6/b6表示pmd18-t-hpv16/pmd18-t-hpv18的模板量為5×10⁵，5×10⁴，5×10³，5×10²，5×10¹，5×10⁰拷貝/微升，a7/b7和a8/7b8,分別表示pmd18-t-hpv16/pmd18-t-hpv18的模板量為5×10^-1拷貝/微升和空白對照(1微升雙蒸水)。

實(shí)施例5.多重mcda-lfb同時(shí)檢測多個(gè)靶標(biāo)的靈敏度

為了實(shí)現(xiàn)mcda-lfb能夠同時(shí)檢測多個(gè)靶標(biāo)，首先要保證audg-mcda-lfb技術(shù)在擴(kuò)增步驟能實(shí)現(xiàn)在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目的序列。多重mcda擴(kuò)增體系根據(jù)多重et-mcda體系相似，僅僅用相同量的16-cp1*和18-cp1*代替16-e-cp1和18-e-cp1，這樣保證多重mcda體系能夠同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目的序列在同一反應(yīng)體系中。

多重mcda反應(yīng)體系：置換引物16-f1和16-f2的濃度為10pmol,擴(kuò)增引物16-c1和16-c2的濃度為10pmol，擴(kuò)增引物16-r1，16-r2，16-d1和16-d2的濃度為20pmol，交叉引物16-cp1和16-cp1*的濃度為20pmol,16-cp2的濃度為40pmol，置換引物18-f1和18-f2的濃度為10pmol,擴(kuò)增引物18-c1和18-c2的濃度為10pmol，擴(kuò)增引物18-r1，18-r2，18-d1和18-d2的濃度為10pmol，交叉引物18-cp1和18-cp1*的濃度為10pmol,18-cp2的濃度為20pmol，2m的betain，8mm的mgso4，2.5μl的10×bstdna聚合酶緩沖液，1.4mm的datp，1.0mm的dttp，0.4mm的biotin-11-dutp，1.4mm的dctp，1.0mm的dgtp，10u的鏈置換dna聚合酶，0.5u的南極熱敏尿嘧啶脫氧核酸糖基化酶，hpv16及hpv18各1μl的模板，補(bǔ)加去離子水至25μl。整個(gè)反應(yīng)恒溫在63℃1小時(shí)，80℃5min終止反應(yīng)。

運(yùn)用連續(xù)稀釋好的pmd18-t-hpv16和pmd18-t-hpv18dna模板進(jìn)行多重mcda擴(kuò)增反應(yīng)后，運(yùn)用lfb檢測顯示(圖11)：audg-mcda-lfb技術(shù)在檢測多個(gè)靶標(biāo)時(shí)，檢測下限仍然為5×10⁰拷貝/微升，lfb在tl1，tl2和cl區(qū)域出現(xiàn)紅色線(lfb1-lfb6)。當(dāng)反應(yīng)體系中基因組模板量降低至5×10⁰拷貝/微升以下時(shí)，lfb僅在cl區(qū)域出現(xiàn)紅色線，表示陰性結(jié)果(lfb7-lfb8)。圖10為運(yùn)用lfb可視化讀取多重mcda擴(kuò)增結(jié)果：lfb1到lfb6表示pmd18-t-hpv16和pmd18-t-hpv18dna模板量為5×10⁵，5×10⁴，5×10³，5×10²，5×10¹，5×10⁰拷貝，lfb7表示pmd18-t-hpv16和pmd18-t-hpv18dna模板量為5×10^-1拷貝，lfb8表示空白對照(2微升雙蒸水)。

實(shí)施例6.audg消除mcda交叉污染評價(jià)

為了證實(shí)audg能夠作為有效的工具消除dutp摻入的擴(kuò)增產(chǎn)物，hpv16-mcda，hpv18-mcda及multiplexmcda反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物分別被連續(xù)稀釋(1×10^-14，1×10^-15，1×10^-16，1×10^-17，1×10^-18，1×10^-19和1×10^-20克/微升)。這三個(gè)稀釋度的擴(kuò)增產(chǎn)物分別被用作模板，用于hpv16-mcda,hpv18-mcda和multiplexmcda反應(yīng)。在反應(yīng)體系中無audg存在的情況下，hpv16-mcda能夠檢測污染子的能力為1×10^-19克/微升(圖12的a)；在反應(yīng)體系中audg存在的情況下，hpv16-mcda能夠檢測污染子的能力為1×10^-15克/微升(圖12的c)。在反應(yīng)體系中無audg存在的情況下，hpv18-mcda能夠檢測污染子的能力為1×10^-19克/微升(圖12的b)；在反應(yīng)體系中audg存在的情況下，hpv18-mcda能夠檢測污染子的能力為1×10^-15克/微升(圖12的d)。在反應(yīng)體系中無audg存在的情況下，多重mcda能夠檢測污染子的能力為1×10^-18克/微升(圖13的a)；在反應(yīng)體系中audg存在的情況下，多重mcda能夠檢測污染子的能力為1×10^-15克/微升(圖13的b)。在常規(guī)情況下，擴(kuò)增產(chǎn)物導(dǎo)致的，能夠產(chǎn)生交叉反應(yīng)的污染子濃度通常為1×10^-18克/微升。本發(fā)明中，無論是針對單一還是多重mcda產(chǎn)生的污染子，audg的降解能達(dá)1×10^-15克/微升。因此本發(fā)明中的audg-mcda方法能夠有效的消除污染子。

實(shí)施例7.測定audg-mcda-lfb技術(shù)的最佳反應(yīng)時(shí)間

在多重反應(yīng)體系條件下，同時(shí)加入針對hpv16及hpv18的質(zhì)粒dna模板(即連續(xù)稀釋好的hpv16及hpv18的質(zhì)粒dna模板)及所設(shè)計(jì)的對應(yīng)的兩套mcda引物。反應(yīng)在恒溫條件下進(jìn)行(63℃)，恒溫時(shí)間分別20分鐘、30分鐘、40分鐘和50分鐘。運(yùn)用lfb檢測顯示：mcda-lfb技術(shù)在檢測多個(gè)靶標(biāo)時(shí)，最佳反應(yīng)時(shí)間為40分鐘(圖14)。當(dāng)多重mcda體系在擴(kuò)增步驟恒溫40分鐘時(shí)，檢測限水平的模板能夠被檢出(圖14的c)。圖14的c中，lfb檢測范圍為5×10⁵拷貝～5×10⁰拷貝，lfb在tl1，tl2和cl區(qū)域出現(xiàn)紅色線(lfb1-lfb6)。當(dāng)反應(yīng)體系中基因組模板量降低至5×10⁰拷貝以下時(shí)，lfb僅在cl區(qū)域出現(xiàn)紅色線，表示陰性結(jié)果(lfb7-lfb8)。圖14為運(yùn)用lfb可視化讀取多重mcda體系從20分鐘到50分鐘的擴(kuò)增結(jié)果：lfb1到lfb7表示hpv16和hpv18的模板量為5×10⁵，5×10⁴，5×10³，5×10²，5×10¹，5×10⁰和5×10^-1拷貝；lfb8表示空白對照(2微升雙蒸水)。

實(shí)施例8.測定audg-mcda-lfb技術(shù)的特異性

以常見的hpv型別(6，11，31，33，35，39，45，51，52，56，66，73，81，82，83)的基因組核酸為模板評價(jià)audg-mcda-lfb技術(shù)的特異性。audg-mcda-lfb技術(shù)能準(zhǔn)確檢測到hpv16和hpv18，說明audg-mcda-lfb方法的特異性良好，見圖15。lfb1：陽性對照(pmd18-t-hpv16/pmd18-t-hpv18的模板量為5×10⁴拷貝/微升)；lfb2-9：hpv16模板；lfb10-17：hpv18模板；lfb18-30：hpv31，hpv33，hpv35，hpv39，hpv45，hpv51，hpv52，hpv56，hpv66，hpv73，hpv81，hpv82，hpv83。結(jié)果表明，audg-mcda-lfb能夠正確的檢測靶序列，通過tl1和tl2可視線可將不同靶序列鑒別開。

序列表

<110>中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所

<120>audg介導(dǎo)的多交叉置換擴(kuò)增結(jié)合生物傳感的核酸檢測技術(shù)

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