專利名稱：工業(yè)化制備載高密度細(xì)胞的海藻酸鈉微囊的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微囊化細(xì)胞工程的生物醫(yī)藥領(lǐng)域，更具體地說，涉及一種工業(yè)化大量
制備載高密度細(xì)胞的海藻酸鈉微囊及改善囊形的新方法。
背景技術(shù)：
利用微囊包裹具有特定功能的組織細(xì)胞，形成免疫隔離的人工細(xì)胞，以此植入患 病動物或病人體內(nèi)，可補(bǔ)充疾病體內(nèi)缺乏的生理活性物質(zhì)，從而達(dá)到治療疾病的目的。采用 海藻酸鈉-聚賴氨酸-海藻酸鈉(APA)或海藻酸鈉-殼聚糖-海藻酸鈉(ACA)制作的三層 結(jié)構(gòu)膜微囊，具有體積小(粒徑范圍200 lOOOiim)，生物相容性好，表面積大，有利于微 囊化細(xì)胞在動物體內(nèi)較長時(shí)間存活的特點(diǎn)。大量的實(shí)驗(yàn)表明，APA微囊的囊膜可截留大于 ll萬Kd的分子，從而使免疫球蛋白分子和免疫活性細(xì)胞不能透過囊膜而進(jìn)入囊內(nèi)破壞其 中的動物細(xì)胞，因而具有較好的免疫保護(hù)作用。 利用海藻酸鈉-聚賴氨酸_海藻酸鈉(APA)或海藻酸鈉_殼聚糖_海藻酸鈉(ACA) 為微囊囊材，包裹細(xì)胞或組織的微囊化細(xì)胞工藝，主要包括細(xì)胞與海藻酸鈉溶液混合、成 球、包覆聚賴氨酸、包覆海藻酸鈉和洗出游離海藻酸鈉、微囊液化等步驟。首先將細(xì)胞或組 織與適當(dāng)濃度的海藻酸鈉溶液混合均勻，然后用高壓靜電液滴法或氣流切割法將混合液滴 至固化溶液中(等滲的CaC^溶液)形成海藻酸鈣微球，然后再將微球先后投入到適當(dāng)濃 度的聚賴氨酸溶液(或殼聚糖溶液)和海藻酸鈉溶液中包覆聚賴氨酸(或殼聚糖溶液)和 海藻酸鈉，最后將微球投入到檸檬酸鈉溶液中洗出游離的海藻酸鈉，液化微球的核心，即可 獲得APA、 ACA微囊化的細(xì)胞或組織。 關(guān)于APA、 ACA微囊化的細(xì)胞或組織的制備工藝，目前文獻(xiàn)和專利報(bào)道的APA， ACA 微囊的制備方法，一般采用高壓靜電液滴法(Electrostatic droplet generation)。例 如，文獻(xiàn)報(bào)道中，楊曉明等(楊曉明，畢好生，楊茂元等，微囊化人嗜鉻細(xì)胞體外培養(yǎng)的研 究[J].中華麻醉學(xué)雜志，2001 ;21(7) :410-413.)和李濤等(李濤，周道標(biāo)，杜智等，用APA 微囊牛腎上腺嗜鉻細(xì)胞移植治療疼痛的研究[J].中國生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)報(bào)，2002;21(2): 97-101.)分別利用加拿大產(chǎn)微囊靜電儀，采用高壓靜電法制備了人和牛的腎上腺嗜鉻細(xì)胞 的海藻酸鈉微囊。專利文獻(xiàn)報(bào)道中，李濤(CN1454995，利用海藻酸鈉-殼聚糖-海藻酸鈉 微囊包埋細(xì)胞或組織的方法)采用高壓靜電液滴法制備不同孔徑的ACA微囊化細(xì)胞或組 織。該法制備的ACA微囊孔徑容易控制且分布均勻，通透性能好，故可廣泛用于包埋肝、腎 上腺、甲狀腺、甲狀旁腺、性腺等細(xì)胞或胰島等組織。薛毅瓏(CN1345234，用于治療疼痛的微 囊化牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞藥物；CN1242197用于治療帕金森病的微囊化牛腎上腺髓質(zhì)嗜 鉻細(xì)胞藥物)采用高壓靜電液滴法制備了微囊化牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞，該細(xì)胞藥物能在 人體內(nèi)長期地分泌鎮(zhèn)痛物質(zhì)和多巴胺，植入一次可以止痛數(shù)個(gè)月以上，可用于治療疼痛和 帕金森病。 高壓靜電液滴法的原理如下在高壓靜電場下，海藻酸鈉液滴表面帶靜電，由于電 荷的排斥作用，可是注射器針頭生成的液滴大小均勻，表面張力變大而使液滴收縮更為圓整，滴入CaC12溶液的固化液后，就可獲得粒徑大小均勻的海藻酸鈣微球，從而最終能夠制 備大小均勻的APA、 ACA微囊。 高壓靜電液滴法具有簡便易行、需樣品量少等優(yōu)點(diǎn)，但存在的主要問題是(1)微 囊的生產(chǎn)效率低，遠(yuǎn)不能適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)需要；(2)制備的海藻酸鈉微囊粒徑分布較寬，一 般為100 600 ii m。 近來，為適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)要求，采用其他原理進(jìn)行細(xì)胞微囊化的工藝應(yīng)運(yùn)而生。其 中振動噴嘴法(Vibrating jet breakup)因具有生產(chǎn)效率高，粒徑分布窄的優(yōu)點(diǎn)，越來越廣 泛應(yīng)用于細(xì)胞微囊化的實(shí)驗(yàn)應(yīng)用和工業(yè)化生產(chǎn)中。 振動噴嘴法的原理同樣也是利用了液體的表面張力作用和高壓靜電作用，但是為 了加快液滴生產(chǎn)的速率，提高微囊的制備效率，利用電磁振動原理，快速生產(chǎn)液滴。這樣海 藻酸鈉液滴，在電磁振動作用下快速生成液滴；高壓靜電場的作用下，液滴荷電，靜電排斥 力使液滴表面張力增大。在電磁振動和靜電場的雙重作用下，液滴的生成更加均勻，大小更 為集中，這樣就大大提高了微囊的制備效率。 但在實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)的過程中，我們發(fā)現(xiàn)振動噴嘴法制備海藻酸鈉微囊，存在著包裹 細(xì)胞密度低的缺點(diǎn)，達(dá)不到高密度微囊化細(xì)胞的要求，阻礙著該法微囊化細(xì)胞工程的中試、 工業(yè)化生產(chǎn)中進(jìn)一步的應(yīng)用。該缺點(diǎn)主要表現(xiàn)如下當(dāng)細(xì)胞密度較低時(shí)，所得微囊大小均 勻，囊形好；當(dāng)細(xì)胞密度較高時(shí)，所得微囊囊形較差，粒徑大小差異大，粒徑范圍分布廣。在 微囊化細(xì)胞的臨床應(yīng)用時(shí)，由于注射給藥針管大小、給藥體積等因素的限制，微囊中的細(xì)胞 密度需要達(dá)到較高的密度，微球的粒徑大小要符合要求，粒徑分布應(yīng)集中，因而有必要采取 新的工藝來提高微囊化技術(shù)的細(xì)胞密度和改善囊形。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種制備載高密度細(xì)胞的海藻酸鈉微囊的方
法、改善囊形和粒徑分布，提高生產(chǎn)效率，滿足細(xì)胞微囊化工業(yè)化生產(chǎn)大量制備的要求，從 而為細(xì)胞微囊化工程提供一種細(xì)胞密度高、囊形圓整、粒徑大小均勻，分布范圍窄的微囊化 細(xì)胞技術(shù)平臺。 本發(fā)明人針對現(xiàn)有的技術(shù)狀況進(jìn)行了深入研究，通過大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用
下述技術(shù)方案即可達(dá)到上述目的，從而完成了本發(fā)明。 工業(yè)化制備載高密度細(xì)胞的海藻酸鈉微囊的方法，是一種采用采用振動噴嘴法， 以海藻酸鈉_聚賴氨酸或殼聚糖_海藻酸鈉為復(fù)合包裹材料，制備海藻酸鈉微囊，包裹細(xì)胞 的方法，其創(chuàng)新之處在于，且提高海藻酸鈉微囊制備過程中海藻酸鈉的濃度至1. 5 5%， 在微囊的固化溶液中加入表面活性劑，用以提高海藻酸鈉微囊中細(xì)胞包裹密度、改善微囊 形狀和粒徑分布。 前述的方法，在優(yōu)選的方案中，海藻酸鈉微囊制備過程中海藻酸鈉的濃度為 1.5 3%。規(guī)格為中粘度。 前述的方法，在優(yōu)選的方案中，所述表面活性劑為泊洛沙姆、吐溫、人血白蛋白 (HSA)、牛血白蛋白(BSA)、曲拉通(Triton X100)或十二烷基硫酸鈉(SDS)。優(yōu)選為吐溫 80、泊洛沙姆188 (F68)或人血白蛋白。
前述的方法，在優(yōu)選的方案中，所述表面活性劑的濃度分別為吐溫80 :0. 05 5%，泊洛沙姆188 :0. 1 5%，人血白蛋白0. 1 5%。更優(yōu)選為吐溫80 :0. 1 0. 5%， 泊洛沙姆188 :0. 5 1%，人血白蛋白0. 5 1%。 本發(fā)明采用主要特點(diǎn)是(l)微囊的制備方法采用振動噴嘴法。利用APA微囊和 ACA微囊包裹動物細(xì)胞，制備成APA或ACA微囊化細(xì)胞。該法具有生產(chǎn)效率高，微囊粒徑分布 集中的特點(diǎn)，能夠適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)大量制備的要求；而傳統(tǒng)的高壓靜電液滴法生產(chǎn)效率低， 不適應(yīng)中試、工業(yè)化生產(chǎn)中大量制備微囊化細(xì)胞的要求。(2)在海藻酸鈉微囊的制備過程 中，提高海藻酸鈉的濃度至適宜濃度，可明顯提高包封細(xì)胞的密度，同時(shí)有助于改善囊形； (3)在微囊的固化溶液(CaC^溶液)中加入泊洛沙姆、吐溫、曲拉通、牛血白蛋白(BSA)、人 血白蛋白(HSA)等水溶性表面活性劑，用來改善微囊形狀，減少囊的聚集，使微囊粒徑分布 范圍窄。其中，泊洛沙姆188(F68)、人血白蛋白已經(jīng)被多個(gè)國家批準(zhǔn)應(yīng)用于注射途徑的制劑 中，安全性能好。同人血白蛋白(HSA)相比，泊洛沙姆188(F68)為人工合成的表面活性劑， 具有化學(xué)穩(wěn)定性好，其水溶液可耐受高壓滅菌，價(jià)格低廉的優(yōu)勢。本發(fā)明通過以上新方法， 可顯著提高海藻酸鈉微囊中細(xì)胞的密度，改善微囊的囊形，微囊粒徑分布均勻，提高生產(chǎn)效 率，以滿足微囊工業(yè)化生產(chǎn)的要求。


圖1.實(shí)施例1所得微囊化BCC-APA微囊顯微鏡圖。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合實(shí)施例和附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但本發(fā)明不受 這些具體實(shí)施例的限制。 各實(shí)施例中所用原料和設(shè)備均為市售商品。其中海藻酸鈉為Sigma公司銷售，規(guī) 格為中粘度，配制的海藻酸鈉溶液用0. 22iim微孔濾膜加壓過濾。泊洛沙姆、吐溫、人血白 蛋白、牛血白蛋白、曲拉通或十二烷基硫酸鈉均購自中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司。所使 用的微囊制備儀器選自Inotech公司的產(chǎn)品，型號為Inotech IE-50R。
本發(fā)明提供制備含有高密度細(xì)胞的海藻酸鈉微囊及改善囊形的方法，采用振動噴 嘴法，取代傳統(tǒng)的高壓靜電液滴法，提高生產(chǎn)效率，滿足微囊化細(xì)胞的中試和大量制備的要 求，并且采取相應(yīng)的措施，解決目前高壓靜電液滴法制備海藻酸鈉微囊存在的細(xì)胞密度低， 微囊粘連，囊形差的缺點(diǎn)。 本方法的關(guān)鍵步驟如下(l)在上述微囊化工藝的細(xì)胞與海藻酸鈉混合階段，采
用較高濃度的海藻酸鈉；(2)在微囊化工藝成球階段，在CaCl2溶液中加入一定濃度吐溫
(0. 5 5%)、曲拉通(0. 5 5%)、泊洛沙姆(0. 1 5%)、牛血白蛋白(BSA，O. 1 5%)、
人血白蛋白(HAS，O. 1 5%)等水溶性表面活性劑，其余微囊的具體操作同常見文獻(xiàn)所述，
即得到包裹細(xì)胞密度高、囊形圓整、粒徑分布集中，細(xì)胞活性穩(wěn)定的APA微囊。 實(shí)施例1 : (1)海藻酸鈉溶液的制備 稱取海藻酸鈉20g，溶于100ml滅菌生理鹽水中，O. 22 P m微孔濾膜無菌過濾，即得 2%海藻酸鈉溶液。
(2)細(xì)胞與海藻酸鈉溶液混合
將細(xì)胞總數(shù)為5X 107個(gè)牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞(BCC)與10ml濃度為2%海藻酸 鈉溶液，用攪拌法將其制成混懸液。
(3)制備海藻酸鈣微球 采用Inotech IE-50R Enc即sulator微囊儀器，用振動噴嘴法(Vibrating jetbreakup)，通過調(diào)節(jié)噴嘴大小，控制流速、振動頻率等工藝參數(shù)，將混懸液噴至300ml 濃度為100mmol/L含有0.5X泊洛沙姆(F68)CaCl2溶液中，靜置10min后獲得直徑在 200-400 m范圍內(nèi)的海藻酸鈣微球沉淀，待沉淀完全后抽去上清液。
(4)包覆聚賴氨酸 將海藻酸鈣微球加入到100ml濃度為0. 05%的聚賴氨酸溶液中，混合均勻，在室 溫下放置5-10min，待沉淀完全后抽去上清液。
(5)包覆海藻酸鈉 將沉淀物加入到200ml濃度為0. 2%海藻酸鈉溶液中(2%海藻酸鈉溶液，用滅菌 生理鹽水稀釋IO倍，即得)，混合均勻，在室溫下放置10min，待沉淀完全后除去抽去上清 液。 (6)液化微囊 將沉淀物加入到200ml濃度為55mmol/L的檸檬酸鈉溶液中，室溫下放置10min，待 沉淀完全后除去上清液，即獲得載有BCC的APA微囊。 本實(shí)施例所制備微囊的顯微照片見附圖1。經(jīng)顯微鏡觀察、計(jì)數(shù)，微囊的平均粒徑 為300 m，每個(gè)微囊中細(xì)胞的數(shù)量為80 100個(gè)，微囊中細(xì)胞包封密度有了很大的提高。
由圖l可以看出微囊囊形圓整，微囊粒徑大小均勻，沒有粘連現(xiàn)象發(fā)生。 實(shí)施例2 : (1)海藻酸鈉溶液的制備 稱取海藻酸鈉22g，溶于100ml滅菌生理鹽水中，O. 22 P m微孔濾膜無菌過濾，即得
2. 2%海藻酸鈉溶液。
(2)細(xì)胞與海藻酸鈉溶液混合 將細(xì)胞總數(shù)為10X 107個(gè)牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞(BCC)與10ml濃度為2. 2%海藻 酸鈉溶液，用攪拌法將其制成混懸液。
(3)制備海藻酸*丐微球 Inotech IE-50R Enc即sulator微囊儀器，用振動噴嘴法(Vibrating jet breakup)，通過調(diào)節(jié)噴嘴大小，控制流速、振動頻率等工藝參數(shù)，將混懸液噴至300ml濃 度為10Ommol/L的含有0. 2 % HSA (注射用)0^12溶液中，靜置lOmin后獲得直徑在 200-400 m范圍內(nèi)的海藻酸鈣微球沉淀，待沉淀完全后抽去上清液。 [OO43] (4)包覆聚賴氨酸 將海藻酸鈣微球加入到100ml濃度為0. 05%的聚賴氨酸溶液中，混合均勻，在室 溫下放置5-10min，待沉淀完全后抽去上清液。
(5)包覆海藻酸鈉 將沉淀物加入到200ml濃度為0. 2%海藻酸鈉溶液中(2%海藻酸鈉溶液，用滅菌 生理鹽水稀釋IO倍，即得)，混合均勻，在室溫下放置10min，待沉淀完全后除去抽去上清 液。
6
(6)液化微囊 將沉淀物加入到200ml濃度為55mmol/L的檸檬酸鈉溶液中，室溫下放置10min，待 沉淀完全后除去上清液，即獲得載有BCC的APA微囊。 經(jīng)顯微鏡觀察、計(jì)數(shù)，微囊的平均粒徑為300 ii m ，每個(gè)微囊中細(xì)胞的數(shù)量為 160-200個(gè)，微囊囊形圓整，粒徑分布范圍窄。 實(shí)施例3 :各步驟等同于實(shí)施例1或2，但與其不同的是，步驟(1)海藻酸鈉溶液的 制備中所獲得的海藻酸鈉溶液濃度為3%。 實(shí)施例4 :各步驟等同于實(shí)施例l或2，但與其不同的是，步驟(1)海藻酸鈉溶液的 制備中所獲得的海藻酸鈉溶液濃度為1. 5%。 實(shí)施例5 :各步驟等同于實(shí)施例1或2，但與其不同的是，步驟(3)制備海藻酸鈣微 球中是"將混懸液噴至300ml濃度為100mmol/L的含有0. 5% HSA(注射用)CaCl2溶液中"。
實(shí)施例6 :各步驟等同于實(shí)施例1或2，但與其不同的是，步驟(3)制備海藻酸鈣微 球中是"將混懸液噴至300ml濃度為100mmol/L的含有1% HSA(注射用)CaCl2溶液中"。
實(shí)施例7 :各步驟等同于實(shí)施例1或2，但與其不同的是，步驟(3)制備海藻酸鈣微 球中是"將混懸液噴至300ml濃度為100mmol/L的含有0. 1 %的吐溫80 (注射用)的CaCl2 溶液中"。 實(shí)施例8 :各步驟等同于實(shí)施例1或2，但與其不同的是，步驟(3)制備海藻酸鈣微 球中是"將混懸液噴至300ml濃度為100mmol/L的含有0. 5%的吐溫80 (注射用)的CaCl2 溶液中"。 實(shí)施例9 :各步驟等同于實(shí)施例1或2，但與其不同的是，步驟(3)制備海藻酸鈣微 球中是"將混懸液噴至300ml濃度為100mmol/L的含有0. 5%的泊洛沙姆188(注射用)的 CaC^溶液中"。 實(shí)施例10 :各步驟等同于實(shí)施例1或2，但與其不同的是，步驟(3)制備海藻酸鈣 微球中是"將混懸液噴至300ml濃度為100mmol/L的含有1%的泊洛沙姆188(注射用)的 CaC^溶液中"。 實(shí)施例11 :各步驟等同于實(shí)施例1或2，但與其不同的是，步驟(3)制備海藻酸鈣 微球時(shí)在微囊的固化溶液(CaCl2溶液)中加入的表面活性劑為曲拉通(Triton X100)，其 用量是1.5g，濃度為0.5%。 實(shí)施例12 :各步驟等同于實(shí)施例1或2，但與其不同的是，步驟(3)制備海藻酸鈣 微球時(shí)在微囊的固化溶液(CaC^溶液)中加入的表面活性劑為十二烷基硫酸鈉，其用量是 1.5g，濃度為0. 5%。
權(quán)利要求
工業(yè)化制備載高密度細(xì)胞的海藻酸鈉微囊的方法，是一種采用振動噴嘴法，以海藻酸鈉-聚賴氨酸或殼聚糖-海藻酸鈉為復(fù)合包裹材料，制備海藻酸鈉微囊，包裹細(xì)胞的方法，其特征在于，提高海藻酸鈉微囊制備過程中海藻酸鈉的濃度至1.5～5％，在微囊的固化溶液中加入表面活性劑，用以提高海藻酸鈉微囊中細(xì)胞包裹密度、改善微囊形狀和粒徑分布。
2. 權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，海藻酸鈉微囊制備過程中海藻酸鈉的濃度為 1. 5 3%。
3. 權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述表面活性劑為泊洛沙姆、吐溫、人血白蛋 白、牛血白蛋白、曲拉通或十二烷基硫酸鈉。
4. 權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述表面活性劑為吐溫80、泊洛沙姆188或人 血白蛋白。
5. 權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述表面活性劑的濃度分別為吐溫80 : 0. 05 5%，泊洛沙姆188 :0. 1 5%，人血白蛋白0. 1 5%。
6. 權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述表面活性劑的濃度分別為吐溫80 :[0. 1 0. 5%，泊洛沙姆188 :0. 5 1%，人血白蛋白0. 5 1%。
全文摘要
本發(fā)明公開了工業(yè)化制備載高密度細(xì)胞的海藻酸鈉微囊的方法，是一種采用采用振動噴嘴法，以海藻酸鈉-聚賴氨酸或殼聚糖-海藻酸鈉為復(fù)合包裹材料，制備海藻酸鈉微囊，包裹細(xì)胞的方法，其創(chuàng)新之處在于，且提高海藻酸鈉微囊制備過程中海藻酸鈉的濃度至1.5～5％，在微囊的固化溶液中加入表面活性劑，用以提高海藻酸鈉微囊中細(xì)胞包裹密度、改善微囊形狀和粒徑分布。該方法可顯著提高海藻酸鈉微囊中細(xì)胞的密度，改善微囊的囊形，微囊粒徑分布均勻，提高生產(chǎn)效率，以滿足微囊工業(yè)化生產(chǎn)的要求。
文檔編號A61K47/36GK101721390SQ20091023031
公開日2010年6月9日 申請日期2009年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月10日
發(fā)明者劉善奎, 張愛兵, 景穎, 王海龍, 龔非 申請人:濟(jì)南大學(xué)