HIV-1中國(guó)流行株CRF01_AEenv基因的改造的制作方法【專利摘要】本發(fā)明提供了一種改造后的CRF01_AE?env基因。所述的改造后的CRF01_AE?env基因增加了GC含量，破壞其中AU含量較高的內(nèi)部抑制性序列（INS），使其更適合于在真核細(xì)胞中表達(dá)?？梢圆灰蕾囉谡{(diào)節(jié)蛋白R(shí)ev及其應(yīng)答元件在真核細(xì)胞中高效表達(dá)，與改造前相比，表達(dá)量明顯提高。選擇改造后的mod.AE?env基因?yàn)橐呙缁颍瑯?gòu)建重組HIV-1疫苗有可能提高疫苗的免疫原性?！緦＠f(shuō)明】HIV-1中國(guó)流行株CRF01_AEenv基因的改造【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。本發(fā)明涉及具有中國(guó)代表性Hiv-1CRF01_AE亞型毒株env區(qū)共有序列的獲得及改造以提高其表達(dá)水平?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]人類免疫缺陷病毒I型(Humanimmunodeficiencyvirustypeone，HIV_l)是獲得性免疫缺陷綜合征(acquiredimmunodeficiencydisease,AIDS)的主要病原體。聯(lián)合國(guó)艾滋病規(guī)劃署最新的報(bào)告估計(jì)，世界范圍內(nèi)的HIV感染者約3400萬(wàn)，其中婦女兒童約占55%，多達(dá)1840萬(wàn)，每年將近200萬(wàn)的感染者死于ADIS相關(guān)的疾病。盡管在過(guò)去十年里，廣泛的宣傳教育、行為干預(yù)和治療干預(yù)在一定程度上降低了HIV的感染率和死亡率，但是新發(fā)感染人數(shù)仍以每年超過(guò)200萬(wàn)的數(shù)字居高不下。截至2011年底，我國(guó)境內(nèi)的艾滋病病毒感染者和艾滋病病人約78萬(wàn)人，當(dāng)年新發(fā)感染人數(shù)約4.8萬(wàn)人，艾滋病相關(guān)疾病死亡人數(shù)約2.8萬(wàn)1O這些數(shù)據(jù)表明，盡管HIV新發(fā)感染率一直在下降，但是HIV感染者總數(shù)仍在增加，艾滋病疫情形式依然嚴(yán)峻，有效的預(yù)防和治療性艾滋病疫苗的研究刻不容緩。艾滋病疫苗作為生物醫(yī)學(xué)干預(yù)的主要手段，將在控制HIV感染和AIDS流行中起到重要的作用。[0003]CRFO1_AE是最早被證實(shí)的HIV-1流行重組型，1993年首次發(fā)現(xiàn)于非洲2，但大部分的CRFO1_AE分布在南亞和東南亞；柬埔寨、泰國(guó)和越南等國(guó)CRFO1_AE占95%以上3;我國(guó)的CRF01_AE約占15%，在部分地區(qū)CRF01_AE是主要亞型。我國(guó)首次檢測(cè)到該病毒株是在1994年于泰國(guó)從事性工作的云南籍婦女體內(nèi)4，1996年首次發(fā)現(xiàn)廣西靜脈吸毒和異性傳播途徑中存在CRF01_AE病毒株流行5。隨后CRF01_AE流行的范圍逐漸擴(kuò)大，全國(guó)大部分地區(qū)都有報(bào)道，2010年的分子流行病學(xué)調(diào)查顯示，北京市CRF01_AE占所有亞型的40.4%，是北京市HIV-1的最主要流行株，·成為男同人群中的主要亞型；即使在B’亞型占主要地位的河南省也檢出了CRF01_AE。CRF01_AE亞型毒株已成為繼B’亞型毒株之后的我國(guó)的主要流行亞型，因此設(shè)計(jì)針對(duì)于我國(guó)CRF01_AE亞型毒株分子生物學(xué)特征的疫苗迫在眉睫?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0004]本研究從北京市確證CRF01_AE亞型HIV-1感染者血液標(biāo)本中克隆到42株含有完整開放性閱讀框(ORF)的env基因，通過(guò)生物軟件比對(duì)獲得其一致性共有序列。HIV-1的Gag、Pol、env等蛋白轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物編碼區(qū)存在很多抑制性序列(INS)，使得這些轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物只有與病毒的調(diào)控蛋白R(shí)ev結(jié)合以后才能有效地被轉(zhuǎn)運(yùn)至胞漿中翻譯蛋白6。本研究利用同義密碼子替換去除這些序列，從而使得上述蛋白不依賴于Rev蛋白的表達(dá)。我們按照哺乳動(dòng)物優(yōu)勢(shì)密碼子的使用原則，在不改變氨基酸序列的前提下，對(duì)該共有序列env基因進(jìn)行了密碼子改造，增加了GC含量，破壞其中AU含量較高的內(nèi)部抑制性序列(INS)，使其更適合于在真核細(xì)胞中表達(dá)。在293T細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果顯示，改造后的基因可以在Rev缺陷的系統(tǒng)中有效表達(dá)。說(shuō)明通過(guò)密碼子改造獲得了可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高表達(dá)的CRF01_AE亞型env基因，而且該基因的表達(dá)不依賴于Rev蛋白及其應(yīng)答元件。選擇改造后的mod.AEenv基因?yàn)橐呙缁?，?gòu)建重組HIV-1疫苗有可能提高疫苗的免疫原性。[0005]本研究采用了可應(yīng)用于人體的質(zhì)粒載體pVR7(由吉林大學(xué)孔維教授饋贈(zèng))，該載體采用卡那霉素抗性代替一般載體常采用的氨芐抗性篩選標(biāo)記在大腸桿菌中篩選陽(yáng)性克隆，并且不含有任何真核篩選標(biāo)記，保證了其在人體內(nèi)的安全性。在該質(zhì)粒中插入目的基因mod.AEenv,構(gòu)建了重組DNA疫苗，命名為pVR-mod.AEenv。WesternBlot結(jié)果顯不pVR-mod.AEenv在Rev缺陷的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中可有效表達(dá)改造后env基因。[0006]參考文獻(xiàn):[0007]1.2012ChinaAIDSResponseProgressReport.[0008]2.MurphyE,KorberBandGeorges-CourbotMC,etal.!DiversityofV3regionsequencesofhumanimmunodeficiencyvirusestypeIfromthecentralAfricanRepublic.AIDSResHumRetroviruses1993;9:997-1006.[0009]3.HemelaarJ,GouwsE,GhysPDandOsmanovS:GlobalandregionaldistributionofHIV-1geneticsubtypesandrecombinantsin2004.Aids2006;20:W13-W23.[0010]4.ChengH,ZhangJ,CapizziJ,YoungNLandMastroTD:HIV-1subtypeEinYunnan,China.Lancet1994;344:953-954.[0011]5.ChenJ,YoungNLandSubbaraoS,etal.:HIVtypeIsubtypesinGuangxiProvince,China,1996.AIDSResHumRetrovirusesl999;15:81-84.[0012]6.CullenBR:Mechanismofactionofregulatoryproteinsencodedbycomplexretroviruses.MicrobiolRev1992;56:375-394[0013]7.MaHX,YuXH,JiangCL,WuYG,KongWe1:ConstructionofEukaryoticExpressionVectorandScreeningofCellStrainforStableExpressionofHIV-1SubtypeB/CEnv.ChinJBiologicals2006;19(4):365-367【專利附圖】【附圖說(shuō)明】[0014]圖1為中國(guó)HIV_1CRF01_AE感染者env基因氨基酸序列比對(duì)結(jié)果及其共有序列。[0015]圖2為改造前后env基因序列比對(duì)結(jié)果,可以看出優(yōu)化改造后的mod.AEenv的GC含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于改造前wt.AEenv,從而破壞了AU含量較高的內(nèi)部抑制性序列。[0016]圖3為pVR-mod.AEenv質(zhì)粒酶切(SalI/BglII)圖譜，結(jié)果顯示成功將mod.AEenv克隆到pVR載體上。[0017]圖4為pVR-mod.AEenv和pVR-wt.AEenv表達(dá)差異的WesternBlot檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果顯示構(gòu)建的重組pVR質(zhì)粒成功的表達(dá)了mod.AEenv基因，且表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于pVR-wt.AEenvο【具體實(shí)施方式】:[0018]1.HIV-1CRFO1_AEenv基因的克隆及共有序列的獲得[0019]對(duì)EDTA抗凝采血管采集的100份北京地區(qū)HIV-1感染者外周靜脈血，采用QIAGEN公司的QIAampDNABloodMiniKit(Cat.N0.51106)，按照說(shuō)明書進(jìn)行前病毒DNA提取，核酸樣品置于_20°C保存。通過(guò)nested-PCR方法擴(kuò)增gag基因片段，用于樣本HIV-1型別分析。采用TaKaRa公司生產(chǎn)的ExTaq(Cat.N0.DRR100A)，以GagF2(5，ATGGGTGCGAGAGCGTCARTATTAA3，，HXB2位置790~814)、Gage2(5，TCCAACAGCCCTTTTTCCTAGG3’，HXB2位置2032~2011)作為外側(cè)引物進(jìn)行第一輪PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為25μI體系:10XExTaqBuffer2.5μ1,25mMdNTPMixture2μI,TaKaRaExTaq(5U/μI)0.125μI,模板2μ1，引物GagF2、Gage2各(λ5μ1，補(bǔ)加ddH20至25μI。反應(yīng)程序:94°C5分鐘，52°CI分鐘，72°C2分30秒，I個(gè)循環(huán)，94°C30秒，52°C30秒，72°CI分30秒，30個(gè)循環(huán)，72°C10分鐘。取第一輪反應(yīng)產(chǎn)物5μI作為第二輪PCR反應(yīng)模板，以306(5’GGGAAAAAATTCGGTTAAGGCC3，，HXB2位置836~857)、Cn-gag(5，TAGTTCCTGCTATRTCACTTCC3，，HXB2位置1507~1406)為內(nèi)側(cè)引物進(jìn)行巢氏PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為50μI體系:10XExTaqBuffer5μl,25mMdNTPMixture4μLTaKaRaExTaq(5U/μ1)0.25μI，第一輪反應(yīng)產(chǎn)物5μ1，引物306、Cn-gag各0.5μ1，補(bǔ)加ddH20至50μI。反應(yīng)程序:94°C2分鐘，50°C50秒，720CI分30秒，I個(gè)循環(huán)，94°C30秒，50°C30秒，72°CI分鐘，35個(gè)循環(huán)，72°C10分鐘。將擴(kuò)增出目的片段(600bp左右)的產(chǎn)物切膠回收后送于北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)得的序列結(jié)果通過(guò)Mega5.0軟件,使用自展法(bootstrap)構(gòu)建Neighbor-Joining(NJ)進(jìn)化樹，與相應(yīng)的參考株序列形成較穩(wěn)定可靠的系統(tǒng)進(jìn)化簇(bootstrap值>70%)，以判定該樣本序列的亞型。對(duì)分型確認(rèn)為CRF01_AE亞型的27份樣本采用AE亞型特異性引物進(jìn)行rev-env區(qū)的擴(kuò)增，外側(cè)引物env-F15’GTAGATCCTAACCTAGAG3，(HXB2位置5840~5857)、env-Rl5’CTAGATCTTGAGATACTGCTCCTAC3’(HXB2位置8884~8908)用于第一輪PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件:10XExTaqBuffer2.5μl,25mMdNTPMixture2μ1，TaKaRaExTaq(5U/μ1)0.125μ1，模板2μ1，引物env-Fl、env-Rl各0.5μ1，補(bǔ)加ddH20至25μI。反應(yīng)條件為94°C5min預(yù)變性，94°C30sec,55°C30sec,72°C3min,30個(gè)循環(huán)，72°CIOmin0內(nèi)側(cè)引物env-F25，GCGAATTCATGGCAGGAAGAAGCG3，(HXB2位置5970~5985)、env_R25’CCGCTCGAGGACCACTTGCCTCCCATGTTATA3’(HXB2位置8791~8813)用于第二輪PCR反應(yīng)，取第一輪反應(yīng)產(chǎn)物5μI作為模板，反應(yīng)條件為IOXExTaqBuffer5μl,25mMdNTPMixture4μLTaKaRaExTaq(5U/μI)0.25μ1，第一輪反應(yīng)產(chǎn)物5μ1，引物env_F2、6鮮-1?2各0.541，補(bǔ)加(1(1!120至5(^1。反應(yīng)條件為94°C5min預(yù)變性，94°C30sec,55°C30sec，72°C3min，35個(gè)循環(huán)，72°CIOmin0PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1%凝膠電泳分析，發(fā)現(xiàn)有15份樣本擴(kuò)增出2.Skb左右的目的條帶，將特異性條帶切膠回收后，采用EcoRI/XhoI對(duì)產(chǎn)物和載體pCDNA3.1(+)雙酶切，分別回收2.8kb左右的目的基因片段和5.4kb的pCDNA3.1(+)載體片段，進(jìn)行連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細(xì)胞；通過(guò)菌落PCR的方式篩選陽(yáng)性克隆，進(jìn)行質(zhì)粒抽提，將初步鑒定正確的重組子送于北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序。對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行編輯、校對(duì)后發(fā)現(xiàn)，其中有42個(gè)基因具有完整的開放性閱讀框，采用之前描述的方式對(duì)獲得的rev-env區(qū)序列進(jìn)行型別分析，確定均為為CRF01_AE亞型。通過(guò)VectorNTI軟件，對(duì)42條env序列進(jìn)行比對(duì)，獲得其共有序列(見圖1)。[0020]2.共有序列env基因的改造、全基因合成和鑒定[0021]根據(jù)哺乳動(dòng)物密碼子的偏嗜性，在不改變氨基酸序列的前提下，以哺乳動(dòng)物所偏嗜的密碼子反替換共有序列中對(duì)應(yīng)的氨基酸，同時(shí)在序列上游依次引入酶切位點(diǎn)Sal1、EcoRI以及kozak序列，下游引入酶切位點(diǎn)BglII。密碼子第三位堿基的G/C含量較高為哺乳動(dòng)物的特征，含有此特征的基因有可能在真核細(xì)胞中高效表達(dá)。同時(shí)通過(guò)同義替換的方式去除了編碼區(qū)抑制性序列(INS)，使得Env蛋白不依賴于Rev的表達(dá)。通過(guò)全基因合成獲得了改造后基因(mod.AEenv)，優(yōu)化序列由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成，并通過(guò)SfiI酶切位點(diǎn)插入克隆載體pMKRQ質(zhì)粒。將帶有優(yōu)化基因的質(zhì)粒pMKRQ-mod.AEenv送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。優(yōu)化后的env序列與野生型的比對(duì)結(jié)果顯示其密碼子使用頻率發(fā)生了很大改變，整個(gè)基因的GC含量明顯增加，尤其是密碼子第三位的堿基(見圖2)。優(yōu)化后的密碼子序列如SEQIDN0.1所示，所編碼的蛋白氨基酸序列如SEQIDN0.2所示。[0022]3.含mod.AEenv基因的DNA疫苗pVR-mod.AEenv的構(gòu)建及鑒定[0023]本研究采用了可應(yīng)用于人體的質(zhì)粒載體pVR7，由吉林大學(xué)孔維教授饋贈(zèng)。該載體采用卡那霉素抗性基因代替一般載體常采用的氨芐抗性篩選標(biāo)記基因，在大腸桿菌DH5CI中篩選陽(yáng)性克隆，并且不含有任何真核篩選標(biāo)記，保證了其在人體內(nèi)的安全性，以便所構(gòu)建的DNA疫苗最終應(yīng)用于臨床試驗(yàn)。采用SalI和BglII對(duì)pMKRQ-mod.AEenv以及pVR載體雙酶切，對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，分別回收前者2.85kb的mod.AEenv基因片段和后者4.9kb的pVR載體片段，進(jìn)行連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆，命名為pVR-mod.AEenv，對(duì)陽(yáng)性質(zhì)粒以SalI和BglII雙酶切鑒定，可見大小為2.85kb及4.9kb兩條片段(見圖3泳道2)，并送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司做測(cè)序鑒定。[0024]4、基因優(yōu)化前后表達(dá)差異的研究[0025]設(shè)計(jì)引物wt.envF(5'CGCGTCGACATGAGAGTGAGGGGGATACAG3/)和wt.envR(5'GGCAGATCTTTATAGTAAAGCCCTTTC3/)，分別在上述上、下游引物中引入SalI和BglII的酶切位點(diǎn)，以pcDNA3.1(+)_CNAE01rev-env質(zhì)粒(CNAEOlenv序列見圖1)為模板，米用Invitrogen公司生產(chǎn)的Platinum?TaqDNAPolymeraseHighFidelity(Cat.N0.11304-011)擴(kuò)增目的基因wt.env。反應(yīng)體系為:10XHighFidelityPCRBuffer5μI,IOmMdNTPmixtureIμI,50mMMgSO42μI,引物wt.envF、R各IμI,Platinum?TaqHighFidelity0.2μ1，模板質(zhì)粒按1:100稀釋后加入2μI,補(bǔ)加ddH20至50μI。反應(yīng)條件為94°C2min預(yù)變性，94°C30sec，55°C30sec，68°C3min，35個(gè)循環(huán)，68°CIOmin0PCR產(chǎn)物經(jīng)I%瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收反應(yīng)產(chǎn)物中2.6kb左右的特異性條帶，用SalI/BglII雙酶切回收產(chǎn)物和質(zhì)粒載體pVR，分別回收2.6kb的wt.env基因片段和4.9kb的PVR載體酶切片段，進(jìn)行連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆，命名為pVR-wt.AEenv0通過(guò)WesternBlot方法檢測(cè)env基因優(yōu)化前后的表達(dá)差異。將293T細(xì)胞接種于6孔板，6XIO5/孔,待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時(shí),按照Promega公司產(chǎn)品說(shuō)明書,用FuGENEHD轉(zhuǎn)染試劑將重組質(zhì)粒pVR-mod.AEenv和pVR-wt.AEenv按相同條件轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，72小時(shí)后收集細(xì)胞，每孔加入100μI三去污劑裂解緩沖液(具體配制方法參見分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第二版第872頁(yè))，冰上作用30min后，離心收集上清，吸取上清與5XSDS凝膠加樣緩沖液以4:1比例混合，沸水浴IOmin使蛋白變性，按順序加樣于SDS聚丙烯酰胺凝膠(積層膠為5%，分離膠為10%)，恒壓100V進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳。電泳結(jié)束后，通過(guò)石墨電轉(zhuǎn)儀將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，將PVDF膜置于含5%脫脂奶的PBS中室溫封閉2h，棄封閉液，加入1:1000稀釋的2G12抗體，同時(shí)加入1:500稀釋的GAPDH鼠單抗作為對(duì)照，室溫孵育2h，用PBST(含0.05%Tween-20的PBS)洗滌3次，每次15min，然后加入1:1000稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗人IgG和山羊抗鼠IgG，室溫孵育Ih，以I3BST洗滌3次，每次15min，最后加入DAB顯色。結(jié)果如圖4所示，pVR-mod.AEenv轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞可見明顯的160KD大小的蛋白條帶(泳道2)，pVR-wt.AEenv轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞(泳道3)及293對(duì)照細(xì)胞(泳道1)都未見明顯蛋白條帶。表明野生型erw基因在缺失Rev蛋白的環(huán)境中不能有效表達(dá)，對(duì)其進(jìn)行密碼子優(yōu)化后獲得的改造后env基因在缺失Rev的環(huán)境中能高水平表達(dá)，說(shuō)明我們對(duì)AEenv基因的改造是成功的。以之為基礎(chǔ)構(gòu)建的DNA疫苗能高水平表達(dá)外源基因，因而可以作為疫苗應(yīng)用?！緳?quán)利要求】1.一種改造后的env基因，該基因能夠不依賴調(diào)節(jié)蛋白R(shí)ev在真核細(xì)胞中有效表達(dá)。2.權(quán)利要求1所述的改造后的env基因，該基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。3.—種env蛋白，其特征在于由權(quán)利要求1或2所述的env基因編碼得到，所述蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。4.一種重組載體，其中含有權(quán)利要求2所述的改造后的env基因。5.一種重組宿主細(xì)胞，其中含有權(quán)利要求4所述的重組載體。6.一種用于預(yù)防和/或治療艾滋病的重組DNA疫苗，該疫苗包含其中插入了權(quán)利要求1或2所述造后的env基因的質(zhì)粒載體。7.權(quán)利要求6所述的DNA疫苗，其中所述的質(zhì)粒載體為pcDNA3.1(+)或pVR。8.權(quán)利要求7所述的DNA疫苗，其中所述的質(zhì)粒載體為pVR。9.權(quán)利要求1所述基因或權(quán)利要求6所述DNA疫苗在制備用于預(yù)防和/或治療艾滋病的藥物中的用途。【文檔編號(hào)】C12N15/49GK103589738SQ201310562444【公開日】2014年2月19日申請(qǐng)日期:2013年11月12日優(yōu)先權(quán)日:2013年11月12日【發(fā)明者】曾毅,馮霞,陳丹瑛,何小周,余雙慶,李澤琳申請(qǐng)人:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所,北京工業(yè)大學(xué),曾毅