一種表達盒及其在培育種子油脂含量增高的轉基因植物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種表達盒及其在培育種子油脂含量增高的轉基因植物中的應用。本發(fā)明提供的表達盒，包括植物胚特異性啟動子和油體蛋白的編碼基因。所述油體蛋白可為植物油體蛋白。所述植物油體蛋白可為大豆油體蛋白，具體可為GM-A蛋白或GM-B蛋白。所述植物胚特異性啟動子可為REG-2啟動子。本發(fā)明的方法及其應用為利用生物技術提高種子油脂含量、改良種子品質以及生物能源等研究奠定基礎，具有極大的應用前景。
【專利說明】一種表達盒及其在培育種子油脂含量增高的轉基因植物中 的應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種表達盒及其在培育種子油脂含量增高的轉基因植物中的應用。

【背景技術】
[0002] 植物油脂由碳水化合物轉化而來，其主要成分為長鏈脂肪酸與甘油結合形成的甘 油三酯（triacylglycerol, TAG)。植物油脂作為食用油和一種重要的可再生能源物質，不僅 可為人體提供一些必需的不飽和脂肪酸，也是用于轉化生物柴油的主要成分及一些工業(yè)產 品的重要原料，長期以來備受關注。
[0003] 水稻是世界上最重要的糧食作物之一，為世界上超過半數(shù)的人口提供食物。其中， 米胚(稻米胚)是稻米的重要組成部分，全國每年米胚的產量估計可達400?440萬噸以上。 米胚富含多種營養(yǎng)元素，蛋白質和脂類均在20%以上，亞油酸和維生素 E含量豐富，且植物 固醇和谷維素共存。大量實驗表明，經常食用米胚油對心臟疾病、血栓性靜脈炎、生殖機能 障礙、肌肉萎縮等疾病均有明顯療效。另外，米胚油還是生物柴油的理想原料來源。因此， 積極開發(fā)、利用米胚，對于充分利用稻米資源、改善人體膳食結構以及緩解能源危機都有著 重要的現(xiàn)實意義。


【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種表達盒及其在培育種子油脂含量增高的轉基因植物中 的應用。
[0005] 本發(fā)明提供的表達盒，包括植物胚特異性啟動子和油體蛋白的編碼基因。
[0006] 所述油體蛋白可為植物油體蛋白。所述植物油體蛋白可為大豆油體蛋白，具體可 為GM-A蛋白或GM-B蛋白。
[0007] 所述GM-A蛋白具體為如下（a)或（b):
[0008] (a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；
[0009] (b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且與植物種子含油量相關的由序列1衍生的蛋白質。
[0010] 所述GM-B蛋白具體為如下（C)或（d):
[0011] (C)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質；
[0012] (d)將序列表中序列3所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且與植物種子含油量相關的由序列1衍生的蛋白質。
[0013] 所述油體蛋白的編碼基因具體可為GM-A基因或GM-B基因。
[0014] 所述GM-A基因具體為如下（1)或（2)或（3)所述的DNA分子：
[0015] (1)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0016] (2)在嚴格條件下與（1)限定的DNA序列雜交且編碼與植物種子含油量相關的蛋 白的DNA分子；
[0017] (3)與（1)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼與植物種子含油量相 關的蛋白的DNA分子。
[0018] 上述嚴格條件可為在6XSSC，0. 5%SDS的溶液中，在65° C下雜交，然后用 2XSSC、0. 1%SDS 和 1XSSC、0. 1%SDS 各洗膜一次。
[0019] 所述GM-B基因具體為如下（4)或（5)或（6)所述的DNA分子：
[0020] (4)序列表中序列4所示的DNA分子；
[0021] (5)在嚴格條件下與（4)限定的DNA序列雜交且編碼與植物種子含油量相關的蛋 白的DNA分子；
[0022] (6)與（4)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼與植物種子含油量相 關的蛋白的DNA分子。
[0023] 上述嚴格條件可為在6XSSC，0. 5%SDS的溶液中，在65° C下雜交，然后用 2XSSC、0. 1%SDS 和 1XSSC、0. 1%SDS 各洗膜一次。
[0024] 所述植物胚特異性啟動子為REG-2啟動子，具體可為如下（7)或（8)或（9)所述的 DNA分子：
[0025] (7)序列表中序列5所示的DNA分子；
[0026] (8)在嚴格條件下與（7)限定的DNA序列雜交且具有啟動子功能的DNA分子；
[0027] (9)與（7)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且具有啟動子功能的DNA分 子。
[0028] 上述嚴格條件可為在6XSSC，0. 5%SDS的溶液中，在65° C下雜交，然后用 2XSSC、0. 1%SDS 和 1XSSC、0. 1%SDS 各洗膜一次。
[0029] 含有以上任一所述表達盒的重組載體、轉基因細胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保 護范圍。
[0030] 所述重組載體具體可為將所述植物胚特異性啟動子和所述植物油體蛋白的編碼 基因插入載體PGPTV-35S-HPT的不同多克隆位點得到的重組質粒。
[0031] 本發(fā)明還保護以上任一所述的表達盒，或以上任一所述重組載體在培育種子油脂 含量增高的轉基因植物中的應用。所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。所述單子葉植物 具體可為水稻，如野生型水稻Kitaake。
[0032] 本發(fā)明還保護一種培育轉基因植物的方法，包括如下步驟：將以上任一所述的表 達盒導入出發(fā)植物，得到種子油脂含量高于所述出發(fā)植物的轉基因植物。所述表達盒可通 過所述重組載體導入所述出發(fā)植物。所述重組載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒 載體、直接DNA轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導或基因槍等常規(guī)生物學方法轉化植物細 胞或組織或器官，得到轉基因植物細胞或組織或器官及由此分化、再生的完整植株及其無 性系或其后代。所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。所述單子葉植物具體可為水稻，如 野生型水稻Ki taake。
[0033] 本發(fā)明創(chuàng)造性地利用胚特異性啟動子驅動油體蛋白基因在轉基因植物種子胚中 特異性地表達，可以提高轉基因植物種子油脂的含量，并可獲得種子油脂含量高且穩(wěn)定遺 傳的轉基因植株。本發(fā)明的方法及其應用為利用生物技術提高種子油脂含量、改良種子品 質以及生物能源等研究奠定基礎，具有極大的應用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0034] 圖1為從大豆cDNA中PCR擴增GM-A基因和GM-B基因的電泳圖譜。
[0035] 圖2為重組質粒的結構示意圖。
[0036] 圖3為?；代轉基因植株的PCR鑒定電泳圖。
[0037] 圖4為TQ代轉基因植株的Southern雜交結果。
[0038] 圖5為?\代轉基因植株的RT-PCR鑒定電泳圖。
[0039] 圖6為?\代轉基因植株的的Western雜交結果。
[0040] 圖7為?\代轉基因植株的in situ Western雜交結果。
[0041] 圖8為T2代轉基因植株的PCR分析的電泳圖譜。
[0042] 圖9為T2代水稻種子和T3代水稻種子的油脂含量測定結果。

【具體實施方式】
[0043] 以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平 均值。
[0044] 載體REG-2-pGPTV-35S-HPT :將序列表的序列5所示的REG-2啟動子插入載 體 PGPTV-35S-HPT (提及載體 pGPTV-35S-HPT 的參考文獻：Qu and Takaiwa，2004.Plant Biotechnol J. 2(2) : 113-125)的Sal I和Sma I酶切位點之間得到的重組質粒。
[0045] 農桿菌 EHA105，參考文獻：Qu and Takaiwa, 2004. Plant Biotechnol J. 2(2) : 113-125。
[0046] 野生型水稻 Kitaake (用 WT表不），參考文獻：Qu and Takaiwa. Plant Biotechnol J. 2(2) : 113-125。
[0047] 大豆品種"沈農25104" ：遼寧東亞種子有限公司。
[0048] 實施例1、重組質粒的構建
[0049] 1、提取大豆品種"沈農25104"的總RNA并反轉錄為cDNA。
[0050] 2、以步驟1提取的cDNA為模板，用F1和R1組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR 擴增產物（PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖1A)。
[0051] F1 :5, -AACCCGGG ATGACCACACAAGTACCACCAC-3，；
[0052] R1 :5' -AGAGCTCGAA TCATGCGGTTGCGGTTGTTGC-3'。
[0053] 3、用限制性內切酶Sma I和Sac I雙酶切步驟3的PCR擴增產物，回收酶切產物。
[0054] 4、用限制性內切酶Sma I和Sac I雙酶切載體REG-2-pGPTV-35S-HPT，回收約13kb 的載體骨架。
[0055] 5、將步驟3的酶切產物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質粒 pGPTV-REG-2-GM-A。根據(jù)測序結果，對重組質粒pGPTV-REG-2-GM-A進行結構描述如下：在 載體REG-2-pGPTV-35S-HPT的Sma I和Sac I酶切位點之間插入了序列表的序列2所示的 GM-A基因，由REG-2啟動子驅動GM-A基因表達序列表的序列1所示的GM-A蛋白。重組質 粒pGPTV-REG-2-GM-A的結構示意圖見圖2。
[0056] 6、以步驟1提取的cDNA為模板，用F2和R1組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR 擴增產物（PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖IB )。
[0057] F2 :5, -AAGCCCGGG ACTATGACCACAGTGCCACCACA-3，；
[0058] R1 :5' -AGAGCTCGAA TCATGCGGTTGCGGTTGTTGC-3'。
[0059] 7、用限制性內切酶Sma I和Sac I雙酶切步驟6的PCR擴增產物，回收酶切產物。
[0060] 8、用限制性內切酶Sma I和Sac I雙酶切載體REG-2-pGPTV-35S-HPT，回收約13kb 的載體骨架。
[0061] 9、將步驟7的酶切產物和步驟8的載體骨架連接，得到重組質粒 pGPTV-REG-2-GM-B。根據(jù)測序結果，對重組質粒pGPTV-REG-2-GM-B進行結構描述如下：在 載體REG-2-pGPTV-35S-HPT的Sma I和Sac I酶切位點之間插入了序列表的序列4所示的 GM-B基因，由REG-2啟動子驅動GM-B基因表達序列表的序列3所示的GM-B蛋白。重組質 粒pGPTV-REG-2-GM-B的結構示意圖見圖2。
[0062] 實施例2、轉基因水稻的獲得
[0063] 一、轉基因水稻甲的獲得
[0064] 1、將重組質粒pGPTV-REG-2-GM-A導入農桿菌EHA105,得到重組農桿菌。
[0065] 2、將步驟1得到的重組農桿菌轉化野生型水稻Kitaake的胚性愈傷組織，利用潮 霉素篩選獲得陽性植株(具體步驟參見文獻：Hiei et al. 1994. Plant J. 6:271-282)。
[0066] 3、TQ代植株的鑒定
[0067] 分別將步驟2獲得的各個陽性植株提取基因組DNA，用F3和R1組成的引物對進 行PCR鑒定，靶序列約為l.Okb。9株植株為PCR鑒定陽性，即獲得了 9株?；代轉基因植 株。9株?；代轉基因植株的PCR鑒定電泳圖見圖3A (M為分子量標準，第1泳道為重組質 粒pGPTV-REG-2-GM-A，第2泳道為野生型水稻Kitaake，第3-11泳道為9株T Q代轉基因植 株)。
[0068] F3 :5, -TTGCAACAACCCAGGAAAACACGGC-3，。
[0069] 分別提取各個?；代轉基因植株的基因組DNA，用限制性內切酶EcoR I充分酶切后 進行瓊脂糖凝膠電泳，然后進行Southern雜交(用于雜交的探針為序列表的序列6自5'末 端第417-972位核苷酸所示的HPT基因片段)。部分結果見圖4。0GA3和0GA4代表不同的 L代轉基因植株，可以觀察到，兩個植株中均能檢測出雜交條帶，并且雜交條帶的數(shù)目和出 現(xiàn)的位置不完全相同，這表明GM-A基因已經成功整合到水稻基因組中，并且各個轉基因植 株是相互獨立的轉化個體。
[0070] 4、?\代植株的獲得和鑒定
[0071] 將?；代轉基因植株（0GA3或0GA4)自交收獲?\代種子，培育?\代種子得到?\代 植株。
[0072] 提取?\代種子的總RNA并反轉錄為cDNA，PCR鑒定GM-A基因的表達量(采用F1 和R1組成的引物對)，采用水稻OsActin-Ι基因為內參(采用的F4和R2組成的引物對；F4 : 5' -TCCATCTTGGCATCTCTCAG-3' ；R2 :5' -GTACCCGCATCAGGCATCTG-3'），PCR 鑒定電泳圖見圖 5。在轉基因植株的?\代種子中，GM-A基因得到表達，而在野生型水稻Kitaake中未檢測到 該基因的表達，這表明在轉基因植株種子胚中，REG-2啟動子可以有效、特異地驅動GM-A基 因的轉錄起始。
[0073] 提取?\代種子的總蛋白并進行Western雜交，見圖6A。結果表明，GM-A基因得到 表達，而在野生型水稻Kitaake中未檢測到該基因的表達。
[0074] 取!\代種子，進行in situ Western雜交檢測(用刀片縱切為兩半，依次進行封閉、 漂洗、一抗、漂洗、二抗、漂洗、BCIP/NBT顯色反應、體視鏡系統(tǒng)掃描照像)。照片見圖7A。in situ Western雜交結果顯示，GM-A基因在轉基因植株中特異地在種子的胚和糊粉層部位表 達，而在野生型水稻Kitaake種子中未檢測到GM-A基因的表達。
[0075] 5、T2代植株的獲得和鑒定
[0076] 將?\代轉基因植株自交收獲Τ2代種子，培育Τ2代種子得到Τ 2代植株。
[0077] 提取Τ2代植株的總RNA并反轉錄為cDNA，用F1和R1組成的引物對進行PCR鑒定。 對于某一 ?\代植株，如果其抽樣檢測的T2代植株均PCR鑒定為陽性，則該植株為純合的轉 基因植株，該植株及其后代即為1個純合的轉基因株系（0GA3和0GA4代表不同的轉基因株 系)。部分結果見圖8Α (Μ為分子量標準，第1?6泳道為Τ2代植株)。
[0078] 6、將Τ2代轉基因植株自交收獲Τ3代種子，培育Τ 3代種子得到Τ3代植株。
[0079] 二、轉基因水稻乙的獲得
[0080] 1、將重組質粒pGPTV-REG-2-GM-B導入農桿菌ΕΗΑ105,得到重組農桿菌。
[0081] 2、將步驟1得到的重組農桿菌轉化野生型水稻Kitaake的胚性愈傷組織，利用潮 霉素篩選獲得陽性植株(具體步驟參見文獻：Hiei et al. 1994. Plant J. 6:271-282)。
[0082] 3、TQ代植株的鑒定
[0083] 分別將步驟2獲得的各個陽性植株提取總RNA并反轉錄為cDNA，用F3和R1組成 的引物對進行PCR鑒定，靶序列約為1. Okb。8株植株為PCR鑒定陽性，即獲得了 8株?；代 轉基因植株。8株?；代轉基因植株的PCR鑒定電泳圖見圖3B(M為分子量標準，第1泳道為 重組質粒pGPTV-REG-2-GM-B，第2泳道為出發(fā)植株，第3-10泳道為8株?；代轉基因植株)。
[0084] 分別提取各個?；代轉基因植株的基因組DNA，用限制性內切酶EcoR I充分酶切后 進行瓊脂糖凝膠電泳，然后進行Southern雜交(用于雜交的探針為序列表的序列6自5'末 端第417-972位核苷酸所示的HPT基因片段)。部分結果見圖4。0GB6和0GB7代表不同的 L代轉基因植株，可以觀察到，兩個植株中均能檢測出雜交條帶，并且雜交條帶出現(xiàn)的位置 不完全相同，這表明GM-B基因已經成功整合到水稻基因組中，并且各個轉基因植株是相互 獨立的轉化個體。
[0085] 4、?\代植株的獲得和鑒定
[0086] 將?；代轉基因植株（0GB6或0GB7)自交收獲?\代種子，培育?\代種子得到?\代 植株。
[0087] 提取?\代種子的總RNA并反轉錄為cDNA，PCR鑒定GM-B基因的表達量(采用F2 和R1組成的引物對)，采用水稻OsActin-Ι基因為內參(采用的F4和R2組成的引物對)， PCR鑒定電泳圖見圖5。在轉基因植株的?\代種子中，GM-B基因得到表達，而在野生型水 稻Kitaake中未檢測到該基因的表達，這表明在轉基因植株種子胚中，REG-2啟動子可以有 效、特異地驅動GM-B基因的轉錄起始。
[0088] 提取1\代種子的總蛋白并進行Western雜交，見圖6B。結果表明，GM-B基因得到 表達，而在野生型水稻Kitaake中未檢測到該基因的表達。
[0089] 取!\代種子，進行in situ Western雜交檢測(用刀片縱切為兩半，依次進行封閉、 漂洗、一抗、漂洗、二抗、漂洗、BCIP/NBT顯色反應、體視鏡系統(tǒng)掃描照像)。照片見圖7B。in situ Western雜交結果顯示，GM-B基因在轉基因植株中特異地在種子的胚和糊粉層部位表 達，而在野生型水稻Kitaake種子中未檢測到GM-B基因的表達。
[0090] 5、T2代植株的獲得和鑒定
[0091] 將?\代轉基因植株自交收獲Τ2代種子，將Τ2代種子培育得到Τ2代植株。提取Τ 2 代植株的總RNA并反轉錄為cDNA，用F2和R1組成的引物對進行PCR鑒定。對于某一 ?\代 植株，如果其抽樣檢測的Τ2代植株均PCR鑒定為陽性，則該植株為純合的轉基因植株，該植 株及其后代即為1個純合的轉基因株系（0GB6和0GB7代表不同的轉基因株系)。部分結果 見圖8Β (Μ為分子量標準，第1?5泳道為Τ2代植株)。
[0092] 6、將Τ2代轉基因植株自交收獲Τ3代種子，將Τ3代種子培育得到Τ 3代植株。
[0093] 三、轉空載體對照植株的獲得
[0094] 用載體REG-2-pGPTV-35S-HPT代替重組質粒pGPTV-REG-2-GM-A，按照步驟一的方 法進行，得到轉空載體對照植株。
[0095] 實施例3、轉基因植株的鑒定
[0096] 一、Τ2代轉基因水稻種子油脂含量分析
[0097] 將轉基因植株甲（0GA3或0GA4 )的Τ2代種子、轉基因植株乙（0GB6或0GB7 )的Τ2代 種子、轉空載體對照植株的Τ2代種子和野生型水稻Kitaake的種子分別進行如下操作：（1) 將種子用研缽研磨成細粉，稱取約3g粉末(稱重，W1)加入事先裝有5mL異丙醇的帶塞玻璃 試管中，充氮氣后密封；（2)將試管放在70°C水浴30分鐘，氮氣吹干后加入5. 8mL甲醇-氯 仿-水的混合液（甲醇：氯仿：水=2 :2 :1. 8 ;體積比)，充分振蕩5分鐘，室溫下10, OOOrpm離 心10分鐘，將下相溶液小心移至新的玻璃試管中；（3)在上相溶液中加入2. OmL甲醇-氯 仿-水的混合液（甲醇：氯仿：水=1 :2 :0.8 ;體積比)，充分振蕩5分鐘，室溫下10,000rpm離 心10分鐘，將下相溶液小心移至新的玻璃試管中；（4)在上相溶液中加入2. OmL甲醇-氯 仿-水的混合液（甲醇：氯仿：水=1 :2 :0. 8 ;體積比)，充分振蕩5分鐘，室溫下10, OOOrpm 離心10分鐘，將下相溶液小心移至新的玻璃試管中；（5)將步驟（2)得到的下相溶液、步驟 (3)得到的下相溶液和步驟（4)得到的下相溶液混合于試管中（預先對試管稱重，為W2)，氮 氣吹干，干燥24小時后稱重(試管和試管內殘余物的總重為W3)。
[0098] 油脂含量（％) = (W3-W2) /W1 X 100%。
[0099] 0GA3的T2代種子中的油脂含量為2. 91%。
[0100] 0GA4的Τ2代種子中的油脂含量為3. 24%。
[0101] 0GB6的Τ2代種子中的油脂含量為2. 82%。
[0102] 0GB7的Τ2代種子中的油脂含量為3. 44%。
[0103] 野生型水稻Kitaake的種子中的油脂含量為2. 54%。
[0104] 轉空載體對照植株的T2代種子中的油脂含量為2. 55%。
[0105] 各個株系的油脂含量比較見圖9Α。較之野生型水稻Kitaake種子中的油脂含量， 0GA3、0GA4、0GB6和0GB7的T 2代種子中的油脂含量分別增加了 14. 57%、27. 56%、11. 02%和 35. 43%。
[0106] 二、Τ3代轉基因水稻種子油脂含量分析
[0107] 將轉基因植株甲（0GA3或0GA4)的Τ3代種子、轉基因植株乙（0GB6或0GB7)的Τ 3 代種子、轉空載體對照植株的Τ3代種子和野生型水稻Kitaake的種子分別進行步驟一的操 作。
[0108] 0GA3的T3代種子中的油脂含量為3. 13%。
[0109] 0GA4的Τ3代種子中的油脂含量為3. 30%。
[0110] 0GB6的Τ3代種子中的油脂含量為2. 88%。
[0111] 0GB7的Τ3代種子中的油脂含量為3. 52%。
[0112] 野生型水稻Kitaake的種子中的油脂含量為2. 41%。
[0113] 轉空載體對照植株的T2代種子中的油脂含量為2. 43%。
[0114] 各個株系的油脂含量比較見圖9Β。較之野生型水稻Kitaake種子中的油脂含量， 0GA3、0GA4、0GB6和0GB7的T 3代種子中的油脂含量分別增加了 29. 88%、36. 93%、19. 50%和 46.06%。
【權利要求】
1. 一種表達盒，包括植物胚特異性啟動子和油體蛋白的編碼基因。
2. 如權利要求1所述的表達盒，其特征在于：所述油體蛋白為植物油體蛋白。
3. 如權利要求2所述的表達盒，其特征在于：所述植物油體蛋白為GM-A蛋白或GM-B蛋 白； 所述GM-A蛋白為如下（a)或（b): (a) 由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質； (b) 將序列表中序列1所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加且與植物種子含油量相關的由序列1衍生的蛋白質； 所述GM-B蛋白為如下（c)或（d): (c) 由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質； (d) 將序列表中序列3所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加且與植物種子含油量相關的由序列1衍生的蛋白質。
4. 如權利要求3所述的表達盒，其特征在于：所述油體蛋白的編碼基因為GM-A基因或 GM-B基因； 所述GM-A基因為如下（1)或（2)或（3)所述的DNA分子： (1) 序列表中序列2所不的DNA分子； (2) 在嚴格條件下與（1)限定的DNA序列雜交且編碼與植物種子含油量相關的蛋白的 DNA分子； (3) 與（1)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼與植物種子含油量相關的 蛋白的DNA分子； 所述GM-B基因為如下（4)或（5)或（6)所述的DNA分子： (4) 序列表中序列4所示的DNA分子； (5) 在嚴格條件下與（4)限定的DNA序列雜交且編碼與植物種子含油量相關的蛋白的 DNA分子； (6) 與（4)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼與植物種子含油量相關的 蛋白的DNA分子。
5. 如權利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于：所述植物胚特異性啟動子為 REG-2啟動子，具體為如下（7)或（8)或（9)所述的DNA分子： (7) 序列表中序列5所示的DNA分子； (8) 在嚴格條件下與（7)限定的DNA序列雜交且具有啟動子功能的DNA分子； (9) 與（7)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且具有啟動子功能的DNA分子。
6. 含有權利要求1至5中任一所述表達盒的重組載體、轉基因細胞系或重組菌。
7. 權利要求1至5中任一所述的表達盒，或權利要求6所述的重組載體在培育種子油 脂含量增高的轉基因植物中的應用。
8. 如權利要求7所述的應用，其特征在于：所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。
9. 一種培育轉基因植物的方法，包括如下步驟：將權利要求1至5中任一所述的表達 盒導入出發(fā)植物，得到種子油脂含量高于所述出發(fā)植物的轉基因植物。
10. 如權利要求9所述的方法，其特征在于：所述出發(fā)植物為單子葉植物或雙子葉植 物。
【文檔編號】C12N15/82GK104232654SQ201310226002
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年6月7日 優(yōu)先權日:2013年6月7日
【發(fā)明者】曲樂慶, 劉文獻 申請人:中國科學院植物研究所