一種高密度、高油脂含量小球藻細(xì)胞的培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高密度、高油脂含量小球藻細(xì)胞的培養(yǎng)方法：在于培養(yǎng)裝置中加入培養(yǎng)基，經(jīng)滅菌、冷卻后，按工作體積的1～10％接入異養(yǎng)適應(yīng)性小球藻細(xì)胞種子液，藻細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期后，將濃縮紅薯淀粉水解物及異養(yǎng)適應(yīng)性小球藻細(xì)胞種子液補(bǔ)充入發(fā)酵罐中，控制發(fā)酵罐中糖濃度5～15g/L，補(bǔ)充次數(shù)為2～7次，時間間隔12～48小時，獲得高密度、高油脂含量小球藻細(xì)胞。本發(fā)明具有如下的技術(shù)效果，1)本發(fā)明紅薯淀粉水解物碳源高效、廉價、易得；2)較常規(guī)異養(yǎng)，此改進(jìn)異養(yǎng)方法可同步提高小球藻生物量及胞內(nèi)油脂含量，即最高生物量和油脂產(chǎn)率分別達(dá)到22g／L，1.19g/L／d，總油脂產(chǎn)量增幅較大，為12.43g／L；3)為降低生物柴油發(fā)酵成本提供一種新思路，同時為轉(zhuǎn)酯化獲得應(yīng)用價值更高的生物柴油奠定基礎(chǔ)。
【專利說明】一種高密度、高油脂含量小球藻細(xì)胞的培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微藻生物質(zhì)能源領(lǐng)域，涉及一種提高異養(yǎng)小球藻油脂產(chǎn)量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]微藻因其生長速率快、營養(yǎng)利用效率高、極端環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)等優(yōu)勢特性，成為極具潛力的生物柴油原料[Chisti Y.Biotechnology Advances, 2007, 25:294-306]。矛盾的是，諸多微藻，如綠藻、硅藻、鹽藻，其生長速率和油脂積累呈負(fù)相關(guān)性(即生長快，油脂含量低；油脂含量高，生長相對緩慢)，導(dǎo)致高效、快速產(chǎn)油無法實現(xiàn)，微藻生物柴油因此成為“貴族”能源。如何提高藻細(xì)胞生物量并有效富集胞內(nèi)油脂一直是微藻能源領(lǐng)域的一大難題，也是微藻生物柴油實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵[Ryan Georgianna D and Mayfield SP.Nature,2012,488:329-335]。
[0003]目前，微藻培養(yǎng)技術(shù)主要集中在自養(yǎng)、異養(yǎng)、聯(lián)合培養(yǎng)等幾種模式[LiangYN etal.Biotechnology Letters, 2009, 31:1043-1049]。傳統(tǒng)自養(yǎng)培養(yǎng)模式存在細(xì)胞生物量低、易被它種微生物污染、培養(yǎng)復(fù)雜、季節(jié)影響因素大、光依賴性強(qiáng)等弊端，難以實現(xiàn)微藻能源的規(guī)?；痆李元廣等.中國科學(xué)基礎(chǔ)，2009，5:64-70]。同時地，清華大學(xué)胡洪營課題組、中國科學(xué)院王廣策課題組、華南理工大學(xué)陳峰課題組等多個研究團(tuán)隊對極端環(huán)境條件(如貧營養(yǎng)、低溫、高光、高鹽、重金屬離子)脅迫下藻細(xì)胞積累油脂進(jìn)行了研究，均獲得了高油脂含量的藻細(xì)胞，有些藻種屬油脂含量甚至高達(dá)80%以上。盡管氮限制貧營養(yǎng)模式誘導(dǎo)胞內(nèi)油脂積累的具體機(jī)制尚不明確，但其易控性好，因而對其研究較多。法國西英格蘭大學(xué)11 Iman等、日本大阪大學(xué)Takagi等、加拿大渥太華大學(xué)Li等通過限制培養(yǎng)基中硝酸鹽濃度，使得藻細(xì)胞內(nèi)油脂含量分別提高63 %、50.9 %和40 %;臺灣成功大學(xué)Hsieh等采用尿素限制模式，也成功獲得高油脂含量小球藻細(xì)胞。極端環(huán)境脅迫培養(yǎng)利于細(xì)胞油脂含量極大地提高，但同時也限制了細(xì)胞生長，導(dǎo)致生物量較低，影響整體油脂產(chǎn)量。由此可見，單方面藻細(xì)胞生物量或者油脂含量的提`高，均不能獲得高油脂產(chǎn)量，無法滿足微藻作為生物柴油理想原料的要求。
[0004]圍繞藻細(xì)胞生長和油脂積累特性，一些研究學(xué)者又相繼提出了聯(lián)合培養(yǎng)技術(shù)，如“自養(yǎng)-異養(yǎng)，，、“異養(yǎng)-自養(yǎng) ” [Xiong et al.Bioresource Technology, 2010,101:2287-2293 ;Fan et al.Bioresource Technology,2012,112:206-211 ；Mujtaba etal.Bioresource Technology, 2012,123:279-283]，此類培養(yǎng)技術(shù)可使微藻生物量與油脂積累在異種環(huán)境中(分別是利于增大生物量或提高油脂含量的兩種環(huán)境)分步完成，能有效提高微藻油脂產(chǎn)量。但需考慮藻細(xì)胞在異養(yǎng)與自養(yǎng)模式間頻繁轉(zhuǎn)換的環(huán)境適應(yīng)性、光能消耗成本、藻細(xì)胞生長空間狹小等問題[Mata TM et al.Renewable and SustainableEnergy Reviews, 2010，14:217-232]。
[0005]較上述微藻培養(yǎng)模式，單純異養(yǎng)技術(shù)在生物量富集、胞內(nèi)油脂高效積累方面更為有利，可避免光依賴性、復(fù)雜培養(yǎng)過程、成本高、生物量低等弊端。盡管如此，微藻生物柴油商業(yè)化由于高成本的發(fā)酵底物碳源而受到限制。在傳統(tǒng)異養(yǎng)培養(yǎng)基中，葡萄糖碳源成本占據(jù)了整個培養(yǎng)基成本的 80% [Li XF et al.Biotechnology and Bioengineering, 2007,98:764-771]。此后，清華大學(xué)吳慶余課題組利用木薯淀粉水解液、玉米淀粉水解液、甜高粱汁作為碳源替代葡萄糖異養(yǎng)小球藻方面取得了重要突破，細(xì)胞油脂含量高達(dá)55.2%，是自養(yǎng)條件下油脂含量的 4 倍[Xu et al.Journal of Biotechnology, 2006,126:499-507 ;Gao et al.Applied Energy, 2010，87:756-761]。然而，由于低濃度碳源的應(yīng)用致使生物量較低，最終油脂產(chǎn)量并不理想，但提高碳源濃度，又會導(dǎo)致油脂含量較低[Wei et al.J IndMicrobiol Biotechnol, 2009, 36:1383-1389]，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足小球藻作為理想生物柴油原料的要求。因而，尋求更為廉價、優(yōu)質(zhì)替代碳源及提高異養(yǎng)微藻油脂產(chǎn)量尤為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明的目的是提供一種提高異養(yǎng)小球藻油脂產(chǎn)量的方法。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案是，一種高密度、高油脂含量小球藻細(xì)胞的培養(yǎng)方法:在于培養(yǎng)裝置中加入培養(yǎng)基，經(jīng)滅菌、冷卻后，按工作體積的I~10%接入異養(yǎng)適應(yīng)性小球藻細(xì)胞種子液，藻細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期后，將濃縮紅薯淀粉水解物及異養(yǎng)適應(yīng)性小球藻細(xì)胞種子液補(bǔ)充入發(fā)酵罐中，控制發(fā)酵罐中糖濃度5~15g / L，補(bǔ)充次數(shù)為2~7次，時間間隔12~48小時，獲得高密度、高油脂含量小球藻細(xì)胞。
[0008]濃縮紅薯淀粉水解物的其制備方法是:常溫下，取紅薯淀粉、檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，以質(zhì)量體積比為1:4混勻，經(jīng)糊化、液化、糖化，微波煮沸滅酶，離心、過濾收集得到紅薯淀粉水解液，后經(jīng)真空冷凍干燥獲得濃縮紅薯淀粉水解物。
[0009]所述小球藻為生物柴油優(yōu)勢小球藻屬中的原殼小球藻(Chlorellaprotothecoides)、普通小球藻(Chlorella vulgaris)或蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)。
[0010]異養(yǎng)適應(yīng)性小球藻細(xì)胞種子液的制備方法是:挑取活化小球藻細(xì)胞，接入培養(yǎng)基中，黑暗光照交替培養(yǎng)120h，獲得一級小球藻細(xì)胞種子液，將一級小球藻細(xì)胞種子液按10%接種量接入同種培養(yǎng)基中化能異養(yǎng)120h，獲得異養(yǎng)適應(yīng)性小球藻細(xì)胞種子液。
[0011]所述的濃縮紅薯淀粉水解物的組成成份包括:葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪、磷、鈣、鐵、維生素；水解物中各成分重量百分比依次為:葡萄糖75~85%、麥芽糖10~20%、麥芽三糖1.5~5%、蛋白質(zhì)2~3%、氨基酸0.001~0.005%、脂肪0.1~
0.5%、磷0.01 ~0.05%、鈣 0.02 ~0.03%、鐵 0.2 ~0.5%、維生素 0.0005 ~0.0002%。
[0012]本發(fā)明具有如下的技術(shù)效果，I)本發(fā)明紅薯淀粉水解物碳源高效、廉價、易得；2)較常規(guī)異養(yǎng)，此改進(jìn)異養(yǎng)方法可同步提高小球藻生物量及胞內(nèi)油脂含量，即最高生物量和油脂產(chǎn)率分別達(dá)到22g/L，1.19g/L / d，總油脂產(chǎn)量增幅較大，為12.43g/L ；3)為降低生物柴油發(fā)酵成本提供一種新思路，同時為轉(zhuǎn)酯化獲得應(yīng)用價值更高的生物柴油奠定基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為紅薯淀粉水解產(chǎn)物的HPLC液相色譜成分分析。
[0014]圖2為本發(fā)明方法培養(yǎng)的小球藻細(xì)胞透射電鏡圖。
[0015]圖3為小球藻分批異養(yǎng)生物量、油脂產(chǎn)率及還原糖濃度變化分析?！揪唧w實施方式】
[0016]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
[0017]實施例1:
[0018]平板活化原殼小球藻(Chlorella protothecoides)藻種,挑取活化藻細(xì)胞,加入裝有30mL如下所述培養(yǎng)基的IOOmL培養(yǎng)瓶中，黑暗光照交替培養(yǎng)120h，獲得一級種子液，將一級種子液按10%接種量接入裝有IOOmL如下所述培養(yǎng)基的250mL培養(yǎng)瓶中化能異養(yǎng)120h，獲得異養(yǎng)適應(yīng)性種子液。
[0019]每升培養(yǎng)基組成(g / L):
[0020]紅薯淀粉水解液24mL (含有20g糖，其中葡萄糖16g、麥芽糖3g、麥芽三糖 lg)、KH2PO4L 25g、尿素 3g、MgSO4.7H201g、Na2EDTA0.5g、H3BO30.12g、CaCl20.84g、ZnS0.7H200.88g、MnCl2.4H200.14g、MoO30.07g、CuSO4.5H200.16g、Co (NO3) 2.6H200.05g,FeSO4.7H200.05g,培養(yǎng)基 pH6.1。
[0021]在2L發(fā)酵罐中加入初始pH為6.1的上述培養(yǎng)基，經(jīng)滅菌、冷卻后，按工作體積的5%將異養(yǎng)適應(yīng)性種子液接入發(fā)酵罐中，待糖耗盡后，將濃縮的紅薯淀粉水解物、異養(yǎng)適應(yīng)性種子液同時補(bǔ)入發(fā)酵罐中，維持糖濃度在5~15g / L，共補(bǔ)充7次，整個過程黑暗培養(yǎng)，溫度為28°C，待糖耗盡后，收獲得到高密度、高油脂含量藻細(xì)胞。
[0022]如圖1所示，本發(fā)明紅薯淀粉水解物碳源，其HPLC分析糖成分結(jié)果顯示:葡萄糖(80% )、麥芽糖(15.0089% )、麥芽三糖(2.05% )，是理想的廉價、易得、優(yōu)質(zhì)碳源。
[0023]如圖2所示，從圖1(A)看出，傳統(tǒng)異養(yǎng)條件原殼小球藻細(xì)胞內(nèi)淀粉積累為主，少數(shù)油脂滴存在；本發(fā)明異養(yǎng)培養(yǎng)方法(圖1B)油脂滴數(shù)量增加，提示藻細(xì)胞內(nèi)油脂含量顯著提聞。
`[0024]如圖3所示，以本發(fā)明異養(yǎng)培養(yǎng)法異養(yǎng)原殼小球藻，其最大生物量和油脂產(chǎn)率分別為22.0g / L和1.19g/L / d，總油脂產(chǎn)量最大產(chǎn)量為12.43g / L。
[0025]比較例I
[0026]培養(yǎng)基基本組成同實施例1，以20g葡萄糖替代紅薯淀粉水解產(chǎn)物，培養(yǎng)條件和過程與實施例1相一致。結(jié)果分析測得細(xì)胞生物量為9.8g/L，油脂產(chǎn)率為412mg / L / d，總油脂最大產(chǎn)量為4.29g/L。
[0027]比較例2
[0028]培養(yǎng)基基本組成同實施例1，以16g葡萄糖、3g麥芽糖、Ig麥芽三糖替代紅薯淀粉水解產(chǎn)物，培養(yǎng)條件和過程與實施例1相一致。結(jié)果分析測得細(xì)胞生物量為12.7g / L，油脂產(chǎn)率為525mg / L / d，總油脂最大產(chǎn)量為5.46g/L。
[0029]根據(jù)上述培養(yǎng)結(jié)果可以看出，在同樣基礎(chǔ)培養(yǎng)基條件下，紅薯淀粉水解物中的葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、礦物質(zhì)、維生素，較純葡萄糖或葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖組合作為碳源，更能有效促進(jìn)微藻生生物量和藻細(xì)胞內(nèi)油脂的積累，其生物量和油脂產(chǎn)量增幅比較明顯，培養(yǎng)效果較好。
【權(quán)利要求】
1.一種高密度、高油脂含量小球藻細(xì)胞的培養(yǎng)方法:其特征在于:在于培養(yǎng)裝置中加入培養(yǎng)基，經(jīng)滅菌、冷卻后，按工作體積的I~10%接入異養(yǎng)適應(yīng)性小球藻細(xì)胞種子液,藻細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期后，將濃縮紅薯淀粉水解物及異養(yǎng)適應(yīng)性小球藻細(xì)胞種子液補(bǔ)充入發(fā)酵罐中，控制發(fā)酵罐中糖濃度5~15g/L，補(bǔ)充次數(shù)為2~7次，時間間隔12~48小時，獲得高密度、高油脂含量小球藻細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高密度、高油脂含量小球藻細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于:濃縮紅薯淀粉水解物的其制備方法是:常溫下，取紅薯淀粉、檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，以質(zhì)量體積比為1:4混勻，經(jīng)糊化、液化、糖化，微波煮沸滅酶，離心、過濾收集得到紅薯淀粉水解液，后經(jīng)真空冷凍干燥獲得濃縮紅薯淀粉水解物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高密度、高油脂含量小球藻細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于:所述小球藻為生物柴油優(yōu)勢小球藻屬中的原殼小球藻(Chlorella protothecoides)、普通小球藻(Chlorella vulgaris)或蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高密度、高油脂含量小球藻細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于:異養(yǎng)適應(yīng)性小球藻細(xì)胞種子液的制備方法是:挑取活化小球藻細(xì)胞，接入培養(yǎng)基中，黑暗光照交替培養(yǎng)120h，獲得一級小球藻細(xì)胞種子液，將一級小球藻細(xì)胞種子液按10%接種量接入同種培養(yǎng)基中化能異養(yǎng)120h，獲得異養(yǎng)適應(yīng)性小球藻細(xì)胞種子液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的一種高密度、高油脂含量小球藻細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于:所述的濃縮紅薯淀粉水解物的組成成份包括:葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪、磷、鈣、鐵、維生素；水解物中各成分重量百分比依次為:葡萄糖75~85%、麥芽糖10~20%、麥芽三糖1.5~5%、蛋白質(zhì)2~3%、氨基酸0.001~0.005%、脂肪0.1~.0.5%、磷0.01 ~0.05%、鈣 0.02 ~0.03%、鐵 0.2 ~0.5%、維生素 0.0005 ~0.0002%。
【文檔編號】C12N1/12GK103555588SQ201310562767
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月10日
【發(fā)明者】李玉芹, 陳迪, 穆錦秀, 韓方欣, 徐華, 曾虹燕 申請人:湘潭大學(xué)