基于微藻油脂特征峰的氮脅迫隨時間變化的監(jiān)測方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及微藻生長環(huán)境監(jiān)測技術領域，尤其涉及一種基于微藻油脂特征峰的氮脅迫隨時間變化的監(jiān)測方法。
【背景技術】
[0002]微藻是一類可以將二氧化碳轉(zhuǎn)化為潛在的生物燃料、食品、飼料和高價值的生物活性分子并能進行光合作用的真核微生物。微藻具有生態(tài)和生物學價值，是一種重要的生物質(zhì)資源。
[0003]小球藻是一類單細胞綠藻，屬于綠藻門、綠藻綱(Chlorophyceae)、綠球藻目、軟囊藻科、小球藻屬，廣泛分布于自然界，淡水水域中種類最多。目前全球范圍已知的小球藻有15種左右，并且有多達百種以上的變種。小球藻細胞形狀一般為球形或者橢球形，直徑2-12 μπι。已有研宄表明，小球藻含豐富的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、多糖、食用纖維、維生素、微量元素和活性代謝產(chǎn)物。近年來，我國已開始重視小球藻的開發(fā)利用。綜上所述，小球藻具有重要的經(jīng)濟和科研價值，具有廣闊的應用前景。
[0004]拉曼光譜是一種散射光譜，是研宄分子振動的一種光譜方法，它的原理和機制與紅外光譜不同，紅外光譜對極性基團有很強的檢出能力，而非極性基團如C = c、c-c等則具有很強的拉曼活性。但它們提供的結構信息是類似的，都是關于分子內(nèi)部各種分子振動頻率及有關振動能級的情況，所以能從分子水平上反映樣品化學組成和分子結構上的差異，實現(xiàn)分子中某些化學鍵和官能團的“指紋鑒別”。另外水的拉曼散射很微弱幾乎不產(chǎn)生干擾信號，使得拉曼在研宄水溶液中的活體生物的無損檢測上具有其他分子光譜無法比擬的優(yōu)勢。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了一種基于微藻油脂特征峰的氮脅迫隨時間變化的監(jiān)測方法，解決了現(xiàn)有檢測方法需要對樣本進行染色或復雜的化學處理，操作相對繁瑣、耗時、耗力的問題。通過對采集到的拉曼信號進行預處理克服了拉曼光譜強度值容易受微藻不同生長階段、不同曝光時間以及色素隨時間推移產(chǎn)生分解等的影響。
[0006]一種基于微藻油脂特征峰的氮脅迫隨時間變化的監(jiān)測方法，包括以下步驟:
[0007](I)采用拉曼光譜儀，獲取蛋白核小球藻樣本在同一氮營養(yǎng)環(huán)境下不同時期的拉曼光譜原始信息；
[0008](2)對步驟(I)中獲得的拉曼光譜原始信息進行預處理得到預處理譜圖，提取譜圖中多個微藻特征峰對應的拉曼強度值；
[0009](3)以步驟(2)中的拉曼強度值作為輸入，同一氮營養(yǎng)環(huán)境的不同時期作為輸出，建立基于多元回歸算法的判別模型；
[0010](4)取待監(jiān)測活體藻液，通過步驟⑴和步驟(2)的處理獲得該待監(jiān)測活體藻液的特征峰處的拉曼強度值并輸入所述的判別模型，獲得待監(jiān)測藻液氮脅迫隨時間變化的結果O
[0011]在本發(fā)明中，拉曼光譜儀具體選用雷尼紹顯微共焦拉曼光譜儀，在對樣品進行信息采集時，都是在恒溫(約25°c )條件下進行的。
[0012]在步驟(I)中，將制好的藻液滴于載玻片上，用蓋玻片壓平整(避免產(chǎn)生氣泡)，然后固定在顯微拉曼光譜儀物鏡下方載物臺上，利用激光強度為Imv的激光束，并通過50X的物鏡聚焦到樣本的表面，曝光時間ls，得到所述的拉曼光譜原始信息。同時，考慮到分類對象是活體微藻，由于活體微藻樣本在采集時容易出現(xiàn)樣本漂移或者是采樣點容易移動等問題，需對載玻片上的藻液采用瓊脂進行固定。
[0013]在步驟(2)中，所述的預處理為依次進行的平滑處理、基線校正和歸一化處理。
[0014]由于原始拉曼受熒光干擾較大，熒光的產(chǎn)生會覆蓋拉曼的信號，因此首先采用平滑和基線校正的方法去除熒光的干擾，凸顯信號，且平滑和基線校正處理均基于拉曼光譜儀附帶的軟件WIRE3.3。歸一化處理，主要是為了消除微藻不同生長階段、不同曝光時間以及色素隨時間推移產(chǎn)生分解等的影響，采用軟件unscrambler 9.7實現(xiàn)。
[0015]在所述的步驟(3)中，所述多元回歸算法為偏最小二乘回歸法算法、主成分回歸算法、逐步回歸算法、人工神經(jīng)網(wǎng)絡算法、支持向量機算法或LDA模型，優(yōu)選的多元回歸算法為LDA模型。LDA鑒別分析的基本思想是將高維的模式樣本投影到最佳鑒別矢量空間，以達到抽取分類信息和壓縮特征空間維數(shù)的效果，投影后保證模式樣本在新的子空間有最大的類間距離和最小的類內(nèi)距離，即模式在該空間中有最佳的可分離性。因此，它是一種有效的特征抽取方法。
[0016]本發(fā)明中，所述的活體藻液樣本為蛋白核小球藻。由于該藻種油脂含量較高，容易受環(huán)境氮的影響積累一定的油脂成分，同時藻的個體大小適合在顯微拉曼下進行觀察。
[0017]在所述的步驟(3)中，所述的微藻特征峰指的是1440011'OOlcnT1和I^OcnT1處的油脂峰。
[0018]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果為:
[0019]本發(fā)明實現(xiàn)了基于微藻油脂特征峰的氮脅迫隨時間變化的監(jiān)測方法，不需要配制任何溶液以及化學測定，大大簡化了操作步驟，縮短了檢測時間，也避免了由于操作人員操作不熟練或者主觀因素帶來的測量結果不準確等后果。通過對拉曼信號進行歸一化處理克服了拉曼光譜強度值容易受微藻不同生長階段、不同曝光時間以及色素隨時間推移產(chǎn)生分解等的影響。
【附圖說明】
[0020]圖1為蛋白核小球藻樣本在氮脅迫下不同時期的原始拉曼譜圖。
[0021]圖2為蛋白核小球藻樣本預處理后在氮脅迫下不同時期的拉曼譜圖。
【具體實施方式】
[0022]下面結合具體實施例進一步闡釋本發(fā)明。
[0023]取氮脅迫下的蛋白核小球藻樣本，采用雷尼紹顯微共焦拉曼光譜儀(inVia-Reflex 532/XYZ)，獲取活體藻液樣本的拉曼光譜原始信息。即將制好的藻液滴于載玻片上，用蓋玻片壓平整(避免產(chǎn)生氣泡)，并對藻液采用瓊脂進行固定，然后固定在顯微拉曼光譜儀物鏡下方載物臺上。其中曝光時間設置為ls，激光強度為lmv，累計次數(shù)一次。整個實驗過程都是在恒溫(約25°C )條件下進行的。采用上述的方法分別采集氮脅迫下(I天，4天，7天)蛋白核小球藻樣本的原始拉曼譜線，如圖1所示。
[0024]由于原始拉曼光譜圖受熒光干擾較大，熒光的產(chǎn)生會覆蓋拉曼的信號，因此首先采用平滑和基線校正的方法去除熒光的干擾，凸顯信號。這兩種預處理的過程都是在軟件WIRE3.3中實現(xiàn)的，然后采用歸一化處理以克服拉曼光譜強度值容易受微藻不同生長階段、不同曝光時間以及色素隨時間推移產(chǎn)生分解等的影響，通過軟件unscrambler 9.7實現(xiàn)。圖2為蛋白核小球藻樣本經(jīng)預處理以后的拉曼譜圖。
[0025]線性判別分析(LDA)是一種監(jiān)督子空間學習技術，是特征提取和分類的傳統(tǒng)統(tǒng)計工具，現(xiàn)已廣泛應用于計算機視覺，模式識別和機器學習。LDA尋求一種線性變換，使得在變換后類間和類內(nèi)協(xié)方差最大化，并通過最大化類間距離和最小化類內(nèi)找到判別變換(矩陣)距離。本專利采集氮脅迫下不同時期蛋白核小球藻的拉曼光譜，通過提取油脂特征峰對應的拉曼強度值作為輸入，結合LDA建立氮脅迫隨時間變化的判別模型。
[0026]對60個藻液樣本進行上述預處理，然后采用LDA建立不同時期的判別模型，其中將氮脅迫后第I天，第4天和第7天分別標定為和“3”。隨機選取上述不同時期各45個樣本用于建模，15個樣本用于預測。對預處理后的拉曼光譜提取其在1440CHT1、1301CHT1和1270CHT1處的油脂峰對應的拉曼強度值，將它們作為輸入變量，需要判定的生長時期作為輸出，得到模型的判別率為100 %。
[0027]不同時期各5個預測樣本，針對每個預測樣本，采用雷尼紹顯微共焦拉曼光譜儀獲取各個樣本的拉曼光譜原始信息，并對拉曼光譜原始信息依次進行平滑處理、基線校正和歸一化處理，得到對應的預處理譜圖，然后提取144001^1301(^1和1270cm ―1油脂峰處的拉曼強度值，將其輸入LDA模型，獲得預測樣本的精度為100%。
【主權項】
1.一種基于微藻油脂特征峰的氮脅迫隨時間變化的監(jiān)測方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)采用拉曼光譜儀，獲取蛋白核小球藻樣本在同一氮營養(yǎng)環(huán)境下不同時期的拉曼光譜原始信息； (2)對步驟(I)中獲得的拉曼光譜原始信息進行預處理得到預處理譜圖，提取譜圖中多個微藻特征峰對應的拉曼強度值； (3)以步驟(2)中的拉曼強度值作為輸入，同一氮營養(yǎng)環(huán)境的不同時期作為輸出，建立基于多元回歸算法的判別模型； (4)取待監(jiān)測活體藻液，通過步驟(I)和步驟(2)的處理獲得該待監(jiān)測活體藻液的特征峰處的拉曼強度值并輸入所述的判別模型，獲得待監(jiān)測藻液氮脅迫隨時間變化的結果。
2.如權利要求1所述的基于微藻油脂特征峰的氮脅迫隨時間變化的監(jiān)測方法，其特征在于，在步驟(I)中，將制好的藻液滴于載玻片上，用蓋玻片壓平整，然后固定在顯微拉曼光譜儀物鏡下方載物臺上，利用激光強度為Imv的激光束，并通過50X的物鏡聚焦到樣本的表面，曝光時間ls，得到所述的拉曼光譜原始信息。
3.如權利要求2所述的基于微藻油脂特征峰的氮脅迫隨時間變化的監(jiān)測方法，其特征在于，對載玻片上的藻液采用瓊脂進行固定。
4.如權利要求1所述的基于微藻油脂特征峰的氮脅迫隨時間變化的監(jiān)測方法，其特征在于，在步驟(2)中，所述的預處理為依次進行的平滑處理、基線校正和歸一化處理。
5.如權利要求1所述的基于微藻油脂特征峰的氮脅迫隨時間變化的監(jiān)測方法，其特征在于，所述步驟(3)中，所述多元回歸算法為偏最小二乘回歸法算法、主成分回歸算法、逐步回歸算法、人工神經(jīng)網(wǎng)絡算法、支持向量機算法或LDA模型。
6.如權利要求5所述的基于微藻油脂特征峰的氮脅迫隨時間變化的監(jiān)測方法，其特征在于，所述的多元回歸算法采用LDA模型。
7.如權利要求1所述的基于微藻油脂特征峰的氮脅迫隨時間變化的監(jiān)測方法，其特征在于，所述的活體藻液樣本為蛋白核小球藻。
8.如權利要求7所述的基于微藻油脂特征峰的氮脅迫隨時間變化的監(jiān)測方法，其特征在于，在步驟(2)中，所述的微藻特征峰指的是1440011'OOlcnT1和1270cm ―1處的油脂峰。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種微藻油脂特征峰的氮脅迫隨時間變化的監(jiān)測方法，步驟包括：(1)采用拉曼光譜儀，獲取蛋白核小球藻樣本在同一氮營養(yǎng)環(huán)境下不同時期的拉曼光譜原始信息；(2)對獲得的拉曼光譜原始信息進行預處理得到預處理譜圖，提取譜圖中多個微藻特征峰對應的拉曼強度值；(3)以拉曼強度值作為輸入，同一氮營養(yǎng)環(huán)境的不同時期作為輸出，建立基于多元回歸算法的判別模型；(4)取待監(jiān)測活體藻液，通過步驟(1)和步驟(2)的處理獲得對應的拉曼強度值并輸入所述的判別模型，獲得待監(jiān)測藻液氮脅迫隨時間變化的結果。本發(fā)明解決了現(xiàn)有檢測方法需要對樣本進行染色或復雜的化學處理，操作相對繁瑣、耗時、耗力的問題。
【IPC分類】G01N21-65
【公開號】CN104634771
【申請?zhí)枴緾N201510043140
【發(fā)明人】邵詠妮, 蔣林軍, 潘健, 何勇
【申請人】浙江大學
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2015年1月28日